泛素特异性蛋白酶42调节人脂肪干细胞成骨向分化

目的:探索泛素特异性蛋白酶42(ubiquitin-specific protease 42,USP42)在人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,hASCs)体内外成骨向分化中的作用。方法:用慢病毒转染hASCs,构建敲低和过表达USP42的稳定转染细胞系,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性定量、茜素红S矿化结节染色及定量,检测实验组(敲低组和过表达组)及对照组在成骨诱导下hASCs成骨向分化能力的差异,通过定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测实验组及对照组成骨相关基因的表达水平,通过蛋白免疫印迹实验检测实验组及对照组成骨相关蛋白的表达水平,通过裸鼠异位成骨实验评价USP42在hASCs体内成骨向分化中的作用。结果:敲低组USP42的mRNA和蛋白表达显著低于对照组,过表达组显著高于对照组。成骨诱导7 d后,敲低组的ALP活性显著高于对照组,过表达组显著低于对照组;成骨诱导14 d后,敲低组茜素红S染色显著深于对照组,过表达组显著浅于对照组。qRT-PCR结果显示,成骨诱导14 d时,敲低组ALP、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)和Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,COLⅠ)的mRNA表达水平显著高于对照组,过表达组显著低于对照组。蛋白免疫印迹实验结果显示,成骨诱导14 d时敲低组runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、OSX和COLⅠ蛋白表达水平显著高于对照组,过表达组显著低于对照组。裸鼠皮下移植物苏木精-伊红染色结果显示,敲低组类骨组织百分比较对照组显著增高。结论:敲低USP42显著促进hASCs的体内外成骨向分化,过表达USP42显著抑制hASCs的体内成骨向分化,USP42可作为骨组织工程学潜在治疗靶点。

mRNA水平探究人脂肪干细胞对SD大鼠放射性皮肤损伤的炎症修复作用

目的从m RNA水平探究人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,H-ADSCs)在SD大鼠放射性皮肤损伤中的作用及炎症机制。方法选取15只SD大鼠,采用随机数字表法分成5组,每组3只。给予各组大鼠背部皮肤45Gy电子线照射,分别于照射后0周、1周、2周、3周、4周后处死并取组织标本,检测皮肤组织内炎症因子m RNA水平。选取35只SD大鼠,采用随机数字表法分成空白对照组(n=7)、PBS组(n=14)和ADSCs组(n=14)。空白对照组不做任何处理,PBS组和ADSCs组大鼠背部皮肤给予45Gy电子线照射,辐射后48h起,每72h完成1次注射,共5次,PBS组的大鼠注射1ml PBS,ADSCs组大鼠注射1ml含ADSCs的PBS,共注射5次。观察大鼠皮肤大体形态及病理组织学损伤,进行皮肤损伤评分,同时检测大鼠皮肤组织内炎症因子m RNA表达水平变化。结果辐射后2d,两组大鼠的Douglas and Fowler评分比较,差异无统计学意义(P>0.05);辐射后4~10d,ADSCs组大鼠的Douglas and Fowler评分均显著低于PBS组(P<0.05);至辐射后12d,两组大鼠的Douglas and Fowler评分达到一致。辐射后2周,PBS组和ADSCs组大鼠均出现相同面积及相同程度的皮肤损伤;辐射后3周至处死前,ADSCs组大鼠皮肤损伤面积比值均显著低于PBS组(P<0.05)。辐射后3周时,PBS组和ADSC组大鼠皮肤内的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10、IL-1β,TNF-α等炎症因子的m RNA水平均显著高于其他时间点(P<0.05),且显著高于空白对照组(P<0.05)。与PBS组相比,ADSC组TNF-α,IL-1β,IL-6水平均显著降低(P<0.05),IL-10显著升高(P<0.05)。PBS组与ADSC组的NOS及Arg水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论H-ADSCs能有效促进大鼠放射性皮肤损伤创面修复,其机制可能是H-ADSCs促进抑炎因子表达、降低促炎因子表达,从而抑制炎症反应发挥生物学效应。

I型胶原支架材料与人脂肪干细胞体外生物相容性研究

目的观察人脂肪干细胞与I型胶原支架材料的生物相容性,为脂肪组织工程选择适宜的种子细胞载体。方法将人脂肪干细胞与I型胶原支架体外培养复合,采用倒置相差显微镜和扫描电镜,观察细胞在支架上黏附、生长及增殖情况并计算细胞黏附率,XTT比色法检测细胞增殖率。结果脂肪干细胞能良好的在支架上黏附、生长和增殖。结论I型胶原支架材料具有良好的细胞相容性,可作为脂肪组织工程的种子细胞载体。

人脂肪干细胞的分离培养与生物学特性

背景:高效、稳定地获得大量较高纯度的人脂肪干细胞,是其在组织工程学及再生医学中广泛应用的基础和前提。目的:探索体外培养脂肪干细胞的适宜条件,从而提高其增殖能力。方法:采用胶原酶消化的方法,从人腹部皮下块状脂肪中分离出脂肪干细胞,经贴壁筛选法纯化细胞、低糖培养基体外培养扩增。Giesam染色后观察细胞形态;绘制细胞生长曲线并进行细胞周期分析,观察分析传代后染色体核型改变;选取第3代脂肪干细胞做流式细胞鉴定、EdU细胞增殖能力检测以及克隆形成实验。结果与结论:分离培养的原代脂肪干细胞形态不一,经传代后的细胞形态趋于长梭形,排列紧密呈漩涡状生长。细胞生长曲线呈S形,细胞周期分析及EdU掺入法结果显示体外培养的脂肪干细胞具有较强的增殖能力。经染色体核型分析结果提示,体外培养不会引起脂肪干细胞的核型改变。第3代脂肪干细胞经流式细胞仪检测CD29,CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34和CD45呈阴性;克隆形成率为8.8%;在一定的诱导条件下,脂肪干细胞能够向脂肪细胞及成骨细胞分化。结果说明采用胶原酶消化法可成功分离培养人脂肪干细胞,且具有较强的增殖能力。

人脂肪干细胞的提取和鉴定

背景:脂肪干细胞是存在于脂肪中的全能干细胞,具备自我更新能力与多向分化潜能,遗传背景相当稳定,体内植入后免疫排斥少,是一种比较理想的种子细胞。目的:提取人大网膜脂肪干细胞,并进行成脂和成骨分化能力鉴定。方法:收集手术患者大网膜的脂肪组织,经Ⅰ型胶原酶消化、过滤、离心后进行原代培养,观察细胞生长状态;用细胞计数法绘制人脂肪干细胞增殖曲线,计算处于对数生长期的倍增时间;用相应的定向诱导液诱导人脂肪干细胞向脂肪细胞及骨细胞方向分化,并用油红O染色、茜素红染色进行鉴定。结果与结论:从手术患者大网膜脂肪组织中成功分离人脂肪干细胞,贴壁生长的人脂肪干细胞为长梭形,形态类似成纤维细胞。第3代人脂肪干细胞生长曲线呈S形,对数生长期人脂肪干细胞的倍增时间为45.90 h。人脂肪干细胞经成脂、成骨定向诱导分化2,3周后,油红O染色显示细胞内有大小不等的橘红色脂肪滴,茜素红染色可见着橘红色的典型钙化结节,提示所培养的脂肪干细胞具有向脂肪细胞、骨细胞系分化的能力。

血管内皮生长因子基因转染的人脂肪干细胞具有较强的增殖和分化能力

目的研究过表达血管内皮生长因子(VEGF)对人脂肪干细胞(hADSC)的细胞表型、增殖能力和多向分化潜能的影响。方法利用脂质体法将pIRES2-EGFP-VEGF质粒转染第2代hADSC,对照组为脂质体空载体。免疫荧光染色验证转染成功,流式细胞术检测两组细胞表型的差异,MTT法检测细胞增殖能力,诱导其成脂和成骨分化并进行油红O和茜素红染色。结果转染组可见EGFP和VEGF的表达,对照组无EGFP表达。两组细胞均高表达CD29、CD44、CD90,低表达CD31、CD45。转染组hADSC的增殖能力显著强于对照组,且诱导分化后的脂滴和钙结节的数量和面积均显著高于对照组。结论过表达VEGF可增强hADSC的增殖能力,促进其成脂和成骨分化,但并未显著改变细胞表型。

膨体聚四氟乙烯与人脂肪干细胞的体外生物相容性

背景:膨体聚四氟乙烯多孔高分子聚合材料是临床常用的植入假体,具有良好的生物相容性,不易变形、变质,不产生炎症吸收反应,可允许细胞游走和组织向内生长。目的:观察人脂肪干细胞与膨体聚四氟乙烯材料的生物相容性。方法:将第4代人脂肪干细胞与膨体聚四氟乙烯体外复合培养,采用倒置相差显微镜观察细胞在支架上黏附、生长及增殖情况,计算细胞黏附率,MTT比色法检测细胞增殖率。结果与结论:刚接种的细胞呈圆形透亮,在支架材料表面分布均匀,细胞活性佳,3 h后大量细胞贴壁,24 h后可见少量呈短梭形的脂肪干细胞贴壁,3 d首次换液,细胞清晰可见,低密度生长时呈短梭形或多角形,分布均匀,种植7 d后细胞数量明显增加,极少细胞从支架上掉落,细胞黏附率平均达95.7%,并且细胞仍保持正常的分裂增殖速度。说明膨体聚四氟乙烯材料具有良好的细胞相容性。

较高浓度神经肽Y抑制人脂肪干细胞增殖并促进其分化

目的研究不同浓度神经肽Y(NPY)对人脂肪干细胞(h ADSC)增殖及分化的影响。方法分离h ADSC,用(10^(-6)~10^(-15))mol/L NPY诱导刺激h ADSC,MTT法检测其增殖;分别用完全培养基、NPY和胰岛素处理h ADSC,油红O染色观察h ADSC的分化;Western blot法检测各组过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、诱导细胞死亡的d FF45样效应因子C(Cidec)和受体相互作用蛋白140(RIP140)的表达水平。结果 (10^(-11)~10^(-15))mol/L NPY促进h ADSC增殖,(10^(-6)~10^(-10))mol/L NPY抑制h ADSC增殖;(10^(-7)、10^(-9)、10^(-11))mol/L NPY均诱导h ADSC分化,并增加PPARγ、C/EBPα蛋白表达,同时促进白色脂肪组织特异性标志Cidec、RIP140蛋白的表达。结论较低浓度NPY促进h ADSC增殖,较高浓度NPY抑制h ADSC增殖并促进其分化。

人脂肪干细胞向内皮分化最佳诱导体系的建立

目的探讨人脂肪干细胞(human Adipose-derived stem cells,hADSCs)体外分化为内皮细胞的最佳诱导体系。方法利用胶原酶消化法和贴壁筛选法从人脂肪组织中分离、培养及扩增hADSCs,分3组分别进行内皮诱导:即纤维连接蛋白(fibronectin,FN)包被组、明胶包被组和未铺组;同时诱导液分为两组:单纯内皮细胞生长培养基(EGM2-MV)组及内皮细胞生长培养基(EGM2-MV)+50ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF165)组。诱导15d后,通过流式细胞术检测各组内皮细胞特异性表面抗原CD34的表达;通过相差显微镜观察诱导前后细胞的一般形态学特征。结果体外分离、培养出高度同源性的hADSCs,CD29、CD44、CD90、CD105及CD166呈阳性表达,而CD34、CD45及HLA-DR呈阴性表达;诱导后细胞流式结果显示单纯EGM-2MV诱导的3组细胞内皮细胞特异性标志CD34阴性表达,而EGM2-MV+50ng/mlVEGF165诱导的细胞,其中FN包被组CD34表达率为8.4%,明胶包被组为5.4%,未铺组为4.2%;相差显微镜下可见诱导后细胞呈三角形或多边形,融合处呈铺路石样生长。结论FN作为细胞外基质与EGM2-MV+50ng/mlVEGF165组成的诱导液协同作用,构成了hADSCs体外分化为内皮细胞的最佳诱导体系,可为临床上缺血性疾病的自体细胞移植治疗提供大量的种子细胞来源。

人脂肪干细胞与聚L-谷氨酸/海藻酸钠可注射水凝胶的生物相容性研究

天然高分子聚合物聚L-谷氨酸(PLGA)与氧化海藻酸钠(OAg)共价交联合成PLGA/OAg水凝胶,将人脂肪来源干细胞(hADSCs)接种于水凝胶内,倒置显微镜、扫描电镜观察细胞在支架中的存活、增殖、黏附情况,DNA定量法检测细胞的增殖。体外证实该水凝胶材料生物相容性良好,具有性能可控性和微创性等优势,对于进一步开发脂肪组织工程材料具有指导性意义。

人脂肪干细胞的分离培养与鉴定

目的探索一种体外分离培养人脂肪干细胞(h ADSC)的有效方法。方法选择健康女性5例,年龄25~45岁;无任何其他系统性疾病。对其应用抽脂术获取人脂肪组织,并用Ⅰ型胶原酶进行消化,贴壁培养,传代扩增,绘制不同代数细胞增殖曲线,诱导hADSC向成骨、成脂细胞分化,确定其分化潜能,并分别用茜素红和油红O染色进行鉴定。结果原代hADSC第2天开始贴壁,形态呈纺锤型,类似纤维细胞,增殖较快,呈漩涡状排列。第3代至第5代hADSC生长曲线类似,都呈S形;成骨、成脂诱导2周后进行茜素红染色和油红O染色,结果都为阳性。结论通过对抽脂术获得的人脂肪组织进行分离培养,可以得到有效的hADSC,且具有向成骨、成脂细胞方向分化的能力,可作为进一步实验研究的种子细胞。

胰高血糖素样肽-1对人脂肪干细胞增殖、成脂分化及脂代谢的影响

目的研究胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对人脂肪干细胞(ASCs)增殖、成脂分化及脂代谢的影响。方法胶原酶分离法原代培养人ASCs,体外扩增及传代建立稳定的培养体系。用含有不同浓度GLP-1(0、0.1、1.0、10.0及100.0 nmol/L)的基础培养基和成脂分化培养基培养细胞,噻唑蓝法(MTT)检测干预24、48及72 h后细胞增殖情况,分化21 d后行油红O染色、异丙醇萃取法检测细胞内脂质含量,同时测定分化过程中上清液中甘油释放量作为脂质分解的指标,测定细胞裂解液中三酰甘油的含量作为脂质合成指标。结果 1高浓度的GLP-1(100.0 nmol/L)对人ASCs的增殖具有抑制作用,且随着时间的延长抑制作用更明显。2油红O染色及异丙醇萃取法显示100.0 nmol/L的GLP-1抑制人ASCs的成脂分化。3在人ASCs成脂分化过程中,高浓度的GLP-1(100.0 nmol/L)可促进甘油的释放,而对细胞内三酰甘油的含量影响不大。结论高浓度GLP-1可抑制人ASCs的增殖及成脂分化,促进脂质分解,对脂质合成无明显作用。

自撑式石墨烯水凝胶诱导人脂肪干细胞成骨分化的体外研究

目的通过体外实验评价本课题组制备的自撑式石墨烯水凝胶(self-sustaining graphene hydrogel,SGH)的骨诱导性能。方法 (1)将人脂肪干细胞(hADSC)接种于SGH和玻片表面,采用荧光显微镜图像计数检测ADSC在材料表面粘附能力;通过扫描电镜观察材料本身的表征及细胞在SGH表面生长的形态;(2)SGH组加入普通培养液作为实验组,玻片组加入成骨培养基作为诱导组,玻片组加入普通培养液作为对照;通过实时定量荧光PCR、ALP活性检测和茜素红半定量测定钙沉积评价各组hADSC的分化及成骨能力。结果 hADSC能以等同于在玻片表面的粘附效率和正常的形态在SGH表面生长。实验组细胞在不同时间点成骨相关基因的表达水平、ALP活性以及钙盐沉积量均显著高于对照组而略低于诱导组(P<0.05)。结论自撑式石墨烯水凝胶作为一种生物相容性材料,具有较强的诱导人脂肪干细胞成骨分化的能力。

镁黄长石浸提液影响人脂肪干细胞增殖和成骨分化的实验研究

目的通过探讨不同浓度镁黄长石浸提液对人脂肪干细胞(Human adipose-derived stem cells,hADSCs)增殖和成骨分化的影响,初步阐明镁黄长石体外促进hADSCs成骨分化的机制。方法依照ISO/EN 10993-5标准,制备镁黄长石浸提液,将获得的hADSCs培养于不同浓度的浸提液中(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32),利用MTT法检测细胞的增殖情况;在成骨诱导条件下,通过碱性磷酸酶染色、活性检测和茜素红染色以及钙离子定量检测,观察不同浓度浸提液对hADSCs成骨特性的影响。结果 1/2、1/4、1/8浓度的浸提液可以浓度依赖性地抑制hADSCs的体外增殖;1/4、1/8、1/16浓度的浸提液可以促进hADSCs的体外成骨分化;碱性磷酸酶染色和活性检测、茜素红染色和钙离子定量检测显示,1/4浓度的浸提液对hADSCs的体外成骨分化促进作用最强,此时的钙、镁和硅离子浓度分别为:2.36 mM、1.11 mM和1.03 mM。结论镁黄长石浸提液中的离子在适当浓度时,可以抑制hADSCs的体外增殖,同时促进hADSCs的体外成骨分化。

人脂肪干细胞体外向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

目的:探讨人脂肪干细胞(hASCs)的分离方法、体外增殖能力及定向诱导分化为成骨细胞的潜能。方法:从脂肪抽吸物中分离、培养具有多向分化潜能的脂肪干细胞,比较原代(P0)及传代第1、2、5代(P1、P2、P5)细胞的生长曲线。实验组取P2细胞,应用成骨诱导液向成骨细胞定向诱导分化,并以未诱导组为对照组,利用ALP染色、von Kossa染色、免疫荧光检测、RT-PCR等方法对细胞成骨潜能进行评价。结果:传代细胞较原代细胞增殖速度快。P1、P2、P5均具有一些共同特征,传代培养的潜伏期约为24h,传代培养细胞的对数增殖期约为2～3d,接种后第4～5天进入平台期;细胞诱导14d后,实验组ALP染色呈阳性反应,对照组阴性;von Kossa染色,实验组出现深棕色结节状沉积,且随诱导时间增加而加深,对照组无结节状沉积出现;免疫荧光检测,实验组和对照组均表达Ⅰ型胶原,实验组骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)检测为阳性,对照组为阴性或弱阳性;RT-PCR检测表明,实验组诱导14d时有ALP、Osteopontin表达,对照组阴性;实验组、对照组及成骨细胞均有I型胶原阳性表达。结论:hASCs在体外培养条件下生长良好,P2细胞在诱导培养下可向成骨细胞分化,为以hASCs为种子细胞构建组织工程骨奠定了基础。

多顺反子质粒重编程人脂肪干细胞为诱导多能干细胞

为建立多顺反子质粒载体转染技术获得人脂肪干细胞(adipose stem cells,ASCs)来源的诱导多能干细胞(inducedpluripotency stem cells,iPSCs),应用2A元件连接Oct4/Sox2/KLF4/c-Myc四因子基因,构建为单一开放阅读框的多顺反子质粒载体.使用该质粒对ASCs进行转染及重编程为iPSC.采用形态学观察、特异性抗体免疫荧光鉴定、体外拟胚体诱导分化和体内畸胎瘤形成等方法进行鉴定.结果显示,ASCs成功重编程为iPSCs,具有与人胚胎干细胞相似的形态学及多向分化潜能;通过拟胚体和畸胎瘤实验证实iPSCs能在体内外分化成三胚层细胞;DNA印迹实验显示质粒载体序列未整合至iPSCs基因组中.因此,通过多顺反子质粒载体重编程技术成功建立的人iPSCs具有多向分化潜能,可减免发生插入突变和免疫排斥问题,为iPSCs在遗传性或退行性疾病的治疗奠定了实验基础.

人脂肪干细胞的生物学鉴定和多能性分子Oct4和Sox2的表达研究

目的探讨人脂肪干细胞(ASCs)多能性分子Oct4和Sox2的表达情况。方法利用胶原酶将人脂肪组织消化后,分离培养得到ASCs,绘制细胞生长曲线;应用流式细胞仪检测不同代数的P2、P3、P5的ASCs的表面标志物;应用诱导分化培养基诱导ASCs朝成脂、成软骨和成骨方向分化,分化后分别行油红O、阿尔辛蓝和茜素红特殊染色鉴定;应用免疫荧光技术分析P1、P2、P5、P6细胞中Oct4和Sox2的表达情况。结果原代及传代后各代ASCs呈成纤维样贴壁生长,形态均一,细胞群体倍增时间为31 h。各代ASCs均表达CD29、CD44、CD90(>90%)和CD105(>50%),不表达CD34和CD45(<1%);成脂、成软骨和成骨诱导后染色鉴定结果均为阳性;Oct4在P1、P2细胞中的表达位于细胞核内,而在P5、P6细胞的表达则位于胞质;Sox2在P1、P2细胞的胞质中表达,而在P5、P6细胞的胞质中几乎不表达。结论 ASCs具有间充质来源干细胞的一些共同特性及间充质谱系的多向分化潜能。多能性分子Oct4和Sox2在不同代数ASCs中的表达量及表达位置有一定差异,可能反应了各代ASCs分化潜能有所不同。

人脂肪干细胞治疗急性肝功能衰竭大鼠疗效的探索

目的探讨人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,hADSC)对急性肝衰竭大鼠生存和肝功能重建的影响,了解其在急性肝衰竭大鼠体内的分布、迁移及促进受体肝脏再生的作用。方法贴壁培养法分离培养hADSC;30只SD大鼠用D-氨基半乳糖(D-gal)构建急性肝衰竭模型,随机分为hADSC治疗组和磷酸盐缓冲液(PBS)对照组,治疗组经脾尾注射5×106个hADSC,对照组注射相同体积PBS,动态检测肝功能指标和肝组织学表现,观察动物生存情况。用表达ZsGreen的慢病毒感染hADSC,20只肝衰竭大鼠随机分为脾脏移植组和股静脉移植组,分别经脾尾和股静脉注入5×106个hADSC,采用免疫组织化学方法检测hADSC在大鼠心、肝、脾、肾、肺等器官的分布和迁移情况。检测肝、脾组织中Ki-67蛋白的表达,TUNEL法检测肝细胞凋亡。结果体外分离人体脂肪组织培养获得的hADSC表达间充质干细胞相关表面抗原并可分化成脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞;肝衰竭模型中脾脏移植组大鼠总体病死率(13.3%)明显低于PBS对照组(40%),血清ALT和AST等指标显著低于PBS对照组,肝组织学明显改善,Ki-67表达和TUNNEL检测提示移植组肝细胞再生明显,凋亡受抑制;hADSC经脾脏、股静脉途径移植后,大部分细胞迁移至肝脏、脾脏及肺部,其中经股静脉移植组细胞向肝脏趋化的效率更高。结论体外分离脂肪组织通过贴壁培养可获取hADSC;经脾脏和股静脉途径移植hADSC均可促进肝细胞再生并抑制凋亡,改善肝衰竭大鼠肝功能,提高存活率。

羊膜细胞共培养诱导人脂肪干细胞向表皮分化

目的探讨羊膜细胞体外诱导人脂肪干细胞向表皮方向分化的可能性。方法体外分离培养人脂肪来源的干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs),将P3代hADSCs与人羊膜细胞(human amniotic cells,HACs)共培养,培养液中添加EGF,光镜下观察hADSCs细胞形态变化,并对细胞进行鉴定。结果随时间延续,hADSCs细胞数量逐渐减少,同时细胞突起逐渐变短,胞体由长梭形逐渐变为上皮样,21d后,经免疫荧光染色鉴定,发现所获细胞高表达CK19。结论通过人脂肪干细胞与人羊膜细胞共培养可获得CK19阳性的表皮干细胞。

Sox9基因过表达对人脂肪干细胞增殖、凋亡及成软骨分化的影响及机制研究

目的:研究Sox9基因过表达对人脂肪干细胞(hADSCs)增殖、凋亡及成软骨分化的影响及机制。方法:酶消化法分离hADSCs体外培养扩增,Lenti-Sox9-EGFP、Lenti-EGFP慢病毒液分别感染hADSCs,设为过表达组和空载组,另以无菌生理盐水代替设为对照组。比较各组Sox9蛋白表达、细胞增殖、转化生长因子β1(TGF-β1)、信号转导蛋白3(Smad 3)蛋白表达、细胞凋亡情况;hADSCs成软骨诱导分化2周检测成软骨分化情况;比较各组TGF-β1、Smad 3蛋白表达情况。结果:显微镜下观察hADSCs细胞形态正常,流式细胞计数鉴定hADSCs表面抗原符合生物学特征。与空载组和对照组比较,过表达组Sox9蛋白相对表达量更高,MTT试验24 h、48 h、72 h的A值与培养24 h、48 h、72 h后TGF-β1、Smad 3蛋白相对表达量较高,凋亡率降低(P<0.001)。成软骨诱导分化2周后甲苯胺蓝染色显示过表达组hADSCs胞浆及细胞核为蓝紫色,空载组和对照组为微弱淡蓝色;Ⅱ型胶原免疫组化染色过表达组为强阳性,空载组和对照组为弱阳性。与对照组和空载组比较,过表达组TGF-β1、Smad 3蛋白相对表达量更高(P<0.001)。结论:Sox9基因过表达可促进hADSCs增殖及成软骨分化,抑制hADSCs凋亡,其机制可能与上调TGF-β1、Smad 3蛋白的表达有关。