人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控

目的探讨人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控。方法通过Polysome profiling结合Western blot实验检测并验证HEK293细胞中mRNA的翻译活性;通过针对RPL10A和RPS17两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀、建库测序(RIP-seq)及生物信息学分析,获得参与HEK293细胞蛋白质合成调控的相关分子。结果在两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀实验富集的分子中共有129种基因,其中93.8%为蛋白质编码基因;且功能与RNA剪接、分解代谢、MAPK信号通路、染色体定位、RNA转运等相关。结论通过针对核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀可以获得HEK293细胞中活跃翻译的mRNA。

表达肾癌G250基因和hGM-CSF基因HEK293细胞系的建立

目的建立稳定表达肾癌G250基因与基因佐剂hGM-CSF基因编码蛋白的的HEK293细胞系。方法通过脂质体转染的方法,将表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的双顺反子pIG250-GM真核表达质粒导入HEK293细胞中;经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系;用免疫组化、ELISA和Western Blot方法,检测目的蛋白在HEK293细胞中的表达。结果经600 μg / mL的G418压力筛选后,获得了抗性细胞克隆;免疫组织化学方法检测到表达G250的阳性细胞;ELISA方法检测到pIG250-GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达与空载体对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);Western Blotting方法检测到G250蛋白的表达,分子量约54Ku,与预期大小相符。结论成功建立可稳定表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的HEK293细胞系,为研究防治肾癌疫苗的免疫应答机制提供了实验基础。

千金子制霜前后提取物对人胚肾细胞HEK293的体外毒性作用

目的:比较千金子制霜前后提取物对正常人胚肾细胞HEK293的影响,探究千金子制霜减毒的作用机制。方法:采用HEK293细胞为体外模型,随机分为对照组,千金子生品低、中、高质量浓度(100、200、400μg·mL^(-1))组和千金子霜品低、中、高质量浓度(100、200、400μg·mL^(-1))组。细胞体外培养后,分别给予等体积的无血清培养液和千金子生品、霜品提取物溶液,各组均设置3个复孔。采用CCK-8法评价细胞存活率,利用倒置显微镜观察细胞数量及形态变化;碘化丙啶(PI)染色法和AnnexinV-FITC/PI双重染色法检测细胞周期和凋亡情况;试剂盒法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽(GSH)、肌酐(Cr)和细胞裂解液中尿素氮(BUN)水平。结果:与对照组比较,千金子生品各质量浓度组HEK293细胞存活率降低,细胞形态异常,细胞数量减少,G_(0)/G_(1) 、 G_(1)/G_(2)期细胞比例明显降低,S期细胞比例明显增加,细胞凋亡率升高(P<0.01),LDH、BUN、Cr水平升高(P<0.05,P<0.01),GSH水平降低(P<0.01);与千金子生品组比较,千金子霜品相应质量浓度可显著增加HEK293细胞存活率(P<0.01),改善细胞形态,增加G_(0)/G_(1) 期、 G_(1)/G_(2)期细胞比例,降低S期细胞比例,同时能明显降低LDH、BUN、Cr水平(P<0.05,P<0.01),提高GSH水平(P<0.01)。结论:千金子制霜后可能通过减轻细胞周期阻滞和细胞氧化损伤改善肾细胞功能、减少细胞凋亡,从而降低体外肾毒性。

基因治疗原发性高血压的新途径:内皮型一氧化氮合成酶CDNA腺病毒载体在人胎肾293细胞的表达

研究内皮型一氧化氮合成酶（endothelialnitric oxide synthase,eNOS)CDNA 腺病毒载体 PadRSVeNOSCDNA 导入在人胎肾 293细胞 ( )中的表达。方法:大量制备及纯化质粒 eNOSCDNA ,将纯化eNOSCDNA 载体通过脂质体转染 293细胞48h 后,应用化学比色法测定293细胞提取物NOS 活性。结果:被转染 293细胞 NOS活性显著提高于未转染293细胞 NOS 活性犤( 0.62±0.03),(0.093±0.01)kU /L,P <0.001犦。结论:PA dRSVeNOSCDNA 导入人胎肾 293细胞是一种能使 NOS 活性显著升高的方法,为基因治疗原发性高血压及肾脏血管性疾病研究提供一条新的途径。

抗炎药物对HEK293细胞NF-κB活化的调节作用

目的 探讨不同作用机制的抗炎药物对内源性和TNFα诱导的NF -κB的调节作用。方法 利用荧光素酶报告基因测定法检测细胞内NF-κB活化水平,MTT法测定细胞增殖,PI染色流式细胞仪测定细胞凋亡。结果一定浓度的美洛昔康和地塞米松能够明显降低HEK293细胞内源性和10ng·mL-1 TNFα诱导的NF -κB活化, 1×10-9 mol·L-1氢化考的松分别明显增加和降低这两种活化,而吲哚美辛对内源性活化无明显影响。4种药物对HEK293细胞增殖均无明显作用。地塞米松单独或联合TNFα、吲哚美辛联合TNFα能够引起细胞凋亡。结论 不同类型的抗炎药物对内源性和TNFα诱导的NF -κB活化影响不同。提示NF -κB活化调节可能成为药物作用机理研究的有效靶点之一。

脂质体介导hHCN2基因转染HEK293细胞

目的建立一种研究离子通道的有效模型。方法采用Lipofacta mine2000脂质体将人的超极化激活的环核苷酸门控(HCN)基因转染人胚胎肾(HEK)293细胞,利用全细胞膜片钳技术检测克隆人HCN2基因的表达。结果pcDNA3-hHCN2真核表达载体转染HEK293细胞3d后,全细胞膜片钳技术记录到克隆人HCN2基因编码的通道电流。结论全细胞膜片钳技术稳定、可靠,可为开展克隆离子通道结构和功能关系研究提供基础。

人CD7 cDNA在HEK293细胞中的表达

目的建立表达人白细胞分化抗原 CD7蛋白的哺乳动物细胞模型 ,为深入研究 CD7的功能奠定基础。方法采用 PCR方法扩增 CD7c DNA,将目的片段定向克隆于真核表达载体 pc DNA3 ,限制性内切酶酶切分析重组质粒并进行序列测定 ;通过电穿孔法将重组真核表达载体 pc DNA 3 / CD7转染于人胚肾 2 93细胞 ( HEK2 93 ) ,经 G4 18筛选得到抗性克隆 ;利用FCM检测 CD7分子在 HEK2 93细胞的表达。结果得到了含 CD7全长 c DNA的重组真核表达载体 pc DNA3 / CD7。FCM分析表明 :转染了 pc DNA3 / CD7的 HEK2 93细胞表达人 CD7蛋白。结论为深入研究

早老素通过下调CDK4使HEK293T细胞周期阻滞

早老素(progerin)的累积导致儿童早老症(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)的发生,并与正常衰老相关。早老素能使细胞内稳态失衡但分子机制仍有待深入研究。本研究旨在探讨早老素导入人胚胎肾293T细胞(human embryo kidney 293T cell,HEK293T)后细胞增殖、周期变化的分子机制。形态学观察发现过表达早老素的HEK293T细胞密度下降,(57±2.47)%细胞核形态皱缩。细胞增殖和周期实验证明早老素使细胞增殖减慢,发生G1/S期阻滞,G1细胞从(42.3±1.31)%升至(47.2±1.26)%,而S期细胞从(43.1±1.36)%降至(38.5±1.42)%。Western印迹结果显示早老素的高表达引起p21蛋白表达上调(103.2±1.49)%,CDK4下调(63±1.52)%,而p53、ATM、Cyclin E1以及p16等蛋白质水平均不变;HEK293T细胞中早老素的过表达导致γ-H2AX水平下调(53±1.36)%,H2O2处理后变化趋势不变。我们的研究结果提示,早老素通过上调p21和下调CDK4使细胞发生周期阻滞,不能增加HEK293T细胞的损伤及衰老。

用肝肾共培养体系研究细胞毒性的方法学考察

目的建立肝肾共培养体系,并证明此体系的合理性与可行性方法采用MTT法比较川楝素(20、40、80、160μg/mL)、葛根素(200、100、50、25μg/mL)、苦参碱(5、2.5、1.25、0.625 mg/mL)、汉防己乙素(50、25、12.5、6.25 mg/mL)在肝肾单独培养和共培养体系中对肝、肾细胞活力的影响。结果 2种体系中:川楝素仅对肝细胞的活力有抑制作用,葛根素对肝肾细胞均无抑制作用,苦参碱对肝细胞活力的抑制程度大于肾细胞,汉防己乙素对肾细胞活力的抑制程度大于肝细胞。结论用肝肾细胞共培养体系与单独培养体系进行实验得出的结果一致,这2种体系均可用于药物对细胞的毒性研究,其中共培养体系能更好地反映药物对靶器官的选择性。

葡萄籽原花青素对顺铂诱导人胚肾细胞凋亡的拮抗作用

目的:探讨葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin,GSPE)对顺铂(cisdiamminedichloroplatinum,CDDP)诱导人胚肾细胞HEK293凋亡及相关凋亡基因的影响,并探讨可能的机制。方法:体外培养正常HEK293细胞,噻唑蓝法测定GSPE、CDD P分别对HEK293细胞生长的影响以及GSPE对CDDP诱导HEK293细胞毒性的保护作用,流式细胞仪测定GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡率的变化,Western blotting测定GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。结果:GSPE对CDDP所致HEK293细胞毒性具有拮抗作用,可减轻CDDP所致HEK293细胞凋亡,减弱Bax表达、增强Bcl-2表达。结论:GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡具有拮抗作用,其机制可能与GSPE降低促凋亡基因Bax,升高抗凋亡基因Bcl-2的表达有关。

构建hTNF-α/293基因细胞对人结肠癌细胞增殖影响的实验研究

目的通过体外实验研究观察稳定转染hTNF-α/293基因细胞对人结肠癌(LOVO)细胞生长增殖影响。方法采用RT-PCR和ELISA检测稳定转染hTNF-α/293基因细胞和Hek-293细胞mRNA和蛋白表达水平。观察体外培养中,hTNF-α/293基因细胞与LOVO细胞共同培养,于不同的时间点,采用噻唑蓝MTT法检测LOVO肿瘤细胞增殖的活性。结果重组质粒转染Hek-293细胞后,Western blot检测到了hTNFα蛋白体外表达,检测表明hTNFα/293细胞组和hTNFα阳性组对共培养的LOVO细胞的增殖具有明显的抑制作用,且具有良好的量效关系。结论提示稳定转染hTNF-α/293对LOVO细胞增殖有明显抑制效应,且呈现出良好的数量依赖关系。由于TNF-α/293基因细胞可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外。

体外培养APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞对结肠癌细胞增殖的影响

背景:积极探索结肠癌相关基因及抑癌基因已成为新的研究热点,人肿瘤坏死因子α是一个重要的促炎因子和免疫调节因子,对肿瘤的免疫治疗具有一定的疗效。目的:观察体外培养海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate,APA)微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞对结肠癌细胞增殖的影响。方法:采用前期建立的制备方法,用APA微囊分别包裹人肿瘤坏死因子α/293细胞,APA微囊化0/293细胞。取对数生长期结肠癌(Lovo)细胞,配制成所需浓度的细胞悬液,接种24孔板培养,分别加入低、中、高剂量稳定转染的APA微囊化肿瘤坏死因子α/293,即分为5个实验组,APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞低剂量组、中剂量组、高剂量组、阴性组为APA微囊化0/293细胞组,阳性组加入肿瘤坏死因子α,MTT法检测490nm吸光度;通过对人肿瘤细胞增殖抑制实验,观察对结肠癌细胞(Lovo)增殖的抑制作用。结果与结论:体外培养中,加入APA微囊化0/293细胞组对结肠癌细胞增殖无抑制作用;而APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞中、高剂量组和阳性组,在24,48,72h的A值低于APA微囊化0/293细胞组(P<0.05),提示APA微囊化人肿瘤坏死因子α/293细胞所分泌肿瘤坏死因子α对结肠癌细胞有增殖抑制效应,均呈现出良好的数量依赖关系。

低聚葡萄籽原花青素对顺铂所致人胚肾细胞线粒体损伤的保护作用

目的:探究低聚葡萄籽原花青素(oligomeric grape seed proanthocyanidins,O-GSP)对顺铂(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)导致的人胚肾细胞HEK293中线粒体损伤的保护作用及其作用机制。方法:通过试剂盒检测O-GSP、CDDP及O-GSP+CDDP处理后细胞中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、活性氧(reaction oxygen species,ROS)含量、细胞质内糖代谢酶(己糖激酶和乳酸脱氢酶)活力和线粒体糖代谢酶(苹果酸脱氢酶)活力变化情况,并采用流式细胞术对各组细胞ATP含量、线粒体膜电位变化以及细胞凋亡率进行检测。结果:O-GSP预处理极显著改善了CDDP引起的细胞内MDA含量升高,还原型GSH、ROS、ATP含量及线粒体膜电位降低和糖代谢异常(P<0.01),从而减轻了CDDP诱发的线粒体损伤,对HEK293细胞凋亡有极显著的缓解作用(P<0.01)。结论:O-GSP对CDDP所致HEK293细胞线粒体损伤具有拮抗作用,并且该作用与O-GSP的抗氧化活性有关。

构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体调控胚肾细胞增殖

背景:研究发现SMARCAL1在人类发育和成熟肾脏的多种细胞类型中选择性表达,表明其在肾脏发育过程中发挥着重要的功能作用。目的:探讨SMARCAL1过表达对于胚肾细胞增殖功能的影响。方法:取293T细胞和HEK293细胞的第3代细胞用于实验。选用pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO载体构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体,转染293T细胞包装慢病毒。实验分为3组:空白组为无处理的HEK293细胞;阴性对照组为转染空载病毒的HEK293细胞;SMARCAL1过表达组为转染SMARCAL1过表达病毒的HEK293细胞。对SMARCAL1过表达慢病毒转染后用嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞株。通过观察转染率来检测病毒滴度;荧光定量PCR和Western印迹法验证稳转细胞株;CCK-8和EdU染色法检测细胞增殖情况;进一步通过荧光定量PCR探讨对Wnt通路的影响。结果与结论:①SMARCAL1过表达质粒基因序列与目的基因一致,经慢病毒包装后测得SMARCAL1过表达慢病毒滴度为1×108 TU/mL,空载慢病毒滴度为3×108 TU/mL;②与空白组和阴性对照组比较,SMARCAL1过表达慢病毒转染后细胞中SMARCAL1 mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05),细胞增殖活力明显下降(P<0.05),Wnt通路中CTNNB1和WNT4基因表达水平降低(P<0.05);③实验结果表明,SMARCAL1过表达慢病毒载体构建成功并能够在细胞中顺利表达;SMARCAL1基因可能通过Wnt通信号通路参与调节胚肾细胞增殖,进而影响肾脏发育。

分泌人内皮抑素基因工程细胞系的建立

目的建立稳定的基因工程细胞系。方法将含有白细胞介素-2(IL-2)分泌肽的人endostatin全长cDNA插入真核表达载体pSNA2.0,产生重组质粒pSNA2.0/hEndostatin,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK293细胞中,G418筛选后得到阳性克隆hED/293,采用Western-blot检测转染细胞上清中endostatin蛋白的表达。结果hED/293细胞株培养上清中有endosta-tin蛋白的表达,分子量为20000。结论重组pSNA2.0/hEndostatin真核表达载体构建正确,转染HEK293细胞后可有效的表达人endostatin蛋白,并能分泌到细胞外。

MR评价酪氨酸酶基因在人胚胎肾293细胞表达的实验研究

目的 以酪氨酸酶基因作为报告基因转染人胚胎肾 (HEK) 2 93细胞 ,利用其合成大量黑色素而能被MRI检测的特性来反映基因表达的情况 ,以探索MRI评价体外细胞基因表达的方法。方法 以脂质体将含酪氨酸酶基因完全cDNA的pcDNA3tyr质粒转染到HEK2 93细胞 ,以MRT1W、T1W/SPIR(selectivepartialinversionrecovery)、T2 W序列扫描转染细胞 ,观察表达的黑色素的MR信号。应用Fontana染色和电子显微镜检测黑色素的合成 ,逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)检测酪氨酸酶基因的cDNA片段 ,以进一步验证酪氨酸酶基因的转染与表达。结果 (1)pcDNA3tyr质粒转染进入HEK2 93细胞并在其中表达生成黑色素 ,转染 5、10、2 0 μg质粒的 10 6个细胞内生成的黑色素能够被MRI检测到并在MRT1WI、T1WI/SPIR、T2 WI呈高信号 ,转染质粒量越大 ,MRI信号强度越高。 6 2 5× 10 4个转染有 2 0 μg质粒的HEK2 93细胞仍可检测到高信号。 (2 )Fontana染色法检测到HEK2 93细胞内的黑色素颗粒 ;(3)电子显微镜观察到在HEK2 93细胞胞质内有较多的黑色素颗粒及黑色素前体 ;(4 )采用RT PCR方法检测到转染的HEK2 93细胞含酪氨酸酶基因的cDNA片段。结论 MRI能够检测到HEK2 93细胞内由外源基因表达合成的黑色素 ,说明影像学与分子生物学技术结合可以?

乳酸脱氢酶基因调控对HEK-293细胞代谢和腺病毒生产的影响

减少乳酸积累一直是哺乳动物细胞生物技术产业的一个目标。体外培养动物细胞时,乳酸积累主要是2种代谢途径作用的综合结果:一方面,葡萄糖在乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)的作用下生成乳酸;另一方面,乳酸可通过乳酸脱氢酶B(LDHB)或乳酸脱氢酶C(LDHC)氧化为丙酮酸重新进入三羧酸循环。本研究综合评估了乳酸代谢关键基因调控对人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK-293)细胞生长、代谢和人腺病毒(human adenovirus,HAdV)生产的影响,有效提高了HEK-293细胞的HAdV生产能力,并为哺乳动物细胞的乳酸代谢工程调控提供了理论基础。通过改造乳酸代谢关键调控基因(敲除ldha基因以及过表达ldhb和ldhc基因),有效改善了HEK-293细胞的物质和能量代谢效率,显著提高了HAdV的生产。与对照细胞相比,3个基因改造均能促进细胞生长,降低乳酸和氨的积累,明显增强细胞的物质和能量代谢效率,显著提高了HEK-293细胞的HAdV生产能力。ldhc基因过表达对HEK-293细胞的生长、代谢和HAdV生产调控最显著,最大细胞密度提高了约38.7%,乳酸对葡萄糖得率和氨对谷氨酰胺得率分别下降了33.8%和63.3%,HAdV滴度提高了至少16倍。此外,相比于对照细胞株,改造细胞株的腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)生成速率、ATP/O_(2)比率、ATP与腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)的比值以及还原型辅酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)含量均有不同程度的提高,能量代谢效率明显改善。

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的:建立稳定的基因工程细胞系。方法:将含有人肿瘤坏死因子α(hTNFα)全长cDNA插入表达载体pSNAV2.0,产生重组质粒pSNAV2.0-TNFα,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中,G418筛选阳性克隆hTNF/293,采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达。结果:通过SalⅠ和EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证明:在质粒pSNAV2.0中插入片段正确。采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFα蛋白表达,分子量为17KDa。结论:成功构建重组质粒pSNAV2.0-TNFα,真核表达载体构建正确,转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外。

分泌肿瘤坏死因子的基因工程细胞对HepG2细胞的抑制作用

目的自行建立分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞,将其与肝癌细胞共培养,观察体外培养中分泌肿瘤坏死因子hTNF/293基因细胞表达的情况及对人肝癌细胞的抑制作用。方法 (1)建立可稳定分泌人肿瘤坏死因子α/293细胞;采用RT-PCR、Western blot、ELISA和流式细胞仪等技术检测人肿瘤坏死因子表达和分泌;(2)观察体外培养中分泌肿瘤坏死因子hTNF/293基因细胞对人肝癌细胞的抑制作用,于不同的时间点,用MTT法检测490 nm下的吸光度值。结果 RT-PCR、Western blot和ELISA等技术检测表明hTNFα/293细胞组和TNFα阳性组对共培养的HepG2细胞的增殖具有明显的抑制作用,且具有良好的量效关系。结论提示TNF-α/293基因细胞可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外;体外培养的人肿瘤坏死因子基因的工程细胞,所分泌肿瘤坏死因子α对人肝癌细胞增殖有明显抑制效应,且呈现出良好的数量依赖关系。

白头翁皂苷B4对实验性急性肾功能损伤的保护作用

目的:研究探讨白头翁皂苷B4对急性肾功能损伤的保护作用,以及对其进行小鼠急性毒性评价。方法:通过体外细胞实验,以LPS诱导人胚肾细胞HEK293损伤模型,用白头翁皂苷B4进行干预24、48 h,MTT法检测细胞活性及炎性因子的表达,观察白头翁皂苷B4对肾细胞损伤的作用。整体动物实验,分别以甘油、顺铂和脂多糖(LPS)造成大鼠或小鼠急性肾功能损伤,尾静脉注射不同剂量的白头翁皂苷B4,给药一定时间后行眼眶采血,分离血清,检测反映肾功能指标的尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)、总蛋白(TP)及尿液中蛋白含量,来观察白头翁皂苷B4对急性肾功能损伤的作用;给小鼠尾静脉注射不同剂量的白头翁皂苷B4,连续观察2周,根据死亡率计算半数致死量(LD50),初步评价白头翁皂苷B4的用药安全性。结果:白头翁皂苷B4能提高损伤的肾细胞活性,下调炎性因子TNF-α的表达。白头翁皂苷B4静脉给药对甘油,顺铂和LPS所导致的血清BUN,Cre升高均有明显的抑制作用,同时白头翁皂苷B4高剂量(2. 5 mg·kg-1)还可以明显降低甘油致急性肾损伤大鼠的尿蛋白浓度,其在大鼠有效剂量为1. 25～2. 5 mg·kg-1,小鼠有效剂量为5～10 mg·kg-1。白头翁皂苷B4对小鼠静脉给药的LD50为3. 36 g·kg-1,95%可信限为3. 34～3. 37 g·kg-1,根据小鼠最大给药剂量20 mg·kg-1,计算出其临床安全指数为168(3. 36/0. 02),具有较高的临床安全范围。结论:白头翁皂苷B4对于实验性急性动物肾功能损伤具有明确的保护作用,同时以其较大的临床安全指数提示该化合物具有较好的新药开发前景。