人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控

目的探讨人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控。方法通过Polysome profiling结合Western blot实验检测并验证HEK293细胞中mRNA的翻译活性;通过针对RPL10A和RPS17两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀、建库测序(RIP-seq)及生物信息学分析,获得参与HEK293细胞蛋白质合成调控的相关分子。结果在两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀实验富集的分子中共有129种基因,其中93.8%为蛋白质编码基因;且功能与RNA剪接、分解代谢、MAPK信号通路、染色体定位、RNA转运等相关。结论通过针对核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀可以获得HEK293细胞中活跃翻译的mRNA。

基因治疗原发性高血压的新途径:内皮型一氧化氮合成酶CDNA腺病毒载体在人胎肾293细胞的表达

研究内皮型一氧化氮合成酶（endothelialnitric oxide synthase,eNOS)CDNA 腺病毒载体 PadRSVeNOSCDNA 导入在人胎肾 293细胞 ( )中的表达。方法:大量制备及纯化质粒 eNOSCDNA ,将纯化eNOSCDNA 载体通过脂质体转染 293细胞48h 后,应用化学比色法测定293细胞提取物NOS 活性。结果:被转染 293细胞 NOS活性显著提高于未转染293细胞 NOS 活性犤( 0.62±0.03),(0.093±0.01)kU /L,P <0.001犦。结论:PA dRSVeNOSCDNA 导入人胎肾 293细胞是一种能使 NOS 活性显著升高的方法,为基因治疗原发性高血压及肾脏血管性疾病研究提供一条新的途径。

茶多酚和维生素C对人胚肾293细胞缺糖缺氧损伤保护作用的比较

目的从细胞水平研究茶多酚(TP)对人胚肾293细胞缺糖缺氧性损伤的保护作用,并与抗氧化剂维生素C(VC)进行比较。方法采用缺糖培养基并以连二亚硫酸钠消除培养基中的氧,诱导产生缺氧缺糖损伤模型,测定细胞的存活率、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及总抗氧化能力,并计算IC50。结果在细胞损伤模型中,TP和VC均表现出极强的抗氧化能力,TP能显著提高细胞的存活率、SOD活性和总抗氧化能力并抑制LDH的活性,TP的作用均大于VC。结论TP和VC体外具有强大的自由基清除作用,且呈现明显的剂量依赖性,TP在细胞损伤模型中的抗自由基作用均大于VC。

补肾阴对胚胎干细胞活动的影响

目的观察补肾阴中药复方对胚胎干细胞活动的影响。方法选用胚胎干细胞模型CRL-1825细胞株,加入补肾阴中药复方大鼠含药血清,观察补肾阴中药对干细胞分化、凋亡、细胞周期及其关键基因表达的影响。结果补肾阴中药复方含药血清可以抑制干细胞的分化和凋亡,促进干细胞增殖以及细胞周期的进程,促进干细胞Wnt、Oct4等基因的表达,下调P16INK4a基因的表达。结论补肾阴中药复方可以促进干细胞增殖、维持其不分化状态。

人胚胎肾间质成纤维细胞培养及其鉴定

目的:探讨人胚胎肾脏成纤维细胞培养方法。方法:利用人胚胎肾脏肾髓质进行培养,然后通过细胞形态学、超微结 构、免疫细胞化学等方法进行分析鉴定。结果:培养的细胞为长梭形、单核,超微结构为典型的成纤维细胞,并表达成纤维细胞 表面抗原、波形蛋白、结蛋白,不表达角蛋白。结论:成功地培养出人胚胎肾间质成纤维细胞。

再生基因4(REG4)真核表达载体的构建及其蛋白在HEK293T细胞中的表达、纯化

目的构建再生基因4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV)。方法根据NCBI数据库REG4基因序列进行基因优化、合成,将其克隆至pCDNA3.4载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pCDNA3.4-REG4质粒瞬时转染至HEK 293T细胞(实验组),同时以pEGFP-C1质粒作为转染对照组,未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组。荧光显微镜观察转染对照组转染效率,分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与免疫印迹试验(Western-Blot,WB)检测Reg IV蛋白表达水平。通过镍柱及丙烯葡聚糖凝胶S-400(Sephacryl S-400)柱进行蛋白纯化,SDS-PAGE及WB对纯化后重组蛋白进行鉴定。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pCDNA3.4-REG4构建成功。转染对照组(pEGFP-C1质粒)荧光显微镜观察结果显示转染效率约50%,表明转染成功。WB结果显示仅在实验组(pCDNA3.4-REG4质粒)的细胞中检测到RegIV蛋白。镍柱纯化时目的蛋白无法与镍柱填料有效结合,SephacrylS-400凝胶柱层析纯化获得了此重组蛋白。结论成功构建了REG4基因真核表达载体并在HEK 293T细胞中成功表达,为深入研究Reg IV蛋白的作用机理及开发潜在的抗癌靶向药物奠定了基础。

凝血酶诱导人胚胎肾系膜细胞增殖和PAI-1表达的研究

目的 :探讨凝血酶对人胚胎肾系膜细胞增殖和纤溶酶原激活物抑制物 1 (PAI 1 )表达的影响。方法 :采用噻唑蓝 (MTT)掺入法、Northern杂交和纤维蛋白平板法分别检测不同浓度凝血酶刺激下人胚胎肾小球系膜细胞增殖、PAI 1mRNA表达和PAI 1蛋白质活性的变化 ,并同时用人工水蛭素进行阻断实验。结果 :凝血酶呈浓度依赖性的方式促进人胚胎肾小球系膜细胞增殖、PAI 1mRNA表达和PAI 1蛋白质活性 ,水蛭素能特异地阻断凝血酶的作用。结论 :凝血酶可通过促进系膜细胞增殖、PAI

DEC2通过阻断TGF-β/ROCK1信号通路抑制小鼠肾小球内皮细胞转分化和肾纤维化

目的 基于分化型胚胎软骨发育基因2(DEC2)通过转化生长因子β/Rho相关激酶1(TGF-β/ROCK1)信号通路探讨对肾小球内皮细胞转分化的保护机制。方法 将小鼠随机分为假手术组、单侧输尿管梗阻(UUO)组、空载体处理的UUO组和过表达DEC2的UUO组,每组6只。除假手术组外,其余组建立UUO模型。空载体处理的UUO组和过表达DEC2的UUO组,于第0天(UUO后立即)在超声系统的引导下每侧肾脏注射10μL(108个嗜菌斑形成单位[PFU])空载体或DEC2载体。术后14 d处死小鼠,HE染色检测肾组织学病变情况、 Masson染色检测肾纤维化情况,Western blot法检测肾组织DEC2、 α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、 Rho相关激酶1(ROCK1)的蛋白表达。正常人肾小球内皮细胞(GEnC),采用ROCK1抑制剂Y-27632处理或转染DEC2, Western blot法检测暴露于TGF-β的GEnC中ROCK1、 α-SMA、 DEC2、 E-cadherin表达影响。通过免疫荧光细胞化学染色检测GEnC中ROCK1和DEC2定位,并通过免疫共沉淀实验验证二者的相互作用关系。结果 与假手术组相比,UUO组在第14天出现显著的肾纤维化和胶原蛋白积聚。在UUO组中,小鼠肾组织中DEC2和E-cadherin的表达显著降低,α-SMA的表达显著增加。与空载体处理的UUO组相比,过表达DEC2的UUO组小鼠肾纤维化和胶原蛋白积聚程度降低,并且小鼠肾组织中ROCK1、 α-SMA表达降低和DEC2、 E-cadherin表达增加。TGF-β以时间依赖性方式增强GEnC中ROCK1和α-SMA表达,并且DEC2、 E-cadherin水平降低。用ROCK1抑制剂Y-27632处理可部分消除TGF-β诱导的ROCK1、 α-SMA表达增加和DEC2、 E-cadherin表达降低。此外,在TGF-β刺激前,将GEnC转染DEC2降低细胞中ROCK1、 α-SMA表达,并增加DEC2、 E-cadherin表达。免疫荧光染色显示DEC2在GEnC中与ROCK1共定位,并且免疫共沉淀结果显示DEC2与ROCK1相互拉低。结论 DEC2在纤维化肾组织中下调,上调DEC2通过阻断TGF-β/ROCK1信号通路抑制GEnC的上皮肌纤维母细胞转分化及肾纤维化。

胚胎干细胞源性表皮干细胞在肾被囊微环境中分化潜能的研究

目的探讨胚胎干细胞源性表皮干细胞在肾被囊微环境中的分化情况,为研究其在不同微环境中的分化潜能和稳定性及寻找新的皮肤工程种子细胞奠定基础。方法129小鼠E14胚胎干细胞与人羊膜共培养4d,定向诱导其分化为呈β1整合素、CK15和CK19阳性的表皮样干细胞克隆,无菌手术下移植入129小鼠双侧肾被囊内,术后4周、6周和8周取材。对移植后细胞的分化情况进行形态学和CEA和CK18免疫组织化学观察。结果小鼠胚胎干细胞源性表皮干细胞在129小鼠肾被囊内4周,分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构,种植6周和8周,除上述结构外,可见角化复层扁平上皮、汗腺样、皮脂腺样及毛囊样等结构。免疫组化结果汗腺样结构呈CEA和CK18阳性。结论研究结果表明小鼠胚胎干细胞源性表皮干细胞在肾被囊微环境下,可具有分化为角化复层上皮、汗腺样、皮脂腺样及毛囊样结构的潜能。

肾透明细胞癌及胚胎肾中性糖脂表达的研究

目的 为了研究胚胎肾及肾癌中性糖脂的表达情况。方法 采用改良的 Hakomori的方法 ,提取了肾透明细胞癌及胚胎肾组织的中性糖脂 (neutral glycosphingolipids,N-GSL s) ,并进行了高效薄层层析。结果 胚胎肾 N- GSL s的表达随着胚胎的成熟而呈规律性的变化 ,肾癌 N- GSL s的表达存在着异质性 ,与胚胎期肾组织 N- GSL s表达相似 ,它们都不含有正常成人肾所具有的长糖链的红细胞糖苷脂(Globoside)。结论 中性糖脂参与了胚胎肾组织的成熟与分化过程 ,中性糖脂中长糖链红细胞糖苷脂与肾组织的恶变可能有关。

超声联合SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的研究

目的探讨超声协同微泡造影剂SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的方法。方法以不同的超声辐照时间、超声机械指数和不同浓度的微泡造影剂SonoVue的参数组合,将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人胚肾293T细胞,接种于6孔板中,以荧光显微镜观察观察293T细胞中的绿色荧光蛋白表达情况并用流式细胞仪测算转染率。结果当微泡造影剂SonoVue浓度为40%、超声机械指数为1.0、辐照时间5 min时,质粒的转染率最高(28.11±1.63)%。结论超声联合微泡造影剂SonoVue能够作为载体介导质粒转染细胞,但需优化各项超声辐照的条件以达到最佳效果。

后肾细胞微环境诱导胚胎干细胞向肾系细胞分化的实验研究

目的:探讨胚胎后肾细胞微环境诱导胚胎干细胞(ESCs)分化为肾系细胞的作用。方法:小鼠D3系胚胎干细胞通过悬滴法制备拟胚体(EBs),将EBs细胞与取自孕12.5 d小鼠胚胎的后肾细胞通过间接共培养以诱导其分化,即为共培养诱导组,设EBs细胞自然分化为对照组;采用免疫荧光染色法检测共培养第3、5、7 d后的EBs细胞Pax2、WT-1蛋白表达情况,通过逆转录PCR法检测诱导3 d后的EBs细胞Pax2、WT-1、Lim1、Sall1、Emx2、GDNF、Wnt4、BMP7、Nephl、Nephrin、KSP和CD24 mRNA的表达情况。结果:EBs细胞在诱导的第3 d即出现了全部肾发育相关基因的表达,其中共培养组Pax2、WT-1、Emx2、GDNF、Nephl、Nephrin、KSP和CD24的表达强于对照组;免疫荧光结果显示在诱导3 d后的EBs细胞中可观察到Pax2阳性细胞,阳性细胞数在共培养第5、7 d增多;诱导5 d后可观察到WT-1阳性细胞,对照组未见Pax2或WT-1蛋白阳性细胞出现。结论:后肾细胞微环境可促进ESCs分化为肾系细胞。

人胚胎肾小体系膜细胞的发育

对28例(8～28周)人胚胎肾小体的系膜细胞进行光镜和电镜观察.结果表明:原始期肾小体内无系膜细胞.发育期肾小体系膜细胞形成,成熟期肾小体系膜细胞数量增多.胚胎系膜细胞可能来源于原始期肾小体的间充质细胞.系膜细胞具有丰富的粗面内质网,游离核糖体以及大小不等的溶酶体和吞噬体,在胚胎期具有合成系膜基质,参与基膜形成和维护滤过膜通透性的功能.并对毛细血管起支持作用.文内描述了系膜细胞的形态结构并对其功能进行探讨.

补肾益气和血法中药改善体外授精-胚胎移植妊娠结局及其作用机制研究

目的:观察补肾益气和血法中药介入体外授精-胚胎移植(IVF-ET)的作用效果,并从血清和卵泡液相关生殖激素、细胞因子等指标探索补肾和血法中药改善IVF-ET妊娠结局的作用机制。方法:选取2016年1月至2019年6月湖北省妇幼保健院收治的符合研究标准的患者171例作为研究对象,随机分为观察组(n=85)与对照组(n=86),2组均采用短效长方案,观察组在取卵前3个月加用中药。观察2组患者不同时期的血清和卵泡液生殖内分泌激素、相关因子水平、子宫动脉血流和临床妊娠率。结果:观察组着床率、临床妊娠率分别为54.43%、68.23%,对照组分别为36.69%、53.48%,观察组优于对照组(均P<0.05)。与对照组比较,血清中观察组人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射日、雌激素(E_(2))、孕激素(P)和睾酮(T)水平降低;取卵日E_(2)、P水平降低;移植日E_(2)水平降低;移植7日E_(2)水平升高(均P<0.05)。取卵日和移植日血清胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))和血管内皮生长因子(VEGF)水平升高,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平降低(均P<0.05)。移植7日血清IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF和VEGF水平升高,TNF-α水平降低(均P<0.05)。卵泡液中E_(2)水平升高,P水平降低(均P<0.05);卵泡液中IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β_(1)和VEGF水平升高,TNF-α水平降低(均P<0.05)。与对照组比较,观察组明显改善子宫动脉血流情况(P<0.05)。结论:补肾益气和血法中药可显著改善IVF-ET妊娠结局,其机制可能与补肾益气和血法中药可以调节血清和卵泡液相关生殖激素、细胞因子和子宫动脉血流有关。

小鼠胚胎干细胞在胎肾微环境中共培养后表达肾标志物(英文)

胚胎干(ES)细胞是一种多潜能细胞具有分化成为来自三个胚层各种细胞甚至包括生殖细胞的能力。最新的研究表明,胚胎干细胞在与胚胎脏器细胞共培养后可以定向分化为多种特定细胞表型,他们包括肝细胞、心肌细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞,并在某些情况下甚至可能形成成熟的器官组织结构。已有研究报道说明ES细胞通过在体外环境中直接形成拟胚体(EBs)可以分化成为肾细胞,并且最新的研究成果表明分离自这些EBs的细胞移植入体内后可以形成肾近端小管样结构并且未在其周围发现畸胎瘤形成。但是ES细胞是否可以通过和胎肾细胞相互作用继而获得定向分化并未见诸报道。在实验中我们发现,在与小鼠胎肾细胞共培养后,ES细胞分化成为了肾系细胞。处理后的ES细胞可以检测到与肾发育相关的特征基因,如WT-1、exm-2和Wnt-4基因的表达,我们也发现了终末分化的肾细胞标志物,如podocalyxin、Nephl和RSOR基因的表达。在实验前后,我们同样探寻了ES细胞多分化潜能标记分子的基因表达情况,结果显示共培养后分化的ES细胞Oct-4、Nanog和Klf-4基因表达明显减弱。综上,胎肾细胞微环境可能促使ES细胞定向分化为肾系细胞,提示胚胎器官细胞微环境在ES细胞转分化过程中可能扮演了重要作用。

从胚胎干细胞基本生命活动研究肾为先天之本的思路

肾为先天之本，主藏精，其精气促进人体的生长、发育和生殖，是人体生命活动的原动力。现代医学与生命科学己明确地表明，人体的发育始于受精卵，而受精卵本身就是一种全能干细胞；受精卵以及随后形成的胚胎干细胞体系构成生长发育与修复的源泉。因此，从中医肾的角度理解胚胎干细胞，观察补肾（滋肾阴、温肾阳）对胚胎干细胞增殖、衰老、凋亡等基本生命活动的影响与干预，以及补肾对胚胎干细胞功能关键决定基因等基因转录、表达以及功能的影响，为中医肾理论研究以及正在进行的胚胎干细胞研究提供新的线索与起点。

改构型酸性成纤维细胞生长因子对紫杉醇诱导的人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293损伤的保护作用

目的观察紫杉醇对人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293的毒性作用,及加入改构型酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)后对紫杉醇引起的肝肾细胞损害的保护,并探讨其可能机制。方法用紫杉醇诱导人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293损伤,同时加入aFGF对肝、肾细胞进行保护,并测定培养上清液中的SOD,MDA,LDH值,MTT法测定肝、肾细胞活性。结果紫杉醇在体外对人胚肝细胞L-O2、人胚肾细胞293有一定的毒性作用,使用aFGF对肝、肾细胞进行保护后,IC50值有明显的提高,SOD值与未加aFGF组相比明显升高,而MDA,LDH值明显降低(P<0.05)。结论 aFGF可有效对抗紫杉醇引起的肝、肾细胞损伤。

NS基因克隆及人成骨肉瘤细胞和人胚胎肾细胞NS基因的表达

目的 :研究nucleostemin(核干细胞因子 ,NS)基因在人成骨肉瘤细胞 (OS - 732 )和人胚胎肾细胞 (HEK -2 93)的表达情况 ,并克隆该基因的部分片段。方法 :以OS - 732细胞和HEK - 2 93细胞为实验材料 ,进行细胞总RNA的提取、反转录反应、PCR反应、NS基因片段的克隆及测序等。结果 :(1)提取的总RNA质量很高 ,基本上无降解 ;(2 )OS - 732细胞和HEK - 2 93细胞中均有NS基因的表达 ,并且在相同量底物的情况下 ,OS- 732细胞NS基因的表达量明显高于HEK - 2 93细胞 ;(3)将PCR产物成功地与pGEM -T克隆载体连接 ,构建为pGEM -T -NS质粒 ,测序结果表明NS基因片段序列与基因库中登陆的序列完全一致。结论 :本文成功地从OS - 732细胞和HEK - 2 93细胞克隆到NS基因片段 ,OS - 732细胞NS基因的表达量明显高于HEK- 2