人胸膜间皮细胞水通道蛋白1～10 mRNA的表达

体外培养人胸膜间皮细胞(HPMC),检测人胸膜间皮细胞水通道蛋白1～10mRNA的表达,探讨其在胸腔内液体平衡中的意义.从胸腔积液中分离人胸膜间皮细胞,进行培养,用形态学和免疫组化染色进行细胞鉴定.用RT-PCR检测水通道蛋白1～10(AQP1～10)mRNA在人胸膜间皮细胞上的表达.成功建立人胸膜间皮细胞体外培养模型,鉴定证实为间皮细胞,人胸膜间皮细胞上AQP1～10mRNA均有表达,AQP1、AQP9、AQP10表达丰富.人胸膜间皮细胞存在AQP1～10mRNA的表达,结合已知水通道蛋白的功能,证实人胸膜间皮细胞参于胸腔内液体转运.

人胸膜间皮细胞的分离和培养

利用两种取材方法建立人胸膜间皮细胞(HPMC)体外培养模型,一是用胰蛋白酶-EDTA消化法,从人肺脏胸膜及壁胸膜上分离胸膜间皮细胞;二是从胸腔积液中分离胸膜间皮细胞;进行胸膜间皮细胞的培养。用形态学和免疫组化S-P法对培养所得细胞进行鉴定。光镜下可见细胞汇合后呈多角形铺路石样,电镜下可见丰富的微绒毛和内质网,免疫组化染色结果显示表达角蛋白、波形蛋白,而抗VIII因子相关单克隆抗体、抗人白细胞CD45表达阴性;证实为人的胸膜间皮细胞。两种取材方法均可以成功建立间皮细胞体外培养模型,方法学上均有可行性;手术标本所得细胞有较高的细胞纯度,取材上胸腔积液更易于得到。

地塞米松上调人胸膜间皮细胞水分子通道蛋白1基因的表达

目的研究地塞米松对人胸膜间皮细胞水分子通道蛋白1（AQP1）表达的影响。方法选择非感染性、良性胸腔积液患者，抽取胸水10m1，经离心分离、获取原代胸膜间皮细胞并进行体外培养，分别以0μmol／L、1μmol／L、100μmol／L浓度的地塞米松进行预处理后再继续进行培养，采用Western blotting及荧光定量PCR检测细胞AQP1蛋白与mRNA表达水平。结果从胸腔积液中分离与培养的人胸膜间皮细胞活细胞率和纯度均为95％以上；经地塞米松处理后的人胸膜间皮细胞AQP1与mRNA的表达水平显著增高，而且与地塞米松浓度呈正相关。结论地塞米松可以在转录水平和翻译水平上增强AQP1基因的表达，且有剂量依赖性特点。提示地塞米松可以对AQP1表达起上调作用，进而加速胸膜腔内液体的吸收。

多壁碳纳米管长期染毒对人胸膜间皮细胞的影响

目的探讨低剂量多壁碳纳米管(MWCNT)长期慢性染毒对人胸膜间皮细胞的毒性效应及可能机制。方法于2016年,使用10μg/cm^(2) MWCNT对人胸膜间皮细胞MeT-5A反复持续染毒1年作为染毒组,每4周收集1次细胞并观察细胞形态和计数增殖情况。对照组细胞同期培养但不进行染毒处理。染毒后细胞经流式细胞仪测量细胞周期和细胞凋亡的改变;用Transwell小室测量细胞侵袭和迁移能力的改变;用Affymetrix clariom D芯片分析染毒后MeT-5A细胞基因表达谱的改变。部分差异表达基因经实时定量荧光PCR进一步验证其表达变化。结果与对照组比较,染毒1年组细胞增殖能力明显增强,增殖速度约为对照组2~3倍(F=481.32,P<0.05)。MWCNT染毒1年和6个月组MeT-5A细胞均呈现细胞周期阻滞效应,表现为G1期增加,S期、G2期减少(F=14.94,P<0.05)。染毒6个月组细胞凋亡率较对照组明显增加(F=15.12,P<0.05),染毒1年组细胞的早期凋亡率和总凋亡率较对照组细胞均差异无统计学意义(F=3.97,P>0.05)。对染毒1年组细胞进行基因芯片检测,差异倍数2倍、平均信号值>7的差异基因共2878个,其中上调基因986个,下调基因为1892个。表达变化的基因主要参与Wnt信号通路、VEGF信号通路和mTOR信号通路等途径,功能主要涉及细胞增殖、细胞迁移和细胞骨架调节等过程。其中与上述细胞表型改变密切相关的PIK3R3、WNT2B、VANGL2和ANXA1基因的表达改变经RT-PCR验证,结果与基因芯片趋势一致。结论长期反复染毒后MWCNT对MeT-5A细胞可能存在潜在恶性转化能力。