人脂肪基质细胞的分离、培养、增殖及传代稳定性

目的:建立人脂肪基质细胞分离、培养及扩增的方法,观察其增殖动力学行为,检测其传代稳定性。方法:通过吸脂术获取人的脂肪组织并分离脂肪基质细胞,在普通培养基中进行培养,观察细胞形态,绘制细胞增殖曲线,用油红O染色显示胞内脂滴生成,并检测其是否向脂肪细胞自动分化。结果:人的脂肪组织中可分离出基质细胞,在体外生长形态类似成纤维细胞;其增殖曲线呈S形。在原代及传代培养中均未见脂肪细胞或胞内脂滴生成。结论:成年人脂肪组织中存在的基质细胞可维持在未分化状态下稳定的增殖和传代。

绿色荧光蛋白标记人脂肪基质细胞成骨分化能力体外实验研究

目的研究绿色荧光蛋白(GFP)基因体外转染人脂肪基质细胞的方法,并检测基因转染后细胞的生物学特性及分化潜能。方法体外分离培养人脂肪基质细胞,用重组腺病毒载体Ad-GFP及脂质体介导质粒pEGFP-C1两种方法转染GFP基因,通过流式细胞术观察比较GFP转染和表达的结果;倒置显微镜下观察细胞生长情况;将腺病毒介导的基因转染细胞经成骨定向诱导后,检测碱性磷酸酶表达和钙结节形成情况。结果重组GFP基因的腺病毒Ad-GFP转染的脂肪基质细胞的感染率达(42.5±1.5)%,16h即有GFP表达,7d时表达趋于稳定,感染6周时仍可见有GFP表达,明显优于脂质体转染组(转染效率最高为11.4%)。感染Ad-GFP后的脂肪基质细胞与未感染的对照组脂肪基质细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶(ALP)表达均逐渐增高,两组间差异无统计学意义(P>0.05);诱导21d后两组均见到茜素红钙盐染色阳性。结论重组GFP基因的腺病毒载体Ad-GFP可高效率感染脂肪基质细胞,基因转染后细胞的增殖分化能力未受到影响,可以作为一种高效可靠的人脂肪基质细胞标记方法。

矿化液对人脂肪基质细胞(hADSCs)成骨分化的影响

目的:比较人脂肪基质细胞(human adipose-derived mesenehymal stem cells,hADSCs)在矿化条件与非矿化条件下分别培养,评价矿化液对其增殖和分化的影响。方法:酶消法原代培养人脂肪基质细胞,再以含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的矿化液进行诱导,MTT检测矿化液对细胞增殖的影响,细胞培养上清液检测碱性磷酸酶(ALP)活性及骨钙素(OCN)含量。结果:矿化液抑制细胞的增殖,提高人脂肪基质细胞ALP活性和骨钙素的含量。结论:人脂肪基质细胞在矿化条件下可以表现出成骨细胞特性。

低能量激光照射对人脂肪基质细胞增殖分化的影响

目的:研究低能量激光照射(low level laser irradiation,LLLI)的照射剂量对人脂肪基质细胞(human adipose-derived stromal cells,h ASCs)增殖与分化作用的影响,为LLLI进一步在骨组织工程中的应用奠定基础。方法:将P4代h ASCs接种于孔板中,24 h后利用半导体激光器(980 nm,100 m W^12 W)连续照射4 d。以增殖培养基为空白对照组(PM组),实验组接受2、4、6、8 J/cm^2的激光照射,连续7 d进行细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)增殖检测。当细胞达到70%的融合后将一半细胞更换为成骨培养基(osteogenic medium,OM),根据培养基及累计接受的激光总能量密度分为6组:PM、OM、PM+LLLI2 J/cm^2、OM+LLLI2 J/cm^2、PM+LLLI4 J/cm^2、OM+LLLI4 J/cm^2。于第7天进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及定量检测,于第14、21天进行矿化沉积检测,于第7、14天进行实时定量PCR检测成骨相关基因的表达,探究低能量激光对h ASCs成骨分化的影响,结果采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。结果:PM+LLLI_(4J/cm^2)组细胞增殖速率最快,OM各组的ALP染色均呈阳性表达,且染色深度随激光能量密度的增高而加重。第14天时,OM各组随激光照射能量升高,矿化结节体积明显增大、数目增多;第21天时,OM组间茜素红染色结果无明显差异。ALP及茜素红定量结果均与相应染色结果趋势一致。h ASCs实时定量PCR结果提示,LLLI可促进ALP和Runx2的表达,且促进作用与照射剂量呈正相关。结论:LLLI具有促进h ASCs增殖分化的作用,且在一定剂量范围内,这种促进作用会随照射剂量的增大而加强,当达到峰值后随照射剂量的增大而减弱。

人脂肪基质细胞体外分离与培养的实验研究

目的探讨人脂肪基质细胞体外分离与培养,为其将来应用于组织工程提供基础。方法通过外科手术获得腹部皮下的脂肪组织,进行体外分离培养脂肪基质细胞,并在相差显微镜下每日观察、记录人脂肪基质细胞的生长状况,并用CCK-8测定其生长生活。结果人脂肪基质细胞呈现梭形外观,增殖旺盛,体外容易扩增。结论我们建立了一种自人体脂肪组织分离、培养人脂肪基质细胞简便稳定的方法,为其应用于组织工程提供了基础。

GDNF在成人脂肪基质细胞向星形胶质细胞分化中的作用

神经干细胞的发现打破了神经元不能再生的传统观念。目前研究资料表明,脂肪间充质干细胞（ADSC）是一种具有多向分化潜能的干细胞,它不仅可以在体外分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和成肌细胞等中胚层来源的细胞,而且还可以横向分化为神经细胞和神经胶质细胞,成为研究神经系统退行性疾病的靶向细胞[1,2]。

抑制视网膜母细胞瘤结合蛋白2基因表达促进人脂肪基质细胞成骨向分化的研究

目的 探讨视网膜母细胞瘤结合蛋白2（retinoblastoma binding protein 2,RBP-2）在人脂肪基质细胞（human adipose-derived stromal cell,hASC）成骨向分化中的作用.方法 设计靶向RBP-2小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）序列4对,将相应寡核苷酸构建到慢病毒载体pLL 3.7中,于293T细胞进行病毒包装用于RBP-2基因敲低.采用RBP-2敲低效果好的两个siRNA序列进行病毒包装,并以非沉默siRNA的pLL 3.7质粒包装的慢病毒为对照组,感染hASC,培养第14天定量检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性并行ALP染色及茜素红矿化结节染色,检测hASC成骨向分化的差异.结果 成功构建RBP-2基因RNA干扰慢病毒载体并获得相应慢病毒.慢病毒感染hASC后,RBP-2 mRNA及蛋白表达均被明显抑制.RBP-2 siRNA-1组和RBP-2 siRNA-4组的敲低效果较好,以此两组感染hASC.成骨诱导培养第14天RBP-2 siRNA-1组和RBP-2 siRNA-4组ALP活性[（299.2±22.7）、（224.3±17.7）U/g]高于对照组[（129.9±12.9）U/g,P＜0.05],RBP-2 siRNA-1组和RBP-2 siRNA-4组茜素红及ALP染色强于对照组.结论 成功构建的RBP-2 RNA干扰慢病毒能显著抑制RBP-2表达,并促进hASC向成骨细胞分化,即RBP-2可以抑制hASC的成骨向分化.

人脂肪基质干细胞复合藻酸钙体外构建工程软骨的实验研究

目的观察人脂肪基质干细胞(hADSC)复合藻酸钙凝胶体外构建工程软骨的可行性。方法取临床整形外科超声乳化的成人脂肪组织溶液,经消化、分离、培养得到hADSC,经成软骨诱导培养后与藻酸钠凝胶复合,使细胞终浓度为5×106/mL,然后滴入浓度200 mmol/L CaCl2溶液中,固化15 min形成藻酸钙凝珠,将其在离心管中悬浮培养8周,行大体、苏木精-伊红(HE)染色、Masson’s三色染色等组织学检测,观察组织工程软骨形成情况。结果 hADSC经成软骨诱导培养后复合藻酸钙凝胶可于体外较好地构建出组织工程软骨,形成软骨中有胶原及黏多糖等软骨特有基质成分。结论 hADSC可以作为软骨组织工程较理想的种子细胞,为软骨缺损的临床修复治疗提供了新的治疗方法。

细胞外基质作为组织工程支架的最新进展

目前存在很多由于先天缺陷、创伤或肿瘤切除等导致人体完整性缺陷的现象,故近年来组织工程成为研究热点。支架材料是组织工程的要素之一。人脂肪组织细胞外基质粉末呈三维空间结构,能促进干细胞增殖、分化、新生血管形成及生长因子释放等,已成为组织工程支架的新材料。

脂肪组织是骨、软骨、软组织缺损组织工程再建的理想干细胞来源(英文)

目的验证人脂肪基质细胞是否具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化的能力,从而为骨、软骨、软组织再建寻找一种理想的干细胞来源。方法分别用成骨向分化培养基(DMEM+10%FBS+地塞米松+维生素C+β-甘油磷酸)、软骨向分化培养基(DMEM+1%FBS+胰岛素+维生素C+转化生长因子β1)及脂肪向分化培养基(DMEM+10%FBS+地塞米松+胰岛素+吲哚美辛+异丁基甲基黄嘌呤)诱导人脂肪基质细胞向成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞分化。用vonKossa和碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞分化,而软骨细胞分化和脂肪细胞分化分别用Alcianblue染色和油红O染色显示。成骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞特异相关或标志基因的表达用RT-PCR检测。结果体外实验表明,人脂肪基质细胞在定向分化诱导剂的作用下可分别向成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞分化。结论人脂肪基质细胞中包含有多向分化能力的干细胞,可用于今后骨、软骨、软组织的组织工程再建。

人脂肪脱细胞基质联合皮肤移植修复创面的动物实验

目的探讨人脂肪脱细胞基质(decellular adipose matrix, DAM)联合皮肤移植手术治疗猪全层皮肤缺损创面的效果。方法取健康中青年女性腹部、大腿部吸脂术后废弃的颗粒脂肪,提取DAM;在3头猪的背部建立全层皮肤缺损的创面,分成空白对照组和DAM实验组(A、B、C组),实验组分别采用1 mm、2 mm、3 mm的DAM联合自体皮肤移植对缺损创面行一期治疗。结果术后14 d移植皮片成活率:空白对照组(98.1±0.3)%,A组(96.5±1.1)%,B组(89.9±3.9)%,C组(45.3±5.5)%。术后28 d,A、B组创面平坦,颜色淡红或近似正常皮肤,表面光滑,外观平整,触之柔软,皮肤可捏起;而空白组、C组的创面表面皱缩不平,与基底粘连更明显,触之较韧、不易捏起。组织学显微镜观察见愈合创面皮肤结构完整,基质材料完全重塑,实验组Ⅰ型、Ⅲ型胶原的比值较低。结论 DAM联合自体皮肤移植一期手术可促进猪背部全层皮肤缺损创面的修复,且修复后的创面质地得到明显改善。