重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)对化学致糖尿病模型动物的降血糖作用

目的 本文研究了重组人胰高血糖素类多肽 1(7 36 )[rhGLP 1(7 36 ) ]对化学所致糖尿病模型动物的降血糖和促胰岛素分泌作用。方法 对四氧嘧啶型糖尿病小鼠及链脲霉素型糖尿病大鼠皮下注射不同剂量的rhGLP 1,分别于给药 4天后采血 ,收取血清 ,测定血糖及胰岛素值。结果 四氧嘧啶型糖尿病小鼠皮下注射 4 0、80 μg·kg-1rhGLP 1后 ,血糖值显著下降 (P <0 0 1) ,而 2 0 μg·kg-1剂量组则无显著性改变 ;链脲霉素型糖尿病大鼠皮下注射 2 8、5 6 μg·kg-1rhGLP 1后 ,血糖值显著下降 (P <0 0 5、P <0 0 1) ,而 14 μg·kg-1剂量组则无显著性改变。结论 rhGLP 1对实验动物部分

重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)对正常动物降糖作用的实验研究

目的 :观察rhGLP 1(7 36 )对正常动物的降血糖和促胰岛素分泌作用以及该作用的葡萄糖依赖性。方法 :用不同动物模型sc不同剂量的rhGLP 1(7 36 )后 ,收集血清 ,测定血糖值及胰岛素值。结果 :正常C5 7小鼠和家兔sc不同剂量的rhGLP 1(7 36 )后 ,血糖和胰岛素分泌均无明显改变 ,提示rh GLP 1(7 36 )并不影响血糖正常动物的胰岛素分泌及血糖 ;对于给糖负荷动物 ,rhGLP 1(7 36 )使其胰岛素分泌增加 ,并进而使升高的血糖明显降低 ,表明rhGLP 1(7 36 )具有明显的葡萄糖依赖的促胰岛素分泌作用。在C5 7小鼠和家兔糖耐量实验中发现 ,rh GLP 1(7 36 ) 16 μg·kg-1使糖负荷家兔胰岛素分泌增加 ,血糖升高曲线明显降低 ,说明rhGLP 1(7 36 )能明显增加动物对糖的耐受。结论 :rhGLP 1(7 36 )通过葡萄糖依赖的胰岛素分泌作用降低过高血糖 ,而不降低正常血糖 ,同时用量小 ,起效快 ,安全性高。

利用转基因烟草表达人胰高血糖素样肽1的研究

人胰高血糖素样肽1(hGLP1)是一种短肽激素,是近年来备受关注的治疗糖尿病最有前景的候选药物。在设计合成hGLP1基因并构建植物表达载体的基础上,通过农杆菌介导将hGLP1基因导入烟草基因组中,获得转化再生植株,经过PCR扩增和Southern blot分析,证实hGLP1基因已整合进入6个株系的烟草基因组中。GUS组织化学染色表明,与目的基因融合的报告基因在转基因烟草中获得表达。Western blot检测表明,其中2个株系转基因烟草叶片中能够检测到hGLP1融合蛋白的表达。初步的动物试验表明该融合蛋白具有一定的降血糖生物活性。

重组人胰高血糖素样肽-1的表达、纯化及其生物学活性

为获得重组人胰高血糖素样肽 1[recombinanthumanglucagon likepeptide 1(7～ 37) ,rhGLP 1]并研究其生物学活性 ,采用亚磷酸二酯法合成hGLP 1cDNA的 6个寡核苷酸片段 ,拼接成完整的hGLP 1cDNA ,构建重组质粒pGEX hGLP 1,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)获得表达菌株 .高密度发酵培养的菌体超声破碎后 ,裂解液用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化得到GST融合蛋白 .经CNBr裂解、QAE SepharoseFF柱层析和脱盐 ,得到纯度大于 90 %的rhGLP 1,质谱测定分子量结果与理论值一致 .生物学活性分析表明 ,rhGLP 1具有明显的降血糖活性 .

人胰高血糖素样肽1在转基因番茄中的表达

人胰高血糖素样肽1(GLP1)是一种短肽激素,对Ⅱ型糖尿病具有很好的疗效。本研究在设计合成GLP1基因并构建植物表达载体的基础上,通过农杆菌介导将GLP1基因导入番茄基因组中,经过PCR扩增和Southern Blot分析,证实GLP1基因已整合进入9个株系的番茄基因组中。Western Blot检测表明,其中4个株系转基因番茄的叶片能够检测到hGLP1融合蛋白的表达。通过Ni-NTA亲和层析分离纯化转基因番茄表达的hGLP1融合蛋白,动物实验表明该融合蛋白具有显著的降血糖生物活性。本研究结果将为转基因番茄作为生物反应器表达药用蛋白提供重要的理论和技术支持,并将为培育具有糖尿病治疗功能的番茄新品种奠定基础。

高密度培养大肠杆菌表达重组人胰高血糖素样肽-1

目的 :高密度发酵培养表达重组人胰高血糖素样肽 - 1( h GL P- 1)。方法 :将构建的重组质粒 p GEX- h GL P- 1转化大肠杆菌 BL 2 1( DE3 ) ,得到表达 h GL P- 1的工程菌株 E.coli BL 2 1( DE3 ) / p GEX- h GL P- 1。在 5 0 0 m l三角摇瓶中进行了诱导条件的摸索实验 ,之后用 5 L自控发酵罐对工程菌进行高密度培养 ,以获取 h GL P- 1和谷胱甘肽 S-转移酶融合蛋白 ( GST- h GL P- 1)。结果 :采用分批培养和补料分批培养相结合的技术 ,控制碳源和氮源的补加 ,控制溶解氧的量 ,可使重组工程菌发酵光密度D6 0 0 值达 5 2 ,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白量的 2 8% ,其含量达到 2 .1g/ L。用 ESI质谱鉴定 h GL P- 1相对分子质量与理论值一致。 结论 :本研究为大规模生产重组 h GL P-

健康志愿者单次皮下注射重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)[rhGLP-1(7-36)]耐受性研究

目的：在中国健康成年志愿者中评价单次皮下注射重组人胰高血糖素类多肽-1（7-36）[rhGLP-1（7-36）]的安全性、耐受性。方法：根据GCP设计试验方案，并获得伦理委员会批准。受试者须自愿签署知情同意书。选择42名18～50岁健康成人，将受试者随机分至0．10～0．45mg7个剂量组，每组6名，男女各半，分别接受单次皮下注射rhGLP-1（7-36），进行临床和实验室检查，考察药物耐受性。结果：单次皮下注射rhGLP-1（7-36）耐受性试验中，各组受试者各项指标测定值均在正常范围内，条件均衡，具较好可比性。因剂量至0．30mg时，不良事件（恶心、呕吐）在该组发生率超过50％，故于该剂量组试验完成后终止了下一剂量组试验，仅有4个剂量组共24名健康受试者完成了本试验。24例受试者完成的4个剂量组耐受性试验中，给药后实验室检查未见有临床意义的改变。试验中出现10例（共15例次）可能与药物有关的不良反应，如头晕、恶心、呕吐等，但均可耐受，且为一过性反应，于给药后1h内自行消失。其中，不良反应主要发生在0.25、0．30mg组（共7例12例次），而低剂量组（0．10、0．20mg）仅有3例发生轻度不良反应。15例次不良反应中，头晕、恶心有10例次，呕吐有5例次；整个试验过程未见严重不良事件。结论：24名中国健康成年受试者分别单次皮下注射rhGLP-1（7-36），最大剂量至0．20mg，比较安全、耐受性较好，为最大耐受剂量。而单次给药剂量至0．25mg或0．30mg则不良反应发生率较高，最大耐受剂量为0．20mg。建议单次用药剂量不宜超过0．20mg。在Ⅱ期临床试验中需严密观察恶心、呕吐这些与药物可能有关的不良反应及其发生机制。

表达人胰高血糖素样肽前药工程菌遗传稳定性

通过传代培养的方法,研究高表达重组人胰高血糖素样肽前药(Pro-rhGLPs)的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET41a(+)-hGLPs的遗传稳定性,观察菌体和菌落形态,比较在有无选择压力下的质粒稳定性,酶切和测序鉴定重组基因片断的正确性,SDS-PAGE电泳证实重组蛋白质的表达量的稳定性,在C57BL/6小鼠上进行葡萄糖耐量实验检测重组蛋白生物学活性。结果显示:此工程菌连续传代过程中,保持大肠杆菌的典型特征,各代质粒的酶切鉴定和测序正确,重组蛋白表达水平及生物活性也无显著差异。因此,工程菌E.coliBL21(DE3)/pET41a(+)-hGLPs具有良好的遗传稳定性。

重组人胰高血糖素样肽-1对实验性糖尿病大鼠血糖的影响

目的观察重组人胰高血糖素样肽 1[rhGLP 1(7 36 )NH2 和rhGLP 1(7 37) ]对实验性糖尿病大鼠模型血糖和血浆胰岛素水平的影响。方法正常SD大鼠按 3.2 4g/kg腹腔注射 5 0 %葡萄糖 ,诱发暂时性高血糖动物模型。腹腔注射不同剂量 (2 0、4 0、80 μg/kg)rhGLP 1(7 36 )NH2 和rhGLP 1(7 37) ,间隔取血测定血糖与血浆胰岛素水平。正常SD大鼠按 6 0mg/kg腹腔注射链脲佐菌素 ,建立实验性 1型糖尿病大鼠模型。静脉输注rhGLP 1(7 36 )NH2 [4.0ng/(kg·min) ]12 0min并观察血糖变化。结果腹腔注射 4 0、80 μg/kgrhGLP 1(7 36 )NH2 和rhGLP 1(7 37)处理组大鼠的血糖、血浆胰岛素水平与对照组之间的差别具有非常显著性意义 (P <0 .0 0 1) ,且呈现一定的量效关系。二者之间促胰岛素分泌和降血糖活性差异无显著性。静脉输注rhGLP 1(7 36 )NH2 6 0min后 ,血糖水平 (17.0 4± 1.31)mmol/L(P <0 .0 5 ) ,12 0min后血糖水平 (11.98± 1.0 5 )mmol/L(P <0 .0 0 1)。结论rhGLP 1能显著改善实验性糖尿病大鼠的血糖水平 ,这与其促胰岛素分泌活性有关。

人胰高血糖素样肽-1类似物基因治疗对STZ诱导糖尿病大鼠的拮抗作用

目的观察人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)类似物基因对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠的拮抗作用。方法将SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型组、空载体对照组及基因治疗拮抗组,每组10只。应用小剂量、多次给药的方式诱导糖尿病大鼠模型,观察hGLP-1类似物基因对大鼠血糖、血清胰岛素及胆固醇水平的影响。借助荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在不同组织中的表达情况;采用免疫组化分析胰岛细胞中胰岛素的表达水平。结果与糖尿病模型组和空载体对照组比较,基因治疗拮抗组糖尿病大鼠血糖水平下降、血清胰岛素水平升高、血清胆固醇水平下降。胰岛素免疫组化分析证实,胰岛细胞中胰岛素得以表达,基因治疗可使受损的胰岛细胞功能恢复。结论 hGLP-1类似物基因治疗对STZ诱导的糖尿病症状具有拮抗作用,改善糖尿病大鼠血糖、血清胰岛素和血脂水平。

重组人胰高血糖素样多肽-1(7-36)在健康人体的药代动力学

目的研究重组人胰高血糖素类多肽-1（7-36）[rhGLP-1（7-36）]（促胰岛素生成药）在健康志愿者的药代动力学.方法选择12,9名健康志愿者,分别单次（0.1,0.15,0.2 mg）和多次（0.2 mg）皮下注射rhGLP-1（7-36）,连续5日,用荧光酶联免疫分析法测定其血药浓度,用DAS软件计算其药代动力学参数.结果单次：药-时曲线符合一房室模型,Cmax、AUC0-t随剂量增加而增加,tmax约为19～21 min,ti/2为10～14min.多次：首次与末次给药后的Cmax分别为（726.76±94.07）,（737.15±72.12）ng·L-1;tmax为18min左右;t1/2为15～17 min.结论在0.1～0.2 mg内,过程呈一级线性动力学特征,体内无蓄积,耐受性较好.

人胰高血糖素样肽-1类似物基因治疗对糖尿病大鼠机体代谢的影响

目的观察人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)类似物基因(2×Val2-hGLP-1)对糖尿病大鼠模型机体代谢的影响。方法建立糖尿病大鼠模型,尾静脉注射携带hGLP-1类似物基因的重组表达载体(pIRES2-EGFP/Val2-hGLP-1),观察30d,期间测定相关指标。结果治疗后糖尿病大鼠体重、进食及饮水量改善明显(P<0.01)。治疗15d后,血糖水平由(27.06±1.73)mmol/L降至(17.57±2.17)mmol/L(P<0.01),血清胰岛素水平由(5.53±0.79)mIU/L升高至(9.88±0.96)mIU/L(P<0.01)。总胆固醇水平降低(P<0.05或P<0.01)。hGLP-1蛋白在胰腺、肝、肾、肌肉组织中表达。结论 hGLP-1类似物基因可导入糖尿病大鼠体内并成功表达,基因治疗降低大鼠血糖,血脂水平,改善大鼠的机体代谢。

ELISA试剂盒方法测定重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)浓度

目的:定量检测血浆样本中重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)[rhGLP-1(7-36)]的含量。方法:用LINCO公司生产的试剂盒对rhGLP-1(7-36)的标准品和血浆样本进行定量检测。结果:测定的特异性、灵敏度、测量范围、重现性和回收率满足生物制品药代动力学研究的要求。结论:用LINCO公司生产的试剂盒定量血浆样品中的rhGLP-1(7-36),该检测方法符合生物制品检测方法,可以作为其药代动力学研究血药浓度的检测方法。

重组人胰高血糖素类多肽的致畸毒性

背景与目的:通过在胚胎器官形成期连续给药,观察重组人胰高血糖素类多肽(recombinanthumanGlucagon_LikePeptide,rhGLP)对大鼠的胚胎毒性和致畸毒性。材料与方法:试验采用SD种大鼠,每组妊娠鼠>16只。试验共分3个剂量组(260、130和65μg/kg),1个阳性对照组和1个溶剂对照组。在大鼠胚胎器官形成期连续给药10d(受孕的第6～15d) ,每日颈背部皮下注射给予受试药物及生理盐水阴性对照1.0ml/kg,阳性对照乙酰水杨酸(Aspirin,ASP)每天以10.0ml/kg灌胃给予。在妊娠的第20d,颈椎脱臼处死妊娠鼠。计数黄体数、胚胎的着床数、活胎数、早期死胎数(包括吸收胎)和晚期死胎数。观察胎仔性别、外观并称取体重后,将每窝1/2的活胎仔乙醇固定,2 %氢氧化钾软化,茜素红染色,甘油透明后在大视场工作仪上检查骨骼发育情况。另1/2活胎仔经Bouins液固定后,在大视场工作仪上检查内脏发育情况。结果:受试药物各剂量组均未显示出明显的胎仔生长发育障碍及骨骼和内脏畸形。结论:在<260μg/kg剂量下,重组人胰高血糖素类多肽对大鼠无胚胎毒性和致畸毒性。

人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的:在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)突变体(2Gly-hGLP-1)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。方法:为将GLP-1氨基酸序列第2位的丙氨酸(Ala)定点突变为甘氨酸(Gly),根据毕赤酵母偏爱密码子合成编码2Gly-hGLP-1的基因;采用重叠PCR法拼接2Gly-hGLP-1和HSA的基因,使得2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽接头连接;将该融合基因插入表达载体pPIC9构建为重组载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA,电击转化至毕赤酵母GS115细胞,通过表型筛选和诱导表达实验获得高效表达菌株;工程菌在5L发酵罐中培养后,对发酵产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果:融合蛋白在5L发酵罐中的表达量约为200mg/L,经纯化后纯度可达95%以上;小鼠糖耐量实验表明该融合蛋白具有明显的控血糖活性。结论:在毕赤酵母中分泌表达的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有降血糖活性。

重组人胰高血糖素样肽-1突变体的分离纯化及活性分析

对基因工程构建的含人胰高血糖素样肽1(hGLP1)突变体的工程菌株进行诱导表达,分离纯化N末端第二位突变的2GlyhGLP1突变体.IPTG诱导4h,收获的菌体经超声破碎后,裂解液用GlutathioneSepharose4B亲和层析纯化GST2GlyhGLP1融合蛋白,经CNBr裂解、SephadexG25柱脱盐、QAESepharoseFF阴离子交换柱层析和RPC18柱脱盐,得到纯度大于98%的重组2GlyhGLP1.Western印迹分析证实,该突变体可被特异性hGLP1抗体所识别.生物学活性分析表明,2GlyhGLP1具有明显的降血糖活性和促胰岛素分泌活性(P<0.001).

人胰高血糖素样肽-1突变体基因的克隆及表达

目的 :克隆人胰高血糖素样肽 - 1突变体 (2 Gly -hGLP - 1)基因 ,高效表达GST - 2 Gly -hGLP - 1融合蛋白。方法 :在获得重组hGLP - 1基因工程菌基础上 ,利用定点突变技术改造其第 2位丙氨酸为甘氨酸 ,经酶切克隆于pGEM - 7z(+)载体中 ,构建pGEM - 7z(+) / 2 Gly -hGLP - 1克隆载体 ,双酶切鉴定后把2 Gly-hGLP - 1基因定向插入pGEX - 4T - 3多克隆位点 ,构建pGEX- 4T - 3/ 2 Gly-hGLP - 1融合表达载体 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)并进行诱导表达。结果 :经双酶切鉴定和测序分析 ,证明2 Gly-hGLP - 1基因已克隆到pGEX - 4T - 3载体中。SDS -PAGE和凝胶扫描分析 ,融合蛋白以可溶形式存在 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 9.7%。表达产物经亲和层析纯化后纯度在 95 %以上 ,免疫印迹证实 ,该融合蛋白可被特异性hGLP - 1(7- 37)抗体所识别。结论 :为产业化规模制备hGLP -

重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)免疫原性的实验研究

目的:观察重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)[rhGLP-1(7-36)]对小猎兔犬的免疫原性。方法:健康小猎兔犬随机分为rhGLP-1(7-36)高、中、低剂量组(200、100、50μg/kg)和生理盐水对照组,每组6只,雌雄各半。皮下注射给药,每天1次,每周6次,连续9个月。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和碱性磷酸酶免疫斑点试验检测犬血清中的抗体。结果:连续给药3、9个月及恢复期血清均未发现抗rhGLP-1(7-36)抗体。结论:长期给予rhGLP-1(7-36)对小猎兔犬无免疫原性。

人胰高血糖素样肽-1突变体基因原核表达质粒的构建

目的:对人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)进行基因突变,构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/(Val8)hGLP-1,并在大肠杆菌中诱导表达。方法:选择大肠杆菌偏爱密码子,将hGLP-1(7～37)第2位的丙氨酸(Ala8)定点突变为缬氨酸(Val8),直接生物合成4个寡聚核苷酸片段并进行基因拼接,形成完整的hGLP-1突变体基因(Val8)hGLP-1,并连接到载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,BamH I与Xho I双酶切电泳鉴定与序列测定,然后诱导表达其融合蛋白。结果:经酶切电泳鉴定与测序分析,证实所合成的突变体基因(Val8)hGLP-1已克隆到pGEX-4T-1中,经SDS-PAGE分析可以诱导表达出融合蛋白。结论:成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/(Val8)hGLP-1,为进一步获得重组hGLP-1蛋白奠定基础,为产业化规模制备hGLP-1突变体提供实验依据。

RP-HPLC法测定重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)原料及其制剂的肽含量和有关物质

目的:建立重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)[rhGIP-1(7-36)]原料及制剂的肽含量和有关物质的RP-HPLC测定方法。方法:采用ODS柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以0.2 mol·L-1硫酸钠缓冲液(用乙醇胺调节pH至2.3)-乙腈(82:18)为流动相A,50%乙腈为流动相B,调整流动相的比例[A-B(55:45)]使主峰的保留时间在20-25 min,流速为1.0 mL·min-1,检测波长214 nm,柱温为45℃。结果:线性范围为0.6-18.6μg,制剂平均回收率为96.01%,原料和制剂精密度试验RSD分别为0.15%和0.25%,最低检测限6.25 ng。结论:本方法可用于rhGLP-1(7-36)原料及其制剂的肽含量和有关物质的测定,具有准确、简便、快速、灵敏的特点。