酵母双杂交技术对人胰腺cDNA文库中HBcAg结合蛋白基因的筛选

目的:应用酵母双杂交技术,筛选人胰腺cDNA文库中与HBV核心抗原结合的蛋白的基因.方法:扩增人胰腺cDNA文库并纯化鉴定,将其转化至酵母菌Y187;诱饵质粒pGBKT7-HBcAg转化酵母菌AH109并筛选鉴定.应用酵母双杂交系统3进行配合,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基和含X-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上进行双重筛选,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌DH5α,提取质粒并测序,对测序结果进行生物信息学分析.结果:人胰腺cDNA文库的构建以及pGBKT7-HBcAg质粒转化AH109酵母菌株均获成功,并从人胰腺cDNA文库中筛选出9个与HBcAg蛋白相结合的蛋白基因,分别与以下已知的9种编码蛋白基因序列同源:人胰脂肪酶(PNLIP)、人胆盐刺激酯酶(CEL)、人胰凝乳蛋白C(CTRC)、人胰蛋白酶原、人羧肽酶B1(CPB1)、人线粒体全基因组、人胰弹性酶2A、人辅脂肪酶(CLPS)和人核糖体蛋白(RPL10A).结论:筛选出的与HBcAg蛋白相结合的蛋白基因主要与胰腺外分泌功能相关,HBV感染可能通过与胰腺所分泌的糖、脂类代谢相关的酶类结合,而引发代谢性疾病.

丙型肝炎病毒E2结合蛋白基因在人胰腺细胞cDNA文库中的筛选

目的:筛选人胰腺细胞cDNA文库中与HCV包膜糖蛋白E2相互作用的结合蛋白的编码基因.方法:扩增人胰腺细胞cDNA文库进行纯化鉴定,并将文库质粒转化酵母菌株Y187.诱饵质粒pGBKT7-E2转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在4缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的4缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序.测序结果进行序列比对.结果:成功构建人胰腺cDNA文库以及pGB-KT7-HCVE2重组质粒,筛选出8种与HCVE2蛋白相结合的蛋白基因,分别为:胰凝乳蛋白酶原B1前体、胰蛋白酶原、胆盐刺激酯酶、CDK5、羧肽酶B1、人类v-Ki-ras2、鼠Kirsten肉瘤、弹性蛋白酶3A及辅脂肪酶.结论:筛选出的与HCVE2蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中,部分与2型糖尿病、肝脏脂肪变性密切相关.

皱纹盘鲍肝胰腺和肾脏维生素C缺乏诱导的差异表达cDNA文库的构建

采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术研究皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino.)Vc缺乏诱导的差异表达基因。实验用皱纹盘鲍成鲍初始体质量为(74.32±0.43)g,初始壳长为(84.36±0.24)mm。配制了Vc缺乏(0.0mg/kg)和高剂量添加(4967.5mg/kg)2个水平的人工饲料进行饲喂。经过170d的养殖后,分别构建肝胰腺和肾脏Vc缺乏消减cDNA文库。消减杂交效率分析显示,差异表达的基因分别被富集了大约25和25～210倍。从两个文库中随机挑选阳性克隆进行测序。在肝胰腺消减cDNA文库中获得63个片段,其中已知功能基因占54.0%,Gene ontology(GO)按照功能将其分为4类:代谢相关基因占15.9%,细胞代谢相关基因占30.2%,生物调节相关基因占4.8%,其他功能基因占3.2%。未知功能基因占46.0%。在肾脏消减cDNA文库中获得39个片段,其中已知功能基因占53.8%,GO将其分为3类:代谢相关基因占5.1%,细胞代谢相关基因占28.2%,生物调节相关基因占20.5%。未知功能基因占46.2%。其中,获得了包括细胞色素c氧化酶、葡萄糖-1脱氢酶、α-葡萄糖苷酶、β-1,3-D-葡聚糖酶、纤维素酶、藻酸盐裂解酶以及铁蛋白等在其他动物中被证明与Vc合成相关的基因,为进一步研究皱纹盘鲍Vc的合成和代谢奠定了基础。

酵母双杂交技术筛选人胰腺细胞中HCV 1b NS3结合蛋白基因

目的:应用酵母双杂交技术筛选人胰腺cDNA文库中与HCV1b亚型非结构蛋白NS3相互作用的结合蛋白的编码基因,为进一步研究HCV影响糖、脂代谢机制奠定实验基础.方法:扩增人胰腺cDNA文库并纯化鉴定,纯化后的文库质粒转化酵母菌Y187;构建诱饵质粒PGBKT7-NS3并转化酵母菌AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后提取质粒测序,对测序结果进行序列比对和分析.结果:成功构建人胰腺cDNA文库和pGBKT7-NS3重组质粒;将pGBKT7-NS3质粒转化AH109酵母菌株后,并从人胰腺cDNA文库中筛选出11种与HCVNS3蛋白相结合的蛋白基因.结论:筛选出的与HCVNS3蛋白结合的胰腺蛋白基因中,部分与2型糖尿病、肝脏脂肪变性密切相关.

胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建及质量分析

目的 构建人胰腺癌抑制消减cDNA文库。方法 从来源于同一标本的胰腺癌和癌旁正常组织分离poly（A）+RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交（SSH）方法,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果 挑取500个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示其中457个克隆有插入片段,片段大小范围为250～750pb。结论 应用消减杂交的方法,再经适当的改进,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的胰腺癌cDNA消减文库,该文库为进一步批量筛选胰腺癌发生的相关基因群并克隆胰腺癌相关表达基因,研究其胰腺癌发生的分子机理与生物学特性间的关系奠定了基础。

人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒NS4B结合蛋白基因的筛选

目的应用酵母双杂交技术筛选人胰腺细胞cDNA文库中与HCV包膜糖蛋白NS4B相互作用的结合蛋白的编码基因。方法扩增人胰腺细胞cDNA文库进行纯化鉴定,并将文库质粒转化酵母菌株Y187。诱饵质粒pGBKT7-NS4B转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落。应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-H is/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序。测序结果进行序列比对。结果成功构建人胰腺cDNA文库以及pGBKT7-HCV NS4B重组质粒,筛选出7种与HCV NS4B蛋白相结合的蛋白基因。结论筛选出的与HCV NS4B蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中,部分与2型糖尿病、肝脏脂肪变性密切相关。

人胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建

目的应用抑制消减杂交技术(SSH)构建胰腺癌和正常胰腺组织间差异表达的抑制消减cDNA文库.方法分别提取胰腺癌(tester)和癌旁正常胰腺组织(driver)中的总RNA和mRNA,合成双链cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将胰腺癌双链cDNA分为两组,分别加上不同的接头,再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,分离出胰腺癌差异表达基因的cDNA片段.将该差异表达片段克隆至T/A载体,并转化大肠杆菌TOP 10F',经蓝白斑筛选后,再用PCR方法筛选阳性克隆,从而构建胰腺癌抑制消减cDNA文库.结果文库扩增后得到257个白色克隆,随机挑取50个阳性克隆进行PCR扩增分析,其中47个克隆有插入片段,克隆阳性率为94%,片段大小主要集中在300～600bp之间.结论成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆胰腺癌特异性表达基因奠定了基础.

1个新的胰腺癌相关基因的筛选和初步鉴定

目的筛选和鉴定胰腺癌相关基因。方法提取胰腺癌和癌旁正常胰腺组织中的RNA和mRNA,应用抑制消减杂交技术(SSH)构建消减cDNA文库。采用随机数字表法挑选有插入片段的阳性克隆进行测序及同源性分析。应用RT-PCR和Northernblot检测新基因在12例胰腺癌和癌旁正常胰腺组织以及4种胰腺癌细胞株(PaTu8988、SW1990、Bx-PC-3、AsPC-1)中的表达情况。结果随机挑取50个直径>1mm的白色克隆进行PCR扩增分析,其中47个克隆有插入片段,克隆阳性率为94%。对47个有插入片段的阳性克隆进行测序,得到42个可用序列。同源性分析发现41个为已知基因,1个为无任何功能线索的未知基因,可能代表了新基因。RT-PCR显示新基因在12例胰腺癌组织和4种胰腺癌细胞株中均表达,而在正常胰腺组织中未见表达。Northernblot分析得到相同的结果。结论应用SSH技术成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库,并筛选出1条新的胰腺癌相关基因。新基因与胰腺癌的发生、发展密切相关,可作为胰腺癌诊断和基因治疗的分子靶标。

胰腺细胞中与HCV NS2蛋白相互作用蛋白中代谢相关基因的筛选

目的:研究人胰腺细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白NS2相互作用的结合蛋白中的代谢相关基因.方法:扩增人胰腺细胞cDNA文库并进行纯化鉴定,将文库质粒转化酵母菌株Y187.诱饵质粒pGBKT7-NS2转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在4缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的4缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序.测序结果进行序列比对.结果:成功构建人胰腺cDNA文库以及pGB-KT7-HCVNS2重组质粒,筛选出7种与HCVNS2蛋白相结合的蛋白基因.结论:筛选出的与HCVNS2蛋白结合的部分人胰腺细胞蛋白基因与糖、脂类代谢密切相关.

HBsAg结合胰腺细胞蛋白基因的酵母双杂交技术筛选

目的应用酵母双杂交技术筛选胰腺细胞cDNA文库中与HBsAg相互作用的结合蛋白的基因。方法扩增人胰腺cDNA文库并纯化鉴定,将其转入酵母菌Y187;诱饵质粒PGBKT7-HBSAg转入酵母菌AH109。将以上二者进行配合,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和X-α-Gal培养基上进行双重菌落筛选;提取阳性质粒转化大肠埃希菌DH5α并测序,在GenBank中进行生物信息学分析。结果获得了6个与HBsAg相结合的蛋白,包括顺乌头酸酶、CDK5RAP3、羧肽酶B1、胰脂肪酶、辅脂肪酶、弹性蛋白酶。结论筛选出的胰腺细胞蛋白与2型糖尿病等代谢性疾病有较密切关系,为进一步研究并阐明乙肝病毒(HBV)感染引发糖脂代谢紊乱机制提供了新的思路。

人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒E1结合蛋白基因的筛选

目的应用酵母双杂交技术筛选人胰腺细胞cDNA文库中与HCV包膜糖蛋白E1相互作用的结合蛋白的编码基因。方法扩增人胰腺细胞cDNA文库并经纯化鉴定后，将文库质粒转化酵母菌株Y187。诱饵质粒pGBKT7-E1转化酵母菌株AH109，在色氨酸缺陷型培养基（SD／-Trp）上筛选阳性菌落。应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合，在四缺培养基（SD／-Trp／-Leu／-His／Ade）和铺有X—a—gal的四缺培养基上进行筛选，提取蓝色酵母菌落质粒，电转化大肠埃希菌DH5a后再提取质粒测序，测序结果进行序列比对。结果筛选出16种与HCVE1蛋白相结合的蛋白基因。结论在筛选出的与HCVE1蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中，部分可能与糖、脂类代谢密切相关。

酵母双杂交技术筛选与RIG-Ⅰ相互作用蛋白

目的:筛选人脾细胞cDNA文库中与维甲酸诱导Ⅰ型基因(RIG-Ⅰ)所编码蛋白具有相互作用的蛋白基因。方法:通过聚合酶链反应(PCR),以HEK293T细胞RNA为模板扩增RIG-Ⅰ基因的2CARD结构域部分,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒pGBKT7-RIG-Ⅰ2CARD,转化到酵母细胞AH109感受态中,得到阳性克隆AH109[RIG-Ⅰ2CARD]。然后将人脾细胞cDNA文库转化进AH109[RIG-Ⅰ2CARD],在含有X-α-半乳糖(X-α-Ga1)四缺营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,提取质粒后转化DH5α大肠杆菌并经氨苄青霉素抗性筛选,挑取单克隆菌落抽提质粒,并进行测序,再进行生物信息学分析。结果:成功构建酵母诱饵蛋白表达质粒pG-BKT7-RIG-Ⅰ2CARD,并能在酵母中表达。筛选出阳性菌落59个,经生物信息学分析,最后从脾细胞cDNA文库中筛选出12个与RIG-Ⅰ2CARD有相互作用的蛋白基因。结论:成功克隆出RIG-Ⅰ2CARD基因,并从脾细胞cDNA文库中筛选出12种能与RIG-Ⅰ2CARD具有相互作用的蛋白基因。