表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒 pPIC9K中 ,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P .pastorisGS1 1 5。筛选出整合型His+ Muts 菌株 ,进一步用G4 1 8筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究 。

人胰岛素样生长因子1前体基因的重组、表达及纯化

目的构建含有人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)前体编码基因的重组载体,在E.coliBL21中表达,并探讨其抗原性和应用价值。方法用PCR法,从现有重组质粒pBakPAK8/hIGF-1中,扩增编码hIGF-1前体的基因片段,经双酶切、纯化、连接后得到pET29a(+)/hIGF-1重组体,再将其转化大肠杆菌BL21-CodonPlus并诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化后,用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果重组持粒pET29a(+)/hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析证实构建成功。在大肠杆菌BL21-CodonPlus中经IPTG诱导表达,有一相对分子质量15000的重组蛋白hIGF-1前体,该蛋白经镍柱亲和层析获得了良好的纯化效果,具有特异的抗原活性。结论成功地克隆并表达相对分子质量为15000的hIGF-1前体编码基因,为进一步制备抗hIGF-1抗体和后续hIGF-1生物学功能研究打下了良好基础。