年轻和老年小鼠脂肪来源干细胞生物学特性对比

背景:脂肪来源干细胞具有抗衰老的作用,但来自不同年龄供者的脂肪来源干细胞是否有区别,还需深入研究。目的:对比老年和年轻小鼠脂肪来源干细胞的生物学特性。方法:分别从8周龄、14周龄C57BL小鼠脂肪组织中提取脂肪来源干细胞,对比分析老年和年轻小鼠脂肪来源干细胞的细胞周期、凋亡、增殖能力的差异,定量PCR和Western blot检测老年和年轻小鼠脂肪来源干细胞衰老相关P21、P27基因和蛋白的表达。结果与结论:与老年小鼠脂肪来源干细胞相比,年轻小鼠脂肪来源干细胞更有活力,形态更规则,凋亡更少,增殖更快,衰老相关P21、P27基因和蛋白表达量更低,说明年轻小鼠脂肪来源干细胞具有更好的抗衰老作用。

兔脂肪干细胞(ADSCs)与聚羟基乙酸/壳聚糖(PLGA/CS)支架材料生物相容性研究

目的探讨兔脂肪来源于细胞（adipose-derived stemcells，ADSCs）作为种子细胞复合新型聚羟基乙酸（polylaetic-co—glycolicacid，PLGA）／壳聚糖（chitosan，CS）支架材料的生物相容性，为进一步构建组织工程化脂肪组织提供实验依据。方法取雄性新西兰大白兔腹股沟脂肪组织，I型胶原酶消化分离出ADSCs进行培养，贴壁细胞至3～5代，评价其多向分化能力。将干细胞收集重悬后，以l×10^7／mL的密度接种于多孔PLGA／CS支架，形成细胞一支架材料复合物。培养7天后，扫描电子显微镜观察细胞在支架材料上的黏附生长和基质分泌情况，评价细胞与支架材料的生物相容性；Dil荧光标记检测细胞在支架材料上的分布；Hochest33258检测细胞在支架上的生长情况。接种1和7天后，分别对细胞一材料复合物行AnnexinV／PI双染色法检测材料对细胞的毒性作用。用成脂诱导条件培养基诱导分化ADSCs及ADSCs支架材料复合物，7天后，尼罗红荧光染色液检测ADSCs在不同环境下的成脂分化能力。结果原代培养的ADSCs呈成纤维细胞样外观，在相应诱导条件下能够分化为脂肪细胞和骨细胞。细胞接种于PLGA／CS支架材料上第8天分裂增殖达到高峰，扫描电子显微镜下提示ADSCs在支架表面贴附生长良好，并向孔隙内壁充分延伸，细胞周围形成丰富的基质成分。活死双染结合共聚焦显微镜显示材料对细胞活性无影响，尼罗红染色可见成脂诱导后的ADSCs细胞质内有红色脂滴颗粒形成。结论多孔PLGA／CS支架与兔ADSCs具有良好的生物相容性，可作为构建组织工程脂肪组织的支架材料。

含毛喉素的条件培养液诱导脂肪来源干细胞神经分化的体外实验研究

目的:利用神经诱导液体外诱导大鼠脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)神经分化,探索对ASCs体外成神经分化的最佳毛喉素浓度,并研究该浓度的培养液对ASCs体外成神经分化的作用。方法:酶消化法获得原代ASCs,通过流式细胞术和细胞染色鉴定ASCs的表型和多向分化能力。体外用含不同浓度毛喉素的神经诱导条件培养液进行神经诱导分化,采用免疫荧光染色技术筛选最佳浓度。采用含最佳浓度毛喉素的神经诱导条件培养液诱导ASCs,镜下观察诱导前后细胞的形态学特征,采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和免疫荧光检测诱导前后细胞中神经分化标志物的mRNA和蛋白表达变化情况。结果:神经诱导条件培养液中毛喉素的最佳浓度为10μmol/L,含该浓度毛喉素的神经诱导条件培养液诱导的细胞,能够迅速诱导ASCs向成神经方向分化。诱导后,细胞形态类似神经细胞,神经细胞标志物抗β-Ⅲ微管蛋白(classⅢβ-tubulin,Tuj1)、神经丝蛋白(neurofilament-M,NF-M)、巢蛋白(nestin)抗体和S100β的mRNA水平和蛋白水平均表达增加(P<0.05)。结论:含毛喉素浓度为10μmol/L的诱导培养液能诱导ASCs神经分化,诱导细胞有望成为周围神经种子细胞。

脂肪来源干细胞(ADSC)在脂肪移植中的应用

自体脂肪移植是整形外科一个常见的手术,临床应用广泛。然而,移植脂肪的存活率具有很大的不确定性。脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)是近年来从脂肪组织中发现的一类具有多功能分化能力的干细胞。ADSC能够在自体脂肪移植中起到辅助作用,增加脂肪存活率,这一技术又叫做细胞辅助脂肪移植术(cell-assisted lipotransfer,CAL)。本文对CAL的现状进行综述,为ADSC在脂肪移植中的临床应用和基础研究提供参考。

脂肪来源的干细胞移植对大鼠脑缺血后微血管生成及bFGF和VEGF表达的影响

目的:探讨脂肪来源的干细胞(ADSC)移植对大鼠脑缺血后微血管生成的可能机制。方法:72只清洁级成年雄性Sprague-Darley大鼠,随机分为假手术组(Sham组)、局灶性脑缺血组(MCAO组)、溶剂对照组(vehicle组)和ADSC治疗组(ADSC组),每组18只,采用改良Zea-Longa线栓法制作大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,ADSC移植前用DAPI标记,ADSC组于造模成功1d后经侧脑室注射入30μL的经DAPI标记的ADSC细胞悬液,内含1×106细胞,vehicle组则注射同等剂量的PBS,术后4d、7d和14d分批处死实验动物,并断头取脑,采用免疫组织化学法和半定量RT-PCR法检测缺血区脑组织的新生血管及bFGF和VEGF表达的动态变化。结果:大鼠脑缺血后缺血区即可见大量的微血管生成,2周达高峰。ADSC组较MCAO组和vehicle组缺血区微血管密度明显增高(P<0.01);ADSC组术后4d、7d和14d脑组织中bFGF和VEGF的表达水平较MCAO组和vehicle组明显增高。结论:ADSC移植促进脑缺血大鼠缺血区微血管的生成,其机制可能与促进bFGF和VEGF的表达有关。

脂肪来源干细胞体外成骨诱导和成脂诱导分化

目的探讨脂肪组织来源的多能干细胞(adipose tissue-derived stromal cells,ADSCs)的多向分化潜能。方法取小香猪腹部皮下脂肪组织,通过Ⅰ型胶原酶消化、离心等步骤分离培养ADSCs,经过原代培养和传代培养。分别加入成骨诱导剂和成脂诱导培养。经过倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,并通过Gomori改良钙钴法、von Kossa染色和油红O染色对其成骨细胞和脂肪细胞表型进行鉴定,进一步比较细胞的转化率。结果ADSCs呈成纤维细胞样贴壁生长,其经成骨、成脂诱导培养2周后形态、体积发生明显改变。Gomori改良钙钴法染色显示其细胞质内富含碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)颗粒,诱导后15d和19d,ALP阳性细胞分别为(25.0±7.5)%和(49.7±6.9)%,von Kossa染色表明聚集的细胞团中央能形成钙化结节;倒置显微镜,成脂诱导3、7、14d后脂肪细胞转化率分别为(22.3±12.5)%、(49.6±7.1)%和(89.4±9.3)%。油红O染色可见细胞质内出现橙红色脂滴,14d油红O染色阳性率高达(92.5±9.1)%。结论ADSCs经体外诱导培养后可向成骨细胞和脂肪细胞分化,并具有明显的成骨和成脂表型,表明ADSCs具有多向分化潜能。

脂肪来源干细胞辅助下的面部年轻化治疗

背景:有研究表明脂肪来源干细胞具有组织修复能力,但将其应用于面部年轻化治疗中的报道较少。目的:将原代脂肪来源干细胞辅助颗粒脂肪移植,联合颞部小切口除皱术应用于接受面部年轻化治疗的患者,观察该治疗方法的临床效果。方法:回顾分析解放军沈阳军区总医院整形外在2009年6月至2011年8月的20例来院接受面部除皱治疗女性患者的资料。其中接受自体脂肪来源干细胞辅助治疗的患者10例设为治疗组,单纯接受除皱术患者10例设为对照组。采用皱纹评分的方法,结合VISIA专业皮肤图像分析系统对患者治疗后的斑点、毛孔、皱纹、纹理进行检测,对所得数据进行比较分析。结果与结论:治疗后随访3-15个月,两组治疗前后皱纹评分差异无显著性意义,说明两组治疗患者在皱纹的改善方面效果没有明显区别。治疗前、后的VISIA皮肤检测结果显示,治疗组的毛孔和斑点改善率优于对照组(P<0.05),纹理和皱纹改善率差异无显著性意义(P>0.05)。证实,脂肪来源干细胞辅助下的面部年轻化治疗与单纯除皱疗法在面部年轻化治疗的除皱效果基本一致,但治疗后患者的皮肤毛孔、斑点改善效果明显更好。

BrdU标记家兔脂肪组织来源干细胞的体外研究

目的通过采用BrdU标记连续培养的家兔脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stromal stem cells,ADSCs),检测其最佳标记时间、标记剂量及毒性作用,探讨其作为干细胞标记示踪方法的可行性。方法8～12周龄健康新西兰大白兔6只,雌雄不限,体重1.5～2.0kg。切取腹股沟皮下1～2mL脂肪组织,采用贴壁法体外分离培养ADSCs,并进行鉴定。取第3代细胞以终浓度分别为5、10、15和20μg/mL的BrdU进行标记,分别记为A、B、C及D组;另1孔不含BrdU,作为空白对照(E组)。标记12、24、48和72h后,采用免疫组织化学检测各组细胞阳性率,苔盼蓝排染法行细胞计数观察标记后细胞活性。结果原代培养的ADSCs形态主要为宽大、扁平、短梭形细胞;传代后细胞形态主要为长梭形;第3代ADSCs经诱导均能向成骨细胞和脂肪细胞分化。免疫组织化学观察:第3代ADSCs经BrdU标记后,在荧光显微镜下胞核呈绿色荧光。孵育12h,A、B、C、D组细胞标记阳性率逐渐增高,分别为30.6%±2.3%、32.4%±1.9%、45.8%±1.8%、50.8%±3.1%,C、D组与A组比较,差异有统计学意义(P<0.01);24h,A、B、C及D组标记率分别为45.9%±2.0%、87.9%±3.3%、90.6%±2.9%及91.7%±3.2%;48h和72h,A、B、C、D组标记情况与24h相似;E组各时间点细胞标记阳性率为0。孵育24、48及72h,B、C及D组细胞阳性率与A组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。孵育12、24、48及72h细胞计数,各组细胞活性均在90%以上,A、B、C、D组与E组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论BrdU标记ADSCs的最佳时间为48h,最佳浓度为10μg/mL;BrdU对细胞标记率及安全性高。

脂肪来源的干细胞移植对脑缺血大鼠脑组织IL-10及TNF-α表达的影响

目的:观察脂肪来源的干细胞(ADSC)移植对脑缺血大鼠脑组织IL-10及TNF含量变化,探讨ADSC对脑缺血损伤的保护机制。方法:将72只清洁级成年雄性Sprague-Darley大鼠随机分为假手术组(Sham组)、脑缺血组(MCAO组)、溶剂对照组(Vehicle组)和ADSC治疗组(ADSC组)四组,每组18只,采用线栓法制作大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,ADSC移植前用DAPI标记,ADSC组于造模成功1 d后经侧脑室注射入30μL的经DAPI标记的ADSC细胞悬液,内含1×106细胞,Vehicle组则注射同等剂量的PBS,各组分别于术后4 d、7 d和14 d分批处死后取出脑脑织,采用ELISA法、免疫组织化学法和半定量RT-PCR法,检测大鼠脑组织中IL-10和TNF-α表达的变化。结果:与假手术组相比较,MCAO组大鼠4 d和7 d时脑组织中TNF-α和IL-10的表达明显上调(P<0.05)。MCAO组与vehicle组各相应时间点IL-10和TNF-α表达均无统计学差异(P>0.05)。与vehicle组相比,ADSC组4 d、7 d和14 d时脑组织中IL-10的表达显著上调,TNF-α的表达明显下调(P<0.05)。结论:ADSC移植可上调脑缺血大鼠IL-10的表达,并下调TNF-α的表达,这可能是ADSC具有脑缺血保护作用的机制之一。

脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型

背景:研究证实脂肪组织提取物中存在脂肪来源的干细胞,并表现出多向分化的潜能,但是关于其体外的生物学特性研究不够深入,其细胞表型的研究结果存在一定争议。目的:观察脂肪来源的干细胞的生物学特性与细胞免疫表型。方法:取吸脂手术中废弃的人脂肪组织,胶原酶消化法获得脂肪来源的干细胞,体外传代培养,并进行细胞形态学观察,细胞生长曲线测定,免疫组织化学及流式细胞仪检测其细胞表型。结果与结论:脂肪来源的干细胞生长旺盛,呈成纤维细胞样生长,15 代以内细胞形态未见明显变化;免疫组织化学染色显示,细胞表面标记 CD29,CD44,CD105 表达阳性,CD34,CD45 表达阴性;流式细胞仪检测显示,CD29,CD44,CD105,MHC-Ⅰ为阳性,CD3,CD14,CD19,CD31,CD33,CD34,CD45,CD106,CD117,CD184 为阴性。结果说明脂肪来源的干细胞体外生长能力旺盛,高表达干细胞相关抗原,可长期传代且保持低分化状态。

脂肪组织来源干细胞复合胶原构建组织工程皮肤修复皮肤缺损

目的:探讨脂肪组织来源干细胞(ADSC)作为皮肤组织工程种子细胞修复皮肤缺损的可能性。方法:采用胶原酶消化SD大鼠脂肪组织,经体外扩增后接种于胶原凝胶构建组织工程活性皮肤替代物。15只SD大鼠随机分成3组:ADSC复合胶原组织工程活性皮肤替代物实验组、单纯胶原移植组和空白对照组。将各组相应材料分别移植于SD大鼠背部皮肤缺损处,比较观察创面修复效果。结果:ADSC复合胶原实验组、单纯胶原移植组和空白对照组创面愈合时间分别为:(14.3±1.7),(16.9±2.5)和(21.2±4.2)d,差异有显著性意义(P<0.05)。组织学观察显示,ADSC复合胶原实验组成纤维细胞、微血管、胶原纤维均较单纯胶原移植组和空白对照组明显增多。结论:ADSC复合胶原构建的组织工程活性皮肤替代物移植后可加速新生血管形成、促进创面修复。提示以ADSCs作为种子细胞复合胶原构建的组织工程皮肤可用于皮肤缺损的修复治疗。

脂肪来源的干细胞移植对大鼠脑缺血后神经细胞凋亡及Bcl-2、caspase-12表达的影响

目的:探讨脂肪来源的干细胞(ADSCs)移植对大鼠脑缺血后神经细胞凋亡的影响及其机制研究。方法:72只清洁级成年雄性Sprague-Darley大鼠,随机分为假手术组(Sham组)、局灶性脑缺血组(MCAO组)、溶剂对照组(Vehicle组)和ADSC治疗组(ADSC组),每组18只,采用改良Zea-Longa线栓法制作大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,ADSC组于造模成功1d后经侧脑室注射入30μL的ADSC细胞悬液(内含1×106个细胞),分别于术后4d、7d和14d采用TUNEL法检测缺血区神经细胞凋亡,用免疫组织化学法和RT-PCR法检测脑组织Bcl-2、caspase-12表达的变化。结果:大鼠脑缺血后缺血周边区可见大量细胞凋亡,ADSC组较MCAO组和Vehicle组细胞凋亡明显减少(P<0.05);ADSC组术后4d、7d和14d脑组织中Bcl-2的表达水平较MCAO组和Vehicle组明显增高(P<0.05),而caspase-12的表达水平较MCAO组和Vehicle组明显降低(P<0.05)。结论:ADSCs移植减少脑缺血大鼠缺血区细胞凋亡,其机制可能与促进Bcl-2的表达和抑制caspase-12的表达有关。

脂肪组织来源干细胞促进软组织创面愈合的实验研究

目的探讨大鼠脂肪组织来源干细胞(rADSCs)对软组织创面的促愈作用并比较全身和局部注射两种移植途径的有效性。方法分离培养获得SD大鼠的ADSCs,体外进行成脂、成骨、成神经的诱导分化鉴定。在大鼠背部制作软组织缺损创面模型,分别经创面局部点状注射和尾静脉注入全身途径移植DiI标记的ADSCs,移植细胞数为2.4×106/只。术后3、7、11、14d观察创口收缩率,愈合时间等,24d收集创面组织标本行荧光显微镜及常规HE染色观察。结果 rADSCs具有成脂、成骨、成神经分化潜能。局部途径在术后3d即可见显著的创面收缩,全身途径在术后7d创面收缩开始加速,这两组创面愈合时间均短于对照组,但两组间比较无显著性差异。组织学观察发现细胞移植组较对照组肉芽丰富,成纤维细胞、腺样结构及新生血管形成更明显。结论 rADSCs对软组织创伤具有促愈作用,局部较全身移植途径起效快且发挥作用更明显。

体外培养脂肪组织来源干细胞与胶原/壳聚糖复合支架的亲和性

目的:制备适合脂肪组织来源的干细胞生长的支架,观察复合支架各组成的体积比率与细胞培养的亲和性。方法:实验于2006-09/2007-01在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。①实验方法:将3.55g/LⅠ型胶原和20g/L壳聚糖分别以9∶1,7∶3,5∶5,3∶7,1∶9的体积比混合冻干,碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺交联后再次冻干并进行分析。②实验评估:扫描电镜观察不同材料交联前后的微观结构;IPP软件分析计算支架的平均孔径;测量支架的吸水性和孔隙率;通过胶原酶检测支架的体外生物可降解性;扫描电镜和苏木精-伊红染色观察脂肪组织来源的干细胞在复合支架上的生长情况。结果:①交联前后的微观结构:冻干后的各种支架材料呈白色,表面粗糙,材料内部呈海绵状多孔隙结构,其中以胶原/壳聚糖体积比为9∶1的复合支架最为疏松,1∶9的支架最致密。扫描电镜下支架的胶原含量越高,支架内的胶原丝越多,支架的孔与孔之间相互连通构成了通孔。交联前后支架的形态结构无明显改变。②支架的平均孔径:交联后体积比为9∶1,7∶3和5∶5的复合支架孔径50～200μm,可用于细胞的三维培养。③支架的吸水性和孔隙率:体积比为5∶5的复合支架的吸水性和含水量最高,而7∶3次之;多孔支架在水中未发生明显的溶胀现象;支架的孔隙率均在90%以上。④支架的体外生物可降解性:未交联的支架随着胶原含量的减少,支架的降解速率增加。而交联后随着胶原含量的减少,降解速率减慢,交联后的复合支架降解速度较未交联慢。⑤脂肪组织来源的干细胞在复合支架上的生长情况:脂肪组织来源的干细胞在支架上培养5d后扫描电镜观察细胞在7∶3的支架上爬行生长并融合成片,苏木精-伊红染色观察支架孔内及表面出现大量的细胞团,并融合成片状,而5∶5支架上黏附生长的细胞较少。结论:结合支架的孔径、吸水性、孔隙率、体外生物可降解性和细胞与支架的生物相容性,可知体积比为7∶3的复合支架对脂肪组织来源的干细胞的亲和性较好,适于脂肪组织来源的干细胞的三维培养。

蒙古马脂肪来源间充质干细胞体外成脂和成骨诱导分化

取蒙古马背臀部皮下脂肪组织,通过Ⅰ型胶原酶消化、离心等步骤分离培养脂肪组织来源的间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs),经过原代培养和传代培养,分别加入成脂诱导剂和成骨诱导剂培养,采用倒置显微镜观察诱导后的细胞形态变化,并通过油红O染色和茜素红染色法对其脂肪细胞和成骨细胞表型进行鉴定.结果显示:ADSCs呈成纤维细胞样贴壁生长,其经成脂、成骨诱导培养2周后形态、体积发生明显改变.经油红O染色,细胞质内出现橙红色脂滴;茜素红染色表明聚集的细胞团中央能形成钙化结节.说明马ADSCs经体外诱导培养后可向脂肪细胞和成骨细胞分化,并具有明显的成脂和成骨表型,表明ADSCs具有多向分化潜能.

脂肪来源干细胞的基础研究进展

2001年,ZuK等[1]研究发现并证实,抽脂术获得的脂肪组织中存在一群具有多向分化潜能的细胞,被称为脂肪来源干细胞（Adipose-Derived Stromal/Stem Cells,ASCs）。从此以后,ASCs开始逐渐被人们认识。ASCs取材容易、来源丰富,

脂肪来源间充质干细胞移植对大鼠全层皮肤缺损的修复作用

目的探讨脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)移植在全层皮肤缺损修复中的作用。方法 25只SD大鼠制作大鼠背部全层皮肤缺损模型,随机分为3组,分别移植胶原膜(胶原膜组)、ADSCs+胶原膜(ADSCs+胶原膜组)后覆盖异体SD大鼠皮肤及直接以异体SD大鼠皮肤覆盖(空白对照组)。观察各组创口的愈合速度,并通过愈合皮肤抗拉力实验、HE染色、原位杂交的方法检测愈合后皮肤的抗拉性、组织学改变及ADSCs的表达。结果 ADSCs及胶原膜对大鼠一般情况无明显影响;ADSCs+胶原膜组创面愈合率为(94.24±3.13)%,显著高于空白对照组的(84.57±2.42)%及胶原膜组的(84.72±9.70)%,差异有统计学意义(P<0.05);ADSCs+胶原膜组皮肤的最大拉力、弹性位移和拉伸率与空白对照组及胶原膜组比较差异无统计学意义(P>0.05);ADSCs+胶原膜组皮肤真皮层中存在大量类似于正常皮肤的毛囊结构;在ADSCs+胶原膜组愈合创面皮肤组织中可追踪到雄性大鼠来源细胞的阳性表达。结论 ADSCs能促进大鼠全层皮肤缺损的修复。

基质血管成分与体外扩增的脂肪来源干细胞促进移植脂肪成活的对比研究

目的:比较血管基质成分(st romal vascul ar fract i on,SVF)与体外扩增的脂肪来源干细胞(adi pose-deri ved st emcel l s,ASCs)对移植脂肪成活的促进作用。方法:用手术方法切取家兔腹股沟脂肪,进行ASCs体外分离培养;取第3代ASCs分别进行成脂、成骨诱导实验,CD29和CD31流式鉴定;制备SVF,进行CD29和CD31流式鉴定;脂肪移植裸鼠实验分为3组:SVF、ASCs、和空白对照组(DMEM/F12),每组4只裸鼠,沿背部脊柱两侧对称部位4个移植位点,每组共16个注射移植位点,每点0.3ml脂肪颗粒(adi pose granul e,AG)+0.2ml细胞成分;术后4m时取材称重、固定行HE染色观察移植脂肪组织结构,行CD31免疫组化染色观察新生血管及其密度。结果:家兔ASCs体外分离培养成功,为贴壁生长,第3代细胞形态均呈长梭形。成脂诱导实验油红O染色显示形成脂滴,成骨诱导实验茜素红染色显示形成钙化结节。流式鉴定显示SVF:CD29:17.0%,CD31:1.3%;ASCs:CD29:96.2%,CD31:3.8%。SVF、ASCs和空白对照组各组移植脂肪成活量分别为0.2096±0.0024g,0.1798±0.0033g,0.1350±0.0020g,两两比较差异均有统计学意义,P<0.05。HE染色显示SVF组移植脂肪成活较好,组织结构完整,脂滴大小均一,可见脂肪组织中间有丰富的血管存在;ASCs组移植脂肪成活尚可,组织结构尚完整,脂滴大小一般均一,可见脂肪组织中有结缔组织纤维间隔和新生血管形成;空白对照组结缔组织纤维间隔明显增多,脂滴大小不一,有少量较大空泡形成。各组移植脂肪新生血管密度分别32.6±2.1条/mm2,29.3±1.6条/mm2,23.3±1.9条/mm2,两两比较均有统计学意义,P<0.05。结论:新鲜的干细胞成分SVF比体外扩增的ASCs能更好的促进移植脂肪成活。

人脂肪来源干细胞增强型绿色荧光蛋白质粒转染及体内示踪

目的:对于人脂肪来源干细胞的应用,目前已开始进行临床前期体内移植实验,细胞标记与示踪是证明移植细胞转归和生成组织来源的关键问题。实验观察了带有增强型绿色荧光蛋白的基因质粒转染人脂肪来源干细胞的效果及体内示踪效应。方法:实验于2007-03/12在沈阳军区总医院整形美容外科中心实验室(省级)、沈阳军区呼吸中心实验室(国家级)和全军神经外科中心实验室(国家级)完成。①细胞来源与动物:脂肪组织取自1例腹壁整形术女性患者,对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准。清洁级雄性裸鼠8只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。大肠杆菌JM109由本室保存。转染质粒pEGFP-N3为美国Clontech公司产品。②实验方法:无菌条件下切取患者脂肪组织,采用酶消化法体外分离培养脂肪来源干细胞,传至第3代时以2.5×107L-1密度接种,分别加入200,300,400,500,600,700,800,900mg/LG418,确定G418杀死所有细胞的最低浓度(C0)。采用脂质体法对人脂肪来源干细胞进行pEGFP-N3质粒转染,C0浓度G418筛选,计数阳性细胞率。培养5代后制备单个细胞悬液,浓度为8×1010L-1,植入到裸鼠背部皮下,采用活体化学发光和荧光成像系统观察大鼠荧光表达情况。结果:①体外培养的人脂肪来源干细胞贴壁后为成纤维细胞样,细胞生长活性良好,传代后生长速度加快。②当G418浓度为600mg/L时细胞全部死亡,故将此浓度设定为C0。③pEGFP-N3质粒-脂质体复合物转化脂肪来源干细胞24h后,绿色荧光蛋白阳性细胞率为(13.0±3.5)%,经C0浓度G418筛选后高达(65.0±5.4)%。④裸鼠背部皮下注射脂肪来源干细胞8周后,可见移植区周围弥漫分布绿色荧光区,提示植入细胞存活并广泛分布。结论:增强型绿色荧光蛋白质粒可以有效转染人脂肪来源干细胞,并在裸鼠体内呈现良好的示踪效果。

脂肪组织来源干细胞的细胞生物学研究

目的探索从脂肪抽吸物中脂质部分分离、培养脂肪组织来源干细胞(ASCs)的方法,并通过其生长动力学、形态学、分化能力、细胞衰老和表面标记物轮廓5个方面的特征进行鉴定。方法酶消化法处理脂类抽吸物,分离培养ASCs,观察细胞形态;MTT比色法测细胞活性并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,丫啶橙染色检测细胞的衰老;流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定其表面分子表达;成脂定向诱导分化后油红“O”染色定性。结果原代培养的ASCs呈成纤维细胞样贴壁生长,具有很强的增殖能力;MTT比色法活性测定均证实ASCs具有很强的增殖活性,细胞周期研究发现ASCs具有干细胞的特性。丫啶橙染色3、4、6、8代无明显衰老。流式细胞仪检测显示干细胞标志的CD29、CD44、CD34的表达均成阳性;HLA-DR、CD133表达为阴性;免疫化学染色发现VШ因子、CD31、CD34、CD105、SMA表达阳性;成脂诱导分化2周后,细胞内可见有大量脂滴,油红“0”染色可见胞浆内有大量红染颗粒。结论自人体脂类抽吸物中通过酶消化法能分离和培养出具有干细胞特性的成纤维细胞样细胞群,该细胞具有很强的增殖活性且不易衰老,能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂分化。