重组人胰岛淀粉样多肽的制备及评价

人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)的淀粉样变与2型糖尿病(T2D)的发生发展密切相关。为解决体外评价化合物抗hIAPP淀粉样变活性所需hIAPP存在化学合成困难、成本高、溶解性低和批次稳定性差等问题,本研究以蛛丝蛋白N端结构域突变体NT作为融合标签,构建大肠杆菌高效表达hIAPP体系。通过优化表达条件和分离纯化工艺,获得重组hIAPP(rhIAPP),并对rhIAPP二硫键形成、淀粉样变能力和淀粉样变产物的毒性进行检测。融合蛋白质以包涵体形式存在,经过尿素变性和亲和层析纯化得到融合蛋白质产量为70 mg/L发酵液,融合蛋白质经过复性、凝血酶切除融合标签和进一步纯化,最终得到rhIAPP产量为6 mg/L发酵液。检测显示,rhIAPP的巯基未形成二硫键。rhIAPP具有“S”型淀粉样变曲线,其形成的β-折叠结构远多于化学合成的hIAPP(chIAPP),化合物姜黄素能显著抑制2种来源hIAPP的淀粉样变。细胞毒检测表明,rhIAPP在与红细胞孵育过程中促进红细胞溶血。

利用Trim-Away技术降低人胰岛淀粉样多肽在大鼠胰岛素瘤细胞中的毒性

人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)又称胰淀素(Amylin),是胰岛β细胞中胰岛素的共分泌蛋白,与胰岛素共同包裹在囊泡中被分泌出细胞。正常生理条件下,hIAPP有助于胰岛素分泌并调节机体血糖平衡;但其蛋白错误折叠或过量积累则会对细胞造成毒性,进而影响β细胞功能,导致机体罹患2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)。为了清除细胞内过度积累的hIAPP,且不影响其正常的合成功能,本研究选用一种新的蛋白质降解技术——Trim-Away,该技术可以在短时间内降解目标蛋白质,且不会对靶蛋白的mRNA转录、翻译等功能产生影响。首先在大鼠(Rattus norvegicus)胰岛素瘤细胞(insulinoma cells,INS1)中过表达hIAPP模拟其过度累积的情况,并通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的释放、CCK8(cell counting kit-8)的活性以及PI-Annexin V流式检测的阳性比例变化,证明hIAPP的过度积累造成β细胞的凋亡;通过实时定量PCR及ELISA检测发现胰岛素的合成和分泌都受到了阻碍;最后利用Trim-Away技术在hIAPP过表达的INS1细胞中特异性清除了过度积累的hIAPP蛋白。细胞活性实验证实清除hIAPP蛋白可以减少细胞的死亡,ELISA实验证实INS1细胞恢复了胰岛素的分泌能力。本研究验证了hIAPP过度积累对INS1细胞的毒性作用,并且证明Trim-Away技术在清除胰腺β细胞中hIAPP毒性具有效果,为利用Trim-Away治疗糖尿病提供了新的策略。

不同金属离子对人胰岛淀粉样多肽纤维形成的影响研究

人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)的淀粉样变性与Ⅱ型糖尿病关系紧密,而生长条件对hIAPP的纤维化过程有很大影响。体液中的金属离子失衡会促进纤维形成、增强细胞毒性。本文通过负染色透射电子显微镜(TEM)观察,辅以圆二色光谱(CD)和硫磺素T(ThT)荧光检测,探究了钠、钾等一价金属离子和镁、钙等二价金属离子对hIAPP纤维形态及形成过程的影响,发现hIAPP纤维在不同浓度金属离子盐溶液中呈现出两种不同形态,并且相同盐离子浓度条件下镁、钙等二价金属离子对于hIAPP纤维的形成具有比钠、钾等一价金属离子更显著的促进效果。分析表明,不同价态的金属离子主要通过改变hIAPP的疏水相互作用而影响淀粉样纤维的形成。

人胰岛淀粉样多肽与2型糖尿病相关性的研究进展

人胰岛细胞内外积聚的有毒淀粉样多肽导致胰岛β细胞团丢失,是T2DM典型病理学特征。人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)是一种与T2DM患者胰岛β细胞死亡相关的胰腺激素,其淀粉样沉积量与疾病严重程度呈正相关。本文综述hIAPP与T2DM相关性的研究进展。

胰岛淀粉样多肽的分子结构、毒性及其抑制因素

人胰岛淀粉样多肽(human amylin,hAmylin)是2型糖尿病患者胰岛中淀粉样蛋白沉积的主要成分,是由37个氨基酸组成的多肽。生理状态下,hAmylin与胰岛素共同产生并储存于胰岛β细胞,按1∶100的比例共同分泌,且促进胰岛素分泌的因素亦均可促进hAmylin分泌。hAmylin的单体结构未折叠,呈不稳定状态。与β淀粉样蛋白(amyloidβpeptide,Aβ)一样,hAmylin的细胞毒性与其单体状态不稳定,易发生聚集,形成寡聚物及纤维结构的特性有关。hAmylin的聚集会对细胞造成不可逆的损伤。该文重点综述了hAmylin的结构、聚集与脂质膜的相互作用、毒性及其毒性抑制剂的最新研究进展。

聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯对人胰岛淀粉样蛋白聚集的抑制作用

利用共价结合的方法在氧化石墨烯(GO)表面修饰聚乙烯亚胺(PEI),得到了稳定的GO-PEI复合物.透射电子显微镜和圆二色谱实验结果显示,对于人类胰岛淀粉样多肽(hIAPP)的纤维化聚集GO-PEI比GO有更强的抑制能力.结合Th T荧光和原子力显微镜实验结果发现,在hIAPP聚集过程的成核初期加入GO-PEI有最好的抑制效果,在纤维化过程的生长期加入GO-PEI能部分抑制hIAPP纤维的形成,但GO-PEI不能使成熟的hIAPP纤维解聚集.

胰岛淀粉样多肽对高糖刺激下INS-1细胞凋亡及其相关基因表达的影响

目的探讨高糖刺激下转染过表达人胰岛淀粉样多肽基因的大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)细胞凋亡的影响及其相关基因表达。方法应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测高糖刺激后INS-1及转染人胰岛淀粉样多肽的INS-1细胞(h IAPP/INS-1)上清液的胰岛素水平;利用Hoechst33258染色检测细胞凋亡百分率;采用RTPCR方法检测高糖刺激培养后的Bcl2、Bax m RNA的水平。结果高糖刺激下,与未转染人胰岛淀粉样多肽INS-1细胞相比较,h IAPP/INS-1细胞胰岛素分泌功能显著下降,凋亡细胞比例明显增加,抗凋亡基因Bcl2 m RNA表达水平下调,促凋亡基因Bax m RNA表达水平上调,Bcl2/Bax比例明显降低。结论人胰岛淀粉样多肽上调促凋亡基因表达和抑制抗凋亡基因表达可能与糖尿病的发生发展相关。

短肽FLPNF抑制大鼠胰岛素瘤INS-1细胞内hIAPP聚集的研究

目的探讨自行设计并合成的短肽FLPNF抑制过表达人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)的大鼠胰岛素瘤INS-1细胞内hIAPP的聚集作用和机制,及其对hIAPP-INS-1细胞增殖活力及胰岛素分泌功能的保护作用。方法以慢病毒转染人hIAPP基因构建的hIAPP-INS-1细胞株为研究对象,用不同浓度的FLPNF处理hIAPP-INS-1细胞并分组,硫黄素T染色法检测细胞内hIAPP的聚集情况,MTS法检测细胞增殖活力,ELISA法检测细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能;根据FLPNF、脑啡肽酶抑制剂单独及联合处理hIAPP-INS-1细胞分组,应用酶活性测定法检测FLPNF对脑啡肽酶活性的影响及硫黄素T染色法检测细胞内hIAPP的聚集情况。结果与空白对照组相比,200μmol/L FLPNF可以明显抑制细胞内hIAPP聚集,绿色荧光强度明显降低(F=14.442,P<0.01),细胞的增殖活力明显增加(F=4.151,P<0.01),葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能有升高趋势(F=0.603,P>0.05)。FLPNF可使hIAPP-INS-1细胞内脑啡肽酶活性明显增加,为空白对照组的2.356倍(F=84.265,P<0.01)。同时加入脑啡肽酶抑制剂时,FLPNF抑制hIAPP聚集的作用较单独加入FLPNF组明显降低(F=9.868,P<0.01)。结论FLPNF在hIAPP-INS-1细胞内可以通过增强脑啡肽酶活性,抑制hIAPP的聚集,对细胞的增殖活力及胰岛素分泌功能具有一定的保护作用。

Aβ40和hIAPP在溶液和表面的成核与交叉成核聚集行为

阿尔茨海默氏病(AD)和2型糖尿病(T2DM)是常见的由蛋白质错误折叠引起的疾病,作为与此二者相关的致病蛋白,淀粉样β蛋白(Aβ)和人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)的交叉聚集行为暗示了AD和T2DM的相关性。然而,Aβ和hIAPP在体内的交叉聚集过程尚不明确。为了更好地模拟体内环境特征,即同时存在不同形式的淀粉样蛋白聚集体,且少量的聚集体附着在血管壁上会成为聚集过程的种子,本文以硫代黄素T荧光测定,原子力显微镜,圆二色光谱,石英晶体微天平以及MTT法作为研究手段,探究了Aβ和hIAPP在溶液和固体表面的成核与交叉成核聚集行为。结果表明,少量的Aβ40和hIAPP种子(单体浓度的1/50)即可显著改变异源聚集的聚集路径,形成具有不同形态且含有更多β-折叠结构的异源聚集体,导致更高的细胞毒性。溶液和固体表面上的结果均证明异源成核聚集效率低于同源聚集,且异源聚集的特征很大程度上取决于种子类型。此外,不同于溶液中所得结果,hIAPP种子在固体表面的交叉成核聚集效率显著高于Aβ40种子,证明了界面性质对交叉聚集过程的影响。这些结论对于理解淀粉样蛋白交叉聚集过程具有重要意义。

hIAPP与麦芽糖结合蛋白的融合表达、纯化和鉴定

基于人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)的氨基酸序列,按照大肠杆菌(E.coli)密码子偏好性合成基因,并克隆到pMAL-c2x载体中,与MBP蛋白malE基因融合表达,获得重组表达质粒pMAL-hIAPP.将质粒pMAL-hIAPP转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中,利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白MBP-hIAPP表达.SDS-PAGE电泳显示融合蛋白MBP-hIAPP的相对分子质量约为4.9×104.利用重组型烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶(rTEV)酶切MBP-hIAPP,并采用凝胶过滤层析的方法分离出高纯度的hIAPP,利用MALDI-TOF质谱进行了验证.

内质网应激介导β细胞凋亡的研究进展

内质网是真核细胞内蛋白质合成加工、Ca^(2+)稳态调节及脂类合成的重要场所。当环境、遗传因素影响内质网正常功能,使未折叠或错误折叠蛋白大量蓄积时,诱导内质网应激(ERS),进而激活未折叠蛋白反应(UPR)。UPR为细胞自身内质网稳态调节的一种自我保护机制,而持续过强的UPR最终导致细胞凋亡的发生。已有研究表明,T2DM中胰岛素分泌缺陷与β细胞凋亡致数量减少密切相关。本文回顾近年相关研究,对人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)、糖脂细胞毒性、代谢性炎症、自噬障碍介导ERS反应,最终导致β细胞凋亡的相关机制进行综述。

饮用咖啡能防治2型糖尿病吗?

T2DM患者的合理膳食、食物,以及天然产物中降血糖和提高胰岛素敏感性功能成分是一热门研究领域。一项体外研究结果发现,咖啡成分可抑制人胰岛淀粉样多肽形成,饮用咖啡和糖尿病之间可能存在联系。关于饮用咖啡对T2DM影响的研究结果很不一致。而我国目前尚无上述两种关系的流行病学及随机对照干预试验的研究数据,加之我国居民饮用咖啡的历史较短,饮用量较西方国家低得多,日饮3杯以上咖啡的人群可能屈指可数,而我国居民机体对咖啡的应答是否同于西方人至今不明。此外,还应考虑咖啡因对睡眠和血压的急性影响等不良反应。鉴于此,为了防治T2DM而每日饮用3杯以上咖啡至少目前缺乏令人信服的科学依据。