脂肪间充质干细胞过表达骨形态发生蛋白2促进骨质疏松大鼠牙槽骨缺损修复

背景:颌骨在骨质疏松症中最容易受累,脂肪间充质干细胞和骨形态发生蛋白2具有促进骨质疏松症骨再生的效果,然而骨形态发生蛋白2修饰的脂肪间充质干细胞对骨质疏松症牙槽骨缺损的修复作用鲜有报道。目的:探究过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞对骨质疏松大鼠牙槽骨缺损的修复作用。方法:①将过表达骨形态发生蛋白2基因的慢病毒感染大鼠脂肪间充质干细胞,通过检测绿色荧光蛋白和骨形态发生蛋白2表达进行鉴定;②切除卵巢建立骨质疏松大鼠模型,于上颌两侧第一磨牙位置制备3 mm×3 mm×3 mm的圆柱形缺损;③假手术组和骨质疏松组大鼠植入明胶海绵,脂肪间充质干细胞组植入空载体慢病毒感染的脂肪间充质干细胞与明胶海绵复合体,过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞组植入过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞与明胶海绵复合体,1个月后进行相关指标检测。结果与结论:①脂肪间充质干细胞组和过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞组转染效率均达到70%以上;与脂肪间充质干细胞组相比,过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞组骨形态发生蛋白2蛋白表达水平明显升高(P<0.05);②假手术组骨缺损区可见大量新骨生成;与假手术组相比,骨质疏松组有少量新骨生成,新骨面积明显减小,碱性磷酸酶、骨钙素及骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白水平明显降低;与骨质疏松组相比,脂肪间充质干细胞组和过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞组有大量新骨生成,新骨面积明显增加,碱性磷酸酶、骨钙素及骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白水平明显升高,且过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞组优于脂肪间充质干细胞组(均P<0.05);③结果表明,骨形态发生蛋白2在骨质疏松大鼠牙槽骨表达较少,过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞能够促进骨质疏松大鼠牙槽骨缺损的成骨再生。

8周运动预适应增强脂肪干细胞治疗心肌梗死大鼠的效果

背景:干细胞移植是心肌梗死的崭新疗法,然而梗死区域极其恶劣的微环境造成干细胞存活率低下并导致远期疗效甚微。运动预适应是一种通过运动诱导机体产生内源性保护效应的方式,可作为心脏康复预防与治疗的新策略。目的:评估运动预适应是否能够增强大鼠心肌梗死后脂肪干细胞移植的心脏保护效应,探讨血管生成在其中的作用机制。方法:6周龄雄性SD大鼠随机分为对照组、造模组、干细胞组以及干细胞运动组。利用冠状动脉闭塞术制作急性心肌梗死模型,对照组同期行假手术;干细胞运动组于造模前进行8周有氧运动,造模后30 min进行脂肪干细胞移植;干细胞组仅进行脂肪干细胞移植。干细胞移植后1 d和7 d,利用免疫印迹法测定心肌总Akt(t-Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、血管内皮生长因子(VEGF)、总内皮型一氧化氮合酶(t-eNOS)和磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)蛋白表达量,计算p-Akt/t-Akt和p-eNOS/t-eNOS比值;4周后利用彩色多普勒超声诊断系统检测心脏结构与功能以及心肌血流量,TTC染色法检测心肌梗死面积,Masson染色法检测心肌间质胶原沉积,免疫荧光染色法测定心肌毛细血管密度,TUNEL染色法评估心肌细胞凋亡。结果与结论:(1)干细胞移植后4周:与对照组比较,造模组左心室缩短分数、左心室射血分数、心肌毛细血管密度和心肌血流量下降(P<0.05),心肌梗死面积、胶原容积分数和细胞凋亡增加(P<0.05);与造模组比较,干细胞组上述指标(除左心室缩短分数和左心室射血分数外)得到改善(P<0.05);与干细胞组比较,干细胞运动组以上各参数进一步改善(P<0.05)。(2)干细胞移植后1 d:与对照组比较,造模组t-Akt、p-Akt、VEGF、t-eNOS、p-eNOS蛋白表达量以及p-Akt/t-Akt、p-eNOS/t-eNOS比值均无显著性变化(P>0.05);与造模组比较,干细胞组上述指标均无显著性变化(P>0.05),干细胞运动组磷酸化p-Akt蛋白表达量以及p-Akt/t-Akt比值上调(P<0.05)。(3)干细胞移植后7 d:与对照组比较,造模组p-Akt、VEGF、p-eNOS蛋白表达量以及p-Akt/t-Akt、p-eNOS/t-eNOS比值下降(P<0.05);与造模组比较,干细胞组各参数均无显著性变化(P>0.05),干细胞运动组p-Akt、VEGF、p-eNOS蛋白表达量以及p-Akt/t-Akt、p-eNOS/t-eNOS比值升高(P<0.05)。结果表明:运动预适应可增强脂肪干细胞对心肌梗死大鼠心脏重塑的治疗效果,其机制与促进心肌血管生成并增加血流灌注有关。

罗哌卡因对大鼠脂肪干细胞增殖、凋亡及成骨分化的影响观察

目的观察罗哌卡因对大鼠脂肪干细胞(ADSCs)增殖、凋亡及成骨分化的影响。方法分离并提取大鼠ADSCs,传代培养后,取对数生长期ADSCs分别加入含0 mg/mL、200 mg/mL、500 mg/mL罗哌卡因的培养基100µL,分别记为对照组、200 mg/mL组、500 mg/mL组。取各组细胞,继续培养24、48、72 h时,采用CCK-8实验观察细胞增殖能力。取各组细胞,继续培养24 h,使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。取各组细胞,加入成骨诱导培养基,观察各组细胞成骨分化能力,包括成骨潜能(以ALP活性表示)、矿化能力(以OD值表示)和成骨相关蛋白骨钙素(OCN)表达水平。结果与对照组相比,200 mg/mL组、500 mg/mL组细胞培养24、48、72 h时的增殖能力均显著下降,且500 mg/mL组低于200 mg/mL组。对照组、200 mg/mL组、500 mg/mL组细胞凋亡率分别为2.78%±0.23%、4.15%±0.62%、5.88%±0.78%,组间相比,P均<0.05。与对照组相比,200 mg/mL组、500 mg/mL组细胞ALP活性、矿化能力、OCN蛋白表达水平均显著下降,且500 mg/mL组低于200 mg/mL组。结论200 mg/mL、500 mg/mL的罗哌卡因均可抑制大鼠ADSCs增殖能力,降低其成骨能力,促进其凋亡,且500 mg/mL罗哌卡因的抑制效果高于200 mg/mL。

间充质干细胞对代谢功能障碍相关脂肪性肝炎的作用及机制研究

目的探讨间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)对代谢功能障碍相关脂肪性肝炎(Metabolic dysfunction-associated steatohepatitis,MASH)的作用及机制。方法(1)体内实验:8周龄C57BL/6小鼠高脂喂养24周后,给予链脲佐菌素一次性注射制作MASH模型。将造模成功小鼠随机分为MASH组(n=6)和MSCs组(n=6),另取6只同期正常饲料喂养小鼠为对照组(n=6)。MSCs组小鼠每周经尾静脉注射1×10^(6)MSCs,连续6周,MASH组和对照组给予同等剂量的磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)输注。输注结束后,检测3组小鼠肝功能、血脂;HE染色、油红染色观察肝脏病理改变;qRT-PCR检测小鼠肝脏及血清中炎症因子的表达。(2)体外机制研究:提取6周龄C57BL/6小鼠骨髓巨噬细胞,并分为3组(n=3):对照组、脂多糖(LPS)+干扰素-γ(IFN-γ)组及MSCs组。对照组为未处理的巨噬细胞;LPS+IFN-γ组:给予LPS和IFN-γ诱导为促炎型巨噬细胞;MSCs组:LPS+IFN-γ诱导后再经MSCs共培养24 h。处理结束后,通过流式细胞技术比较3组巨噬细胞表型变化,qRT-PCR比较巨噬细胞促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。结果(1)MASH小鼠给予MSCs输注后,血清AST、ALT水平低于MASH组[AST:(51.33±5.47)U/L vs.(83.33±4.50)U/L,P<0.05;ALT:(67.67±6.71)U/L vs.(111.33±5.47)U/L,P<0.05]。与MASH组相比,MSCs输注后,总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)呈下降趋势,甘油三酯(TG)下降明显[(0.69±0.24)mmol/L vs.(1.11±0.25)mmol/L,P<0.05],提示脂代谢得到改善。与MASH组相比,MSCs组肝细胞脂肪变减轻,炎细胞灶浸润减少,NAFLD活动度积分(NAFLD activity score,NAS)评分明显降低[(3.10±0.13)vs.(5.66±0.52),P<0.05]。MSCs组肝脏油红染色面积较MASH组明显减少[(36.30%±6.06%)vs.(53.10%±3.06%),P<0.05]。MSCs组炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-6表达较MASH组明显下调(P<0.05),提示小鼠MASH明显减轻。(2)体外,LPS+IFN-γ诱导的促炎型巨噬细胞与MSCs共培养后,促炎表型CD11c的表达从79.01%±6.08%下降到39.67%±6.11%(P<0.05),抑炎表型CD206从22.67%±4.04%上升至44.67%±4.16%(P<0.05),炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达明显下降(P<0.05),提示巨噬细胞的促炎能力被明显抑制。结论间充质干细胞可以减轻代谢功能障碍相关脂肪性肝炎,可能与抑制促炎型巨噬细胞的促炎能力有关。

人骨髓间充质干细胞通过YAP影响人脂肪肉瘤SW872细胞的生物学行为

目的:观察人骨髓间充质干细胞(hMSCs)条件培养基(CM)与人脂肪肉瘤SW872细胞共培养后对肿瘤细胞增殖和迁移能力的影响,探讨hMSCs CM对脂肪肉瘤细胞的作用及可能的作用机制。方法:体外培养hMSCs,采用慢病毒方法分别转染慢病毒空载体shNS(对照组)和慢病毒shRNA Yes相关蛋白(YAP)(shYAP-hMSCs组),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组hMSCs中YAP mRNA和蛋白表达水平,提取CM。体外培养SW872细胞,分为对照组(正常培养)、hMSCs CM组和shYAP-hMSCs CM组。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,细胞划痕实验检测各组细胞划痕愈合率,Western blotting法检测各组细胞中YAP、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)蛋白表达水平。结果:与对照组比较,shYAP-hMSCs组hMSCs中YAP mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01),表明成功构建了shYAP-hMSCs稳定转染细胞株。CCK-8法,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞增殖活性升高(P<0.05),shYAP-hMSCs CM组SW872细胞增殖活性降低(P<0.01);流式细胞术,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞凋亡率无明显变化(P>0.05),shYAP-hMSCs CM组SW872细胞凋亡率升高(P<0.01);细胞划痕实验,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞划痕愈合率升高(P<0.05),shYAP-hMSCs CM组SW872细胞划痕愈合率降低(P<0.01);Western blotting法,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞中YAP、MMP-9和cyclin D1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),shYAP-hMSCs组SW872细胞中YAP、MMP-9和cyclin D1蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。结论:hMSCs参与调控人脂肪肉瘤SW872细胞增殖和迁移,其机制可能与YAP表达有关。

电针促进脂肪干细胞在体成骨分化改善骨质疏松的机制

目的 探讨电针(electroacupuncture, EA)联合自体脂肪干细胞(adipose derived stem cells, ADSCs)移植对去卵巢大鼠骨质疏松的作用及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法 将雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、EA组、ADSCs组和EA+ADSCs组,每组10只。采用大鼠卵巢切除建立模型,在造模手术后2个月开始干预,EA组予双侧“脾俞”“肾俞”电针治疗,频率2 Hz,连续波,强度1 mA。每次10 min,每周3次,连续8周。ADSCs组将绿色荧光蛋白标记的ADSCs经尾静脉移植体内。每次1×10~6个,每周1次,连续8周。EA+ADSCs组予电针治疗,联合自体ADSCs移植,干预连续8周。检测大鼠股骨骨微结构及骨组织病理变化、血清骨代谢指标,股骨Wnt3a、β-catenin和Runx2基因及蛋白表达,及Runx2/β-catenin蛋白的共表达。结果 与假手术组比较,模型组大鼠骨密度显著降低(P<0.01),骨小梁间距变大;与模型组比较,EA组大鼠骨密度显著增高(P<0.01),骨小梁数量和厚度增加,Wnt3a、β-catenin、Runx2 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Runx2/β-catenin蛋白表达显著升高(P<0.01);ADSCs组Runx2的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。EA+ADSCs组骨小梁结构均优于ADSCs组和EA组,并且Runx2/β-catenin蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论 ADSCs移植联合电针可以有效改善卵巢摘除大鼠模型骨质疏松状况,这种作用可能和激活Wnt/β-catenin信号通路有关。

miR-210-5p对小鼠脂肪干细胞成骨分化的影响及作用机制分析

[目的]观察miR-210-5p在小鼠脂肪干细胞增殖和成骨分化中的作用并探讨其作用机制.[方法]将小鼠脂肪干细胞分空白对照组、miR-210-5p模拟物阴性对照组、miR-210-5p模拟物组、miR-210-5p抑制物阴性对照组和miR-210-5p抑制物组,采用CCK-8细胞计数法检测细胞增殖能力,茜素红染色观察钙盐矿化结节形成能力,用实时荧光定量PCR检测miR-210-5p水平及成骨分化标志物BMP2、Smad1、Smad5和Runx2 mRNA表达水平,进而用蛋白免疫印迹法检测BMP2、Smad1、Smad5和Runx2蛋白表达水平.[结果] miR-210-5p模拟物组细胞增殖活力显著升高(P<0.01),矿化结节显著增加,BMP2、Smad1、Smad5和Runx2 mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.01);miR-210-5p抑制物组细胞增殖活力显著降低(P<0.01),矿化结节显著降低,BMP2、Smad1、Smad5和Runx2 mRNA和蛋白表达水平显著下调(P<0.01).[结论] miR-210-5p可能通过调控BMP2/Smad信号通路促进小鼠脂肪干细胞增殖和成骨分化.

脂肪干细胞胶填充颞部凹陷的临床应用

目的 探讨脂肪干细胞胶填充颞部凹陷的临床应用效果。方法 回顾性分析2021年3月至2023年3月广东省妇幼保健院医学美容科收治的因颞部凹陷要求手术修复患者24例(48侧)临床资料。采用肿胀吸脂术抽取皮下脂肪,制备脂肪干细胞胶。采用深注浅铺法(选取颞部凹陷最深处2~4个点进针,分别于颞肌-骨膜间隙锐针注射、颞浅筋膜浅层钝针平铺)进行脂肪干细胞胶移植。术后定期随访,调查凹陷严重程度评价量表,医师、患者及第三方满意度。结果 所有患者均顺利完成手术,单侧移植剂量6.0~12.0 mL,平均8.9 mL。术后有2例皮肤出现局部淤青,1周左右逐步消退,未出现严重并发症。术后随访 6~12个月,颞部轮廓及饱满度、皮肤质地均得到改善,无局部结节、无凹凸不平。32侧(66.7%)颞部凹陷术后改善≥2级,医师、患者双方及第三方满意率均大于 87.5%。结论 应用深注浅铺法行脂肪干细胞胶填充颞部的临床效果好,简单易行,值得推广。

脂肪干细胞对心肌梗死大鼠心肌组织中miR-423-5p及PI3K/AKT通路的影响

目的探讨脂肪干细胞(ADSCs)对心肌梗死模型大鼠心肌组织中miR-423-5p、PI3K、AKT的影响。方法将实验大鼠随机分为对照组、心梗模型组(模型组)、心梗模型+rADSCs组(干预组),每组6只。对照组大鼠麻醉后仅开胸后缝合,模型组、干预组大鼠麻醉后结扎前降支,干预组在缝合前心脏原位注射大鼠脂肪干细胞(10^(6)个细胞/只)。观测并称量各组大鼠心脏质量,用HE染色及Masson染色观察心肌组织病理变化,实时荧光定量PCR检测miR-423-5p、PI3K、AKT的mRNA表达情况,Western blot方法检测AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K的蛋白表达。结果与对照组相比,模型组、干预组大鼠的心脏组织质量显著升高,其中模型组与对照组间差异有统计学意义(P<0.05);病理结果显示模型组大鼠心肌细胞排列紊乱,细胞变性坏死严重,胶原纤维沉淀,可见明显的炎性浸润,干预组的大鼠心肌细胞的坏死情况、炎性浸润、胶原纤维沉淀较模型组明显降低;与对照组相比,模型组大鼠心肌组织中PI3K、AKT、miR-423-5p的mRNA表达水平和p-PI3K、p-AKT的蛋白表达水平显著升高(P<0.05);干预组中以上指标的表达水平较模型组显著降低(P<0.05)。结论大鼠脂肪干细胞可以降低心梗模型大鼠心肌组织损伤和纤维化,改善梗死后的心功能。其内在调控机制可能为分泌miR-423-5p,抑制PI3K、AKT的转录水平和蛋白磷酸化水平,发挥保护和治疗心肌梗死的作用。

脂肪间充质干细胞脑内定向移植治疗大鼠脑出血的机制研究

目的探讨脂肪间充质干细胞(ADSC)脑内定向移植治疗大鼠脑出血的机制。方法对从大鼠腹股沟处吸脂来源的脂肪组织进行ADSC的分离、传代培养、鉴定、冻存和复苏、体外诱导分化及储存。建立大鼠脑出血微创抽吸术模型30只,采用抽签法将其分为三组,A组:磷酸盐缓冲液3 ml;B组:ADSC 1×10^(8)悬浮于3 ml磷酸盐缓冲液;C组:ADSC诱导分化的神经干细胞1×10^(8)悬浮于3 ml磷酸盐缓冲液。采用ADSC脑内定向治疗脑出血,通过Rogers Scale积分进行神经行为功能评价,在第1、3、5、7周进行,进行统计分析。通过超速离心法从血清中提取外泌体,分析其在三组大鼠中的差异。结果三组大鼠均出现不同程度的神经功能障碍,在第1、3、5、7周C组大鼠Rogers Scale评分均低于同时间的A、B组,差异有统计学意义(P<0.05);C组大鼠同组比较第5、7周Rogers Scale评分低于第1周,差异有统计学意义(P<0.05);在第1、3、5、7周A、B两组大鼠血清外泌体浓度均低于同时间的C组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论ADSC通过脑内定向移植能够减轻脑出血大鼠模型症状,可能与其分泌外泌体有关。

米托蒽醌甲磺酸盐预处理脂肪间充质干细胞对犬糖尿病的治疗效果评价

本研究在高脂饮食(high-fat diet, HFD)饲喂和链脲佐菌素(streptozotin, STZ)注射的联合作用下成功建立小鼠及犬糖尿病模型,旨在探究米托蒽醌甲磺酸盐(mitoquionl mesylate, MitoQ)预处理脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs)对糖尿病动物模型治疗效果的提升作用及机制。取正常培养状态的ADMSCs及添加1μmol·L^(-1)MitoQ处理的ADMSCs,对MitoQ处理的细胞形态变化、生长、增殖、迁移及抗氧化能力等进行检测。选取48只8周龄的昆明(KM)雄性小鼠和12只中华田园犬,随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病模型组(Diabetes组)、ADMSCs单独治疗组(ADMSCs组)和MitoQ预处理ADMSCs联合治疗组(MitoQ-ADMSCs组)。常规方法制作小鼠及犬糖尿病模型,对模型小鼠和犬分别进行ADMSCs和MitoQ-ADMSCs细胞静脉移植治疗,细胞数为2×10^(6)·只^(-1)(小鼠)和1×10^(7)·只^(-1)(犬),每周1次,连续3周。持续监测临床指标变化,治疗结束后1周收样,血清学、组织学、氧化应激及犬血清代谢组学分析。结果表明,MitoQ预处理ADMSCs不会影响其细胞形态,但能促进其生长、增殖及迁移能力,同时增强其抗氧化能力;ADMSCs和MitoQ-ADMSCs移植治疗后,发现MitoQ显著促进ADMSCs降低血糖的能力,且提高胰岛β细胞功能和机体血糖调节能力;ADMSCs经MitoQ预处理后有效减轻糖尿病伴发的肝代谢功能障碍和血脂代谢异常;ADMSCs可以减轻胰腺和肝组织损伤,促进胰岛素分泌,减轻肝糖原合成障碍和纤维化水平,而MitoQ处理能够显著改善ADMSCs治疗效果;MitoQ预处理ADMSCs能够有效提升机体的抗氧化能力,减轻氧化损伤,进而增强治疗效果;MitoQ预处理ADMSCs可以显著促进机体内与抗氧化相关的代谢物表达上调。结果揭示,MitoQ能够通过提高ADMSCs的抗氧化能力、加速组织损伤修复,从而更好地治疗小鼠及犬糖尿病。

脂肪间充质干细胞在纤维化疾病治疗中的作用

纤维化疾病由于其广泛性和复杂性带来了重大临床挑战,探究纤维化的发生机制并寻求更有效的治疗方法势在必行。脂肪间充质干细胞(adipose⁃derived stem cell,ADSC)是适用于再生医学的理想干细胞,可作为许多疾病的替代治疗方案。近年来研究表明,ADSC有显著的抗纤维化潜力。本文就ADSC抗组织纤维化过程中涉及的上皮⁃间充质转变、成纤维细胞活化、抗炎及免疫调节等潜在干预靶点进行综述,旨在为防治纤维化提供新思路。

基于线粒体自噬探讨黄芪甲苷孵育的脂肪干细胞对糖尿病肾脏疾病大鼠的保护作用

目的观察尾静脉移植黄芪甲苷(astragaloside,Ast)孵育的人脂肪干细胞(human adipose derived stem cell,h ADSC)对糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)大鼠肾损伤的修复作用,探讨其可能机制。方法将21只SD大鼠按随机数字表法分为正常组(5只)、模型组(6只)、hADSC组(5只)及Ast-hADSC组(5只),后3组大鼠建立DKD模型,hADSC组及AsthADSC组尾静脉注射hADSC或Ast-hADSC悬液,每2周1次,共6次,模型组予等量生理盐水。检测肾功能、血脂、尿微量白蛋白/尿肌酐及尿蛋白定量,HE及Masson染色观察肾脏病理,激光共聚焦观察hADSC在肾脏定植情况,免疫组化及免疫蛋白印迹观察肾组织电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated-protein-lightchain-3,LC3)、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、自噬底物P62蛋白、磷酸酶及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶1(PTEN induced putative kinase 1,Pink1)及E3泛素连接酶(E3 ubiquitin,Parkin)蛋白的表达,透射电镜观察线粒体及自噬小体情况。结果(1)与模型组比较,hADSC组及Ast-hADSC组血清总胆固醇[(2.65±0.04)mmol/L、(2.30±0.29)mmol/L比(3.31±0.91)mmol/L]、尿微量白蛋白/尿肌酐[(58.91±11.86)mg/g、(44±23.82)mg/g比(101.03±46.88)mg/g]及24 h尿蛋白定量[(321.18±88.71)mg、(136.35±66.01)mg比(408.67±113.95)mg]均下降(P<0.05),体重[(240.20±26.43)g、(274.00±17.89)g比(193.60±18.57)g]增加(P<0.05);Ast-hADSC组体重,24 h尿蛋白定量较hADSC组疗效更显著(P<0.05)。(2)与模型组比较,hADSC组及Ast-hADSC组三酰甘油、低密度脂蛋白、尿素氮、高密度脂蛋白差异均无统计学意义(P>0.05)。(3)肾脏病理:hADSC组及AsthADSC组大鼠肾损伤减轻,肾脏指数及肾小球截面积增大减轻(P<0.05);Ast-hADSC组改善更显著。(4)激光共聚焦:hADSC组及Ast-hADSC组可见少量红色荧光表达。(5)免疫组化及免疫蛋白印迹:hADSC组及Ast-hADSC组LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Pink1、Parkin蛋白的表达增加(P<0.05),P62蛋白表达减少(P<0.05);Ast-hADSCs组疗效更显著。(6)透射电镜:模型组线粒体肿胀变形、碎片较多,自噬小体的数量较少;hADSC组及Ast-hADSC组可见较多的自噬小体,肿胀变形的线粒体及线粒体碎片较少;Ast-hADSC组疗效更显著。结论尾静脉移植hADSC可恢复DKD大鼠肾组织中线粒体自噬,减轻肾损伤,经Ast孵育后疗效更显著。

脂肪间充质干细胞外泌体调控心脏成纤维细胞自噬和NLRP3炎症小体平衡抑制心肌梗死后不良心室重塑

[目的]探讨脂肪间充质干细胞(ADMSC)外泌体(Exo)对心肌梗死(MI)后不良心室重塑的抑制作用和机制。[方法]观察心脏成纤维细胞经过氧化氢(H_(2)O_(2))处理后自噬和炎症表型的改变。MI大鼠经尾静脉注射等体积的生理盐水、ADMSC外泌体(MSC-Exo)、成纤维细胞外泌体(MEF-Exo),观察心脏成纤维细胞自噬相关16样蛋白1(ATG16L1)、自噬相关蛋白7(ATG7)和NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体的表达,炎症反应,心肌纤维化程度以及心功能。[结果]心脏成纤维细胞经H_(2)O_(2)处理后,自噬相关蛋白ATG16L1和ATG7表达显著降低(P<0.001),NLRP3表达显著升高(P<0.001),促炎细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18水平显著增加(P<0.001)。MI大鼠经MSC-Exo干预后,自噬相关蛋白ATG16L1和ATG7表达显著上调(P<0.001),NLRP3表达显著下调(P<0.001),血清IL-1β和IL-18水平显著降低(P<0.001),纤维化相关蛋白胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ显著减少(P<0.001),心肌纤维化程度显著减轻(P<0.001),心功能明显改善(P<0.001)。[结论]脂肪MSC-Exo通过调控心脏成纤维细胞自噬和NLRP3炎症小体的平衡,发挥抑制MI后不良心室重塑的作用。

泛素特异性蛋白酶42调节人脂肪干细胞成骨向分化

目的:探索泛素特异性蛋白酶42(ubiquitin-specific protease 42,USP42)在人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,hASCs)体内外成骨向分化中的作用。方法:用慢病毒转染hASCs,构建敲低和过表达USP42的稳定转染细胞系,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性定量、茜素红S矿化结节染色及定量,检测实验组(敲低组和过表达组)及对照组在成骨诱导下hASCs成骨向分化能力的差异,通过定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测实验组及对照组成骨相关基因的表达水平,通过蛋白免疫印迹实验检测实验组及对照组成骨相关蛋白的表达水平,通过裸鼠异位成骨实验评价USP42在hASCs体内成骨向分化中的作用。结果:敲低组USP42的mRNA和蛋白表达显著低于对照组,过表达组显著高于对照组。成骨诱导7 d后,敲低组的ALP活性显著高于对照组,过表达组显著低于对照组;成骨诱导14 d后,敲低组茜素红S染色显著深于对照组,过表达组显著浅于对照组。qRT-PCR结果显示,成骨诱导14 d时,敲低组ALP、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)和Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,COLⅠ)的mRNA表达水平显著高于对照组,过表达组显著低于对照组。蛋白免疫印迹实验结果显示,成骨诱导14 d时敲低组runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、OSX和COLⅠ蛋白表达水平显著高于对照组,过表达组显著低于对照组。裸鼠皮下移植物苏木精-伊红染色结果显示,敲低组类骨组织百分比较对照组显著增高。结论:敲低USP42显著促进hASCs的体内外成骨向分化,过表达USP42显著抑制hASCs的体内成骨向分化,USP42可作为骨组织工程学潜在治疗靶点。

干细胞来源与组织来源小细胞外囊泡诱导脂肪新生的比较

背景:再生医学近几十年的发展,使胞外囊泡诱导脂肪组织再生成为修复软组织缺损的可行方法。但由于实验模型不同以及胞外囊泡使用剂量不同,目前仍无法对不同来源胞外囊泡在脂肪再生中的应用效果进行定量比较。目的:比较干细胞来源小细胞外囊泡与组织来源小细胞外囊泡在体内诱导脂肪新生的效果。方法:采用超速离心法提取脂肪干细胞来源小细胞外囊泡和脂肪组织来源小细胞外囊泡,采用纳米颗粒跟踪分析、透射电镜和Western blot鉴定比较2种小细胞外囊泡的数量、粒径、形态和标志蛋白表达;使用定制硅胶管建立C57小鼠皮下脂肪新生定量评估模型,通过细胞计数和苏木精-伊红染色比较2种小细胞外囊泡体内促进脂肪组织新生的效果。结果与结论:①通过超速离心法提取2种小细胞外囊泡,粒径均位于50-200 nm之间,在透射电镜下均为典型的圆形,均表达小细胞外囊泡的特征性蛋白CD81、CD63、TSG101;②使用定制硅胶管,将等粒子数小细胞外囊泡与Matrigel凝胶混合于硅胶管中植入小鼠背部皮下,建立小鼠体内无细胞、可定量的脂肪新生模型;③植入后3,7 d,硅胶管内容物苏木精-伊红染色和细胞计数显示,加入了小细胞外囊泡的2组都比空白对照组募集到更多的宿主细胞,且脂肪组织来源小细胞外囊泡组优于脂肪干细胞来源小细胞外囊泡组;④体内植入4周的硅胶管内容物苏木精-伊红染色显示,小细胞外囊泡促进脂肪新生,且脂肪组织来源小细胞外囊泡组优于脂肪干细胞来源小细胞外囊泡组。以上结果表明,组织来源小细胞外囊泡促进脂肪新生的效果优于干细胞来源小细胞外囊泡。

脂肪间充质干细胞对巴马小型猪自体皮肤移植愈合过程的影响

拟应用脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)干预小型猪自体皮肤移植实验动物模型,观察其对自体皮肤移植愈合过程中的作用效果。对9头小型猪建立自体皮肤移植动物模型,将小型猪随机分为3组:模型组(Model)、磷酸盐缓冲液组(PBS)、脂肪间充质干细胞组(ADSCs)。各组分别于术前,术后7、14、21和28 d,采集血液和皮肤组织样本,并观察、拍照、记录移植皮片和周围组织临床变化情况。通过对移植皮片表观检查、病理组织学检测,血常规以及血清生化检测,移植皮片组织氧化应激、炎症、再生相关指标检测及血流恢复情况,综合评价ADSCs对小型猪自体皮肤移植创口愈合的影响。临床观察发现,术后ADSCs组皮片恢复速度优于其他两组,在术后28 d,ADSCs组基本恢复正常皮肤状态。在氧化应激方面,ADSCs组SOD、GSH含量显著升高(0.01<P<0.05),MDA显著下降(0.01<P<0.05)。在炎症方面,ADSCs组显著降低TNF-α、IL-1β含量,IL-10在术后7、14 d极显著升高(P<0.01)。在皮肤组织再生方面,ADSCs组VEGF、bFGF、TGFβ3和CD31的表达量显著上升(0.01<P<0.05)。在血流恢复方面,ADSCs在愈合过程中血流灌注百分比显著高于其他两组(0.01<P<0.05)。综上表明,在小型猪自体皮肤移植动物模型中,ADSCs能够加速皮肤组织病理损伤的恢复,降低氧化应激反应及炎症反应,促进皮肤组织再生,血管新生。表明ADSCs具有抗氧化、抗炎和促进组织再生的功能对小型猪自体皮肤移植具有良好的治疗效果,本试验为干细胞在自体皮肤移植和异体皮肤移植的临床应用提供了实验支撑和科学依据。

深度烧伤痂脂肪干细胞源性外泌体蛋白组学差异的初步研究

目的:分析不同脂肪组织来源干细胞源性外泌体(ADSC-Exos)蛋白质组学差异,为深度创面修复提供理论依据。方法:取烧伤痂组织与正常皮下脂肪组织,分离脂肪干细胞(ADSC),通过光镜观察、Western blot(WB)、成骨分化、成脂分化鉴定ADSC。差速离心方法收集脂肪干细胞外泌体(ADSC-Exos),通过电镜观察、WB法、Nanosight分析仪鉴定ADSC-Exos;通过非标记定量蛋白质谱(LFQ)技术分析两组患者ADSC-Exos蛋白质表达水平差异。结果:成功分离ADSC,光镜下呈纤维状,WB显示细胞稳定表达CD29及CD105,成骨诱导分化细胞内见红色密集钙结节、成脂诱导分化细胞内存在折光性好的透亮脂滴。成功分离ADSC-Exos,电镜下呈双膜性结构,WB显示外泌体可稳定表达表面标志物CD63及CD81,Nanosight显示外泌体均匀对称分布,直径30~150 nm。两组表达水平差异蛋白质184种,差异倍数显著上调前10种蛋白:丝裂原活化蛋白激酶3、丝裂原活化蛋白激酶1、转化生长因子β-1前蛋白、细胞凋亡调节因子BAX、热休克蛋白HSP 90α、微管蛋白α-1B链、腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白2、钙调素-3、热休克蛋白HSP 90β、蛋白激酶Cβ型;差异倍数显著下调前10种蛋白:激肽源B1、激肽源1、补体家族(C3、C1q C链、C1q B链、C5、C1q A、C4B、C4A、C9)。结论:烧伤痂下组织来源ADSC-Exos蛋白与正常组织的表达存在明显差异,可能与烧伤创面修复、抑制瘢痕过度增生及抗炎与机体免疫等密切相关。

脂肪间充质干细胞外泌体预防和治疗瘢痕疙瘩的研究进展

瘢痕疙瘩的发病机制复杂,受多种因素影响,如局部机械力、感染、激素水平、血压、缺氧、遗传及生活习惯等^([1]).瘢痕疙瘩较难自行消退,易复发,对患者的生理和心理健康产生一定的负面影响.近年来,外泌体成为干细胞治疗瘢痕疙瘩的替代方法^([2]).本文就脂肪间充质干细胞外泌体(Adipose derived stem cells-exosomes,ADSCs-EXOs)预防和治疗瘢痕疙瘩的研究进展进行了综述。

过表达或沉默lncRNA SNHG8的脂肪干细胞对血管内皮细胞功能障碍的影响

目的:研究过表达或沉默长链非编码RNA(lncRNA)SNHG8的脂肪干细胞(ADSCs)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)活力、迁移、成管及表达血管活性因子的影响。方法:(1)流式细胞术及成脂、成骨诱导实验鉴定病态肥胖患者来源的脂肪干细胞(O-ADSCs);RT-qPCR检测健康人群来源的脂肪干细胞(H-ADSCs)及O-ADSCs内lncRNA SNHG8的表达。(2)Transwell建立ADSCs与HUVECs间接共培养48 h体系,设置O-ADSCs+HUVECs组、HADSCs+HUVECs组和HUVECs组,通过RT-qPCR和Western blot检测HUVECs内血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、内皮素1(ET-1)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的mRNA及蛋白表达水平。(3)进一步构建lncRNA SNHG8过表达或沉默慢病毒并感染O-ADSCs,设置O-ADSCs-OE-SNHG8+HUVECs组、O-ADSCs-OE-NC+HUVECs组、O-ADSCs-sh-SNHG8+HUVECs组和O-ADSCs-sh-NC+HUVECs组,共培养48 h后,通过CCK-8实验、划痕实验和小管形成实验分别检测HUVECs活力、迁移能力和成管能力;RT-qPCR和Western blot检测HUVECs内AngⅡ、ET-1和eNOS的mRNA及蛋白表达水平;硝酸还原酶法检测HUVECs内NO含量。结果:(1)所培养细胞经鉴定符合ADSCs特征;(2)与H-ADSCs比较,lncRNA SNHG8在O-ADSCs中显著高表达(P<0.01);(3)与H-ADSCs+HUVECs和HUVECs组相比,O-ADSCs+HUVECs组中HUVECs内AngⅡ和ET-1的mRNA及蛋白表达水平上调(P<0.01);(4)过表达lncRNA SNHG8的OADSCs可增强HUVECs的活力、迁移能力及成管能力,上调HUVECs中AngⅡ和ET-1的mRNA及蛋白表达水平,下调eNOS的mRNA及蛋白表达水平,减少HUVECs内NO含量(P<0.05);而沉默O-ADSCs中lncRNA SNHG8的表达则呈现相反的结果(P<0.05)。结论:(1)O-ADSCs可通过旁分泌作用增强内皮细胞活力、迁移能力及成管能力;(2)过表达lncRNA SNHG8的O-ADSCs促使内皮细胞分泌舒张-收缩因子失衡,导致血管内皮细胞功能障碍。