人脂肪源干细胞促进前交叉韧带重建后腱骨界面愈合的实验研究

目的 探讨人脂肪源干细胞（human adipose-derived stem cells,h ASCs）能否促进前交叉韧带重建后腱骨界面的愈合。方法 将30只体重2.0-2.5 kg的雌性新西兰大白兔随机分为实验组和对照组,每组各15只。取同侧半腱肌作为供体肌腱,建立单侧下肢前交叉韧带重建动物模型,实验组和对照分别在胫骨和股骨隧道中注射h ASCs或等量的生理盐水。分别在术后2、4和8周取材,收集胫骨-移植韧带-股骨标本行大体观察和组织学观察。结果 HE染色示对照组术后2周腱骨界面主要以炎性细胞浸润为主,4周后炎性细胞减少,8周时腱骨界面可见Sharpey纤维,形成间接止点。实验组术后4周腱骨界面可见纤维软骨细胞及少许骨细胞形成,术后8周可见新骨形成,形成直接止点的结构。结论 h ASCs能促进前交叉韧带重建后腱骨界面的骨化作用,形成直接止点结构,从而促进腱骨界面的愈合。

低频脉冲电磁场在三维支架下对人脂肪源干细胞增殖和成骨分化的影响

背景:目前已有较多实验研究证实低频脉冲电磁场在二维支架下促进多种干细胞向成骨细胞分化,但鲜有研究磁场在三维支架下对干细胞的增殖及成骨分化的影响。目的:探讨在聚已内酯3D培养支架环境下,外加低频脉冲电磁场对人脂肪源干细胞增殖及成骨分化的影响。方法:将第3代人脂肪源干细胞接种于聚已内酯3D培养支架上,分2组培养,实验组给予50 Hz、1 m T的低频脉冲电磁场干预,2 h/d,连续干预14 d;对照组不给于低频脉冲电磁场干预。培养7 d后,Live/Dead染色观察细胞存活情况;培养1,3,5,7 d后,MTT法检测细胞增殖;培养7,14 d,碱性磷酸酶染色及qR T-PCR检测细胞成骨分化水平。结果与结论:(1)Live/Dead染色:人脂肪源干细胞已长入到支架材料的空隙结构内部,在材料中可保持较高的活性;(2)细胞增殖:随着培养时间的延长,两组细胞A值均逐渐升高,实验组培养1,3 d的细胞A值高于对照组(P<0.05);(3)碱性磷酸酶染色:实验组培养7,14 d的碱性磷酸酶阳性染色强于对照组;(4)qR T-PCR检测:培养7 d时,实验组碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原基因表达量高于对照组(P<0.01);培养14 d时,实验组骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原的表达量均明显高于对照组(P<0.05);(5)结果表明:在聚已内酯3D培养支架环境下,外加低频脉冲电磁场可促进人脂肪源干细胞的增殖及成骨分化。

MTT法检测纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞增殖的影响

目的:检测纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞增殖的影响。方法:体外培养人脂肪源干细胞,取第三代细胞接种到96孔板,以不同浓度(纤维蛋白与凝血酶比例:4∶1、2∶1、8∶3、5∶2)的纤维蛋白胶浸润提取液培养,用MTT法检测脂肪源干细胞在不同浓度纤维蛋白胶上的增殖情况。结果:不同浓度纤维蛋白胶制备的浸泡提取液所培养的人脂肪源干细胞的生长曲线无明显差异。结论:不同浓度纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞的增殖无明显影响,纤维蛋白胶有望成为人脂肪源干细胞生长的支架材料。

黄芪甲苷孵育脂肪源性干细胞对顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响

背景:干细胞移植用于治疗急性肾损伤的有效性已经被多个研究证实,但其对肾小管上皮细胞损伤的修复机制尚不明确。目的:观察黄芪甲苷孵育后的脂肪源性干细胞对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的保护作用及机制。方法:实验分为4组。2.5μmol/L顺铂诱导肾小管上皮细胞24 h,建立肾小管细胞损伤模型(顺铂损伤组);将脂肪源性干细胞与损伤肾小管上皮细胞共培养(脂肪源性干细胞+损伤肾小管上皮细胞组);利用Transwell小室将20 mg/L黄芪甲苷孵育脂肪源性干细胞48 h后与损伤肾小管上皮细胞共培养(黄芪甲苷孵育脂肪源性干细胞+损伤肾小管上皮细胞组);以正常肾小管上皮细胞做对照(正常对照组)。结果与结论:与肾小管上皮细胞损伤组相比,AV/PI和TUNEL结果均显示脂肪源性干细胞+肾小管上皮细胞组和20 mg/L黄芪甲苷脂肪源性干细胞+肾小管上皮细胞组肾小管上皮细胞发生凋亡的比例和数量明显减少;ELISA结果表明20 mg/L黄芪甲苷脂肪源性干细胞+肾小管上皮细胞组胰岛素样生长因子1分泌显著提高(P<0.05);Western blot进一步显示20 mg/L黄芪甲苷脂肪源性干细胞+肾小管上皮细胞组caspase-3蛋白水平明显下降,而Bcl-2的表达量明显增加(P<0.05)。表明黄芪甲苷孵育的人脂肪源性干细胞对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡具有抑制作用,从而有利于肾小管损伤的早期恢复,其保护机制可能与增加胰岛素样生长因子1分泌,抑制caspase-3表达、上调Bcl-2水平有关。

低氧诱导因子1α基因转染的人脂肪源性干细胞对肾小管上皮细胞损伤的影响

目的:将低氧诱导因子1α(HIF-1α)基因质粒高效感染人脂肪源性干细胞(hADSCs),并与顺铂诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)共孵育,观察hADSCs对HK-2细胞损伤的影响。方法:以慢病毒为载体,将HIF-1α转染hADSCs,与顺铂诱导的HK-2细胞共孵育。电镜观察HK-2细胞形态、结构的变化;原位末端标记(TUNEL)检测细胞凋亡指数;Westernblot检测HK-2细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病2基因(Bcl-2)的变化及hADSCs细胞促红细胞生成素(EPO)、血红素氧化酶1(HO-1)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达,ELISA检测培养液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和肾损伤分子1(KIM-1)的浓度,EPO、HO-1、VEGF和HIF-1α的浓度变化。结果:(1)与顺铂诱导组相比,共孵育后的HK-2细胞结构损伤减轻、凋亡细胞减少,caspase-3的表达低于顺铂诱导组、Bcl-2的表达水平升高;其中HIF-1α转染的hADSCs与HK-2细胞共孵育后,HK-2细胞损伤明显减轻,凋亡蛋白的变化更为明显。(2)顺铂诱导组培养液中NGAL、KIM-1浓度升高,以KIM-1变化明显(P<0.05);细胞共孵育后培养液中KIM-1浓度降低,转染组较明显。(3)转染后的hADSCs细胞内EPO、HO-1、VEGF的蛋白表达升高;培养液中HO-1、VEGF含量增高(P<0.05),HIF-1α、EPO的含量变化不明显。结论:hADSCs与HK-2细胞共孵育后,可以减轻顺铂诱导的HK-2细胞结构损伤、抑制细胞凋亡,HIF-1α转染hADSCs后其作用更为明显,可能与细胞保护因子的高表达有关。

携带增强绿色荧光蛋白的慢病毒载体感染人脂肪源性干细胞的有效性

背景:细胞移植前,将目的基因转染干细胞可增强细胞治疗效果。但要实现目的基因的高效转移并适度表达,载体系统的选择是关键。目的:将携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体感染人脂肪源性干细胞,检测病毒感染效率及感染后的细胞活力。方法:利用脂质体转染法获取慢病毒原液。设定不同感染复数(1,5,10,15,20),将带有增强绿色荧光蛋白的慢病毒载体感染人脂肪源性干细胞。荧光显微镜下观察病毒转染后人脂肪源性干细胞内增强绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪测定病毒感染效率。茜素红染色及油红 O 染色鉴定病毒转染后人脂肪源性干细胞的多向分化潜能。MTT 法检测转染后人脂肪源性干细胞的增殖情况。结果与结论:随病毒感染时间及感染复数值的增加,人脂肪源性干细胞内绿色荧光表达明显增强,感染后第 3 天,感染复数为 20 时人脂肪源性干细胞内可见明显绿色荧光表达,病毒感染效率为 60%;第 5～7 天,病毒感染效率可达 90%～95%。转染后人脂肪源性干细胞经成骨及成脂诱导液培养后,茜素红染色及油红 O 染色阳性,表明病毒感染未影响人脂肪源性干细胞的多向分化能力。病毒感染后,人脂肪源性干细胞的增殖能力未受明显影响。说明携带增强绿色荧光蛋白的慢病毒载体可以有效感染人脂肪源性干细胞。

黄芪甲苷对高糖环境下脂肪干细胞衰老的延缓作用

目的探讨黄芪甲苷(astragalosideⅣ,Ast)减缓高糖环境下人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)衰老的作用。方法通过用含不同浓度葡萄糖的培养基培养hADSCs,筛选出最适高葡萄糖浓度;用不同浓度的Ast干预高糖环境下的hADSCs,筛选出最适Ast干预浓度。将hADSCs分为4组:对照组用含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养;甘露醇组用含5.5 mmol/L葡萄糖和19.5 mmol/L甘露醇的培养基培养;高糖组用含最适高浓度葡萄糖的培养基培养;Ast组用含最适高浓度葡萄糖和最适浓度Ast的培养基培养。4组均培养72 h,通过SA-β-Gal染色观察细胞衰老,Annexin Ⅴ-FITC/PI检测凋亡;qRT-PCR及Western印迹检测hADSCs中p16、Pink1、Parkin、LC3(LC3Ⅱ/Ⅰ)及p62的表达情况;透射电镜观察线粒体及自噬小体情况。结果最适高葡萄糖浓度为25 mmol/L,最适Ast干预浓度为20 mg/L。Annexin Ⅴ-FITC/PI检测显示,与对照组比较,高糖组hADSCs凋亡增加(P<0.001);与高糖组比较,Ast组hADSCs凋亡减少(P<0.001)。SA-β-Gal染色显示,与对照组比较,高糖组衰老细胞增加(P<0.001);与高糖组比较,Ast组衰老细胞减少(P<0.001)。qRT-PCR及Western印迹显示:与对照组比较,高糖组hADSCs中p16及p62表达增加(P<0.001),LC3、Pink1及Parkin表达减少(P<0.001);与高糖组比较,Ast组hADSCs中p16及p62表达减少(P<0.001),LC3、Pink1及Parkin表达增加(P<0.01)。透射电镜下发现,高糖组线粒体肿胀变形、体积较大,自噬小体较少,Ast组线粒体肿胀变形减轻、体积较小,可见大量自噬小体。结论Ast可减缓高糖引起的hADSCs衰老,可能与其上调线粒体自噬有关。

人脂肪源性间充质干细胞对乳腺癌转移的影响

目的研究人脂肪源性间充质干细胞(h AD-MSC)的基本生物学特征及对乳腺癌转移的影响。方法贴壁法从人脂肪组织分离获得h AD-MSC,完成鉴定;分别用脂肪诱导培养基和成骨诱导培养基诱导其向脂肪和成骨细胞分化;h AD-MSC与人乳腺癌细胞MDA-MB-231共培养,Transwell小室法观察肿瘤细胞的形态和迁移、侵袭能力。结果从人脂肪组织中成功培养出间充质干细胞,其具有较强的体外增殖和自我更新能力。共培养之后的MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力增强。结论从人脂肪组织中可分离培养出具有多分化潜能的间充质干细胞,并可促进乳腺癌细胞的转移。

人脂肪源性间充质干细胞修复放化疗所致胸腺损伤机制研究

目的观察体外人脂肪源性间充质干细胞对放化疗损伤胸腺上皮细胞增殖作用并进行机制探索。方法无菌环境下分离提取人脂肪源性间充质干细胞;以20、30、50及100μmol/L KGF-si RNA作用于脂肪源间充质干细胞,筛选最佳KGF-siRNA基因沉默作用浓度;比较KGF基因沉默干预与非KGF基因沉默干预对胸腺上皮增殖影响。结果人脂肪源性间充质干细胞培养6~8 d呈典型纤维状,流式细胞检测细胞表面抗原CD44阳性93.7%,CD34阳性率0.405%。不同浓度20、30、50及100μmol/L的KGF-siRNA转染作用48 h后人脂肪源间充质干细胞mRNA水平下降33.22%、46.40%、81.06%及42.35%,50μmol/L作用48 h效果明显,差异有统计学意义(P<0.05)。48 h基因沉默组、空白对照组及空质粒组角质细胞生长因子表达发现沉默组与空白对照及空质粒组存在显著差异(P<0.05),后二者间无显著差异(P>0.05)。应用Brdu增殖实验连续3 d分别测定基因沉默组、正常组、单纯人胸腺上皮细胞增殖情况及基因沉默组、正常组及单纯鼠胸腺上皮细胞增殖情况发现基因正常组显著高于基因干预组,差异有统计学意义(P<0.05)。应用PI单染测定基因沉默组、正常组、单纯人胸腺上皮细胞及基因沉默组、正常组、单纯鼠胸腺上皮细胞周期计算细胞增殖密切相关S期细胞所占比,证实正常对照组增殖显著高于况默组及单纯小鼠胸腺上皮细胞组增殖,与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论脂肪源性间充质干细胞可通过分泌角质细胞生长因子完成胸腺上皮细胞增殖;脂肪源性间充质干细胞对放化疗损伤胸腺有促进修复的作用。

miR-424负向调节人脂肪源间充质干细胞向成脂细胞分化

目的研究miR-424对人脂肪源间充质干细胞(hAMSCs)向成脂分化的影响。方法用real-time PCR检测hAMSCs成脂分化前后细胞内miR-424水平的变化。在脂质体介导下,用人工合成的miR-424模拟物转染hAMSCs提高细胞内miR-424的含量,随后对其进行成脂诱导。用油红O染色法观察细胞内脂滴形成情况,用real-time PCR和Western blot检测成脂关键转录因子PPARγ及相关标记物mRNA的表达。结果 hAMSCs成脂分化后,miR-424表达下调。与对照组细胞相比,转染miR-424模拟物的实验组细胞中miR-424含量明显升高。成脂诱导第8天油红O染色结果显示,实验组脂滴形成显著少于对照组。PPARγ和成脂相关标记物的表达量也出现下调。结论 miR-424可负向调节hAMSCs向脂肪细胞分化。

腺病毒36感染对人脂肪源性间充质干细胞PPARγ和adiponectin基因表达的影响

目的探讨腺病毒36感染对人脂肪源性间充质干细胞过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ）和脂联素（adiponectin）基因表达的影响。方法无菌条件下获取人皮下脂肪组织、I型胶原酶消化并收集人脂肪源性间充质干细胞（human adipose-derived mesenchymal stem cell,h AMSC）,细胞传至第3代（P3代）对h AMSC进行定向成脂诱导,并进行油红O染色;流式细胞仪检测h AMSC表面免疫表型;人类腺病毒36（adenouirus-36,Ad36）感染h AMSC,采用荧光实时定量PCR（Real time-PCR）方法检测Ad36感染的h AMSC PPARγ和adiponectin基因表达的变化规律。结果 （1）h AMSC在体外呈梭形生长,且能稳定传代;（2）细胞在加入成脂诱导剂后可定向分化成脂肪细胞;（3）流式细胞术检测结果显示h AMSC免疫表型：CD105（93.0±1.3）%,CD44（99.6±0.3）%,CD34（0.2±0.1）%,CD45（0.2±0.3）%,CD31（0.3±0.3）%,CD29（3.4±0.2）%;（4）Ad36感染h AMSC后细胞内脂滴逐渐增多、增大。PPARγ和adiponectin基因在Ad36感染h AMSC后的第1天开始表达,感染后第2～6天较0 MOI组显著升高（P〈0.05）,至感染后第8天10 MOI剂量组表达水平开始下降。结论 Ad36使h AMSC定向分化成脂肪细胞,并上调了PPARγ和adiponectin基因的表达。

人脂肪源性间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的:分离培养并鉴定人脂肪源性间充质干细胞(hAD-MSC)。方法:采用贴壁法从人脂肪组织分离获得hAD-MSC,并从表面分子表达和定向分化两个方面进行鉴定。结果:成功从脂肪组织中分离获得间充质干细胞,该群细胞贴壁生长,形态类似成纤维细胞样;具有较强的体外增殖能力和自我更新能力;一致性好,纯度高,99%的细胞阳性表达CD105、CD90、CD13、CD44分子;CD117、CD34、CD45和HLA-DR阴性表达,阳性率低于2%;可向脂肪和成骨细胞定向分化。结论:分离所得细胞符合间充质干细胞基本特点,可确定为hAD-MSC。

microRNA-132对人脂肪源性间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探讨microRNA-132(miR-132)对人脂肪源性间充质干细胞(hADSCs)成骨分化的影响。方法:分离培养hAD-SCs,转染过表达或抑制miR-132(miR-132mimics或miR-132inhibitors),分别采用qPCR法和western blotting法检测细胞中成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、Runt相关转录因子2(Runx2)、Osterix mRNA和蛋白相对表达量。结果:miR-132在hADSCs的表达随着成骨诱导时间延长逐渐升高(P<0.05),转染miR-132 mimics后,hADSCs成骨相关基因ALP、OCN、Runx2、Osterix mRNA和蛋白的表达显著升高,而转染miR-132inhibitors后,ALP、OCN、Runx2、Osterix mRNA和蛋白的表达显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:miR-132通过正向调控hADSCs成骨相关基因ALP、OCN、Runx2、Osterix表达进而影响hADSCs的成骨分化进程。

mTOR在人脂肪源间充质干细胞成脂中的作用

通过探讨mTOR对hADSCs成脂的影响,为脂肪分化异常所致疾病的预防和治疗提供参考.针对通过吸脂术所抽取的人腹部脂肪组织,利用Ⅰ型胶原酶消化分离培养hADSCs,三联诱导法使其向脂肪细胞分化,油红O染色鉴定.通过免疫细胞化学染色法检测mTOR在细胞内的分布变化;观察雷帕霉素抑制mTOR后hADSCs成脂能力的变化,即油红O染色及PPARγ的表达.结果表明,所分离细胞为平行排列、生长形态相对均一的梭形细胞.三联诱导法诱导7d后可见脂滴的出现,油红O染色着红色.mTOR的分布在分化过程中由核内转向胞浆.雷帕霉素处理细胞使细胞内脂滴的蓄积显著减少、PPARγ表达降低.雷帕霉素抑制mTOR表达可降低hADSCs的成脂能力.

黄芪甲苷孵育的脂肪干细胞治疗糖尿病肾病

背景:研究表明,蛋白尿是糖尿病肾病进展的独立性危险因素,而蛋白尿的发生发展与足细胞的损伤密切相关。目的:观察移植黄芪甲苷孵育的人脂肪源性干细胞(astragaloside-incubated adipose stem cells,Ast-hADSCs)对糖尿病肾病模型大鼠肾损伤的修复作用。方法:人脂肪源性干细胞购自美国ATCC公司,雄性SD大鼠购自上海中医药大学动物实验中心,实验方案经上海中医药大学动物实验伦理委员会批准。将SD大鼠随机分为正常组、模型组、人脂肪源性干细胞组及Ast-hADSCs组,后3组应用左肾摘除联合链脲佐菌素注射法建立糖尿病肾病大鼠模型,2个干细胞干预组经尾静脉输注人脂肪源性干细胞或Ast-hADSCs悬液,2周1次,共6次,模型组予等量生理盐水。实验结束(23周)取材,检测肾功能、血脂、尿微量白蛋白及尿蛋白定量,苏木精-伊红及MASSON染色观察肾脏病理变化及肾小球面积,WT-1染色检测足细胞密度,激光共聚焦观察干细胞在肾脏的分布情况。结果与结论:①与模型组比较,2个干细胞干预组总胆固醇、尿微量白蛋白及尿蛋白定量均下降,但Ast-hADSCs组下降更显著(P<0.05);②与模型组比较,2个干细胞干预组模型大鼠的三酰甘油、低密度脂蛋白、尿素氮、高密度脂蛋白水平无统计学意义(P>0.05);③肾脏病理提示:2个干细胞干预组的肾脏损伤减轻,肾脏指数及肾小球截面积显著缩小,足细胞密度显著增加(P<0.01);Ast-hADSCs组模型大鼠肾脏病理改善明显(P<0.05);④激光共聚焦显示:干细胞干预两组模型大鼠肾组织内可见少量红色荧光表达。结果说明:经尾静脉移植人脂肪源性干细胞可提高糖尿病肾病模型大鼠足细胞的密度,减轻肾脏损伤,从而改善蛋白尿;经黄芪甲苷孵育48h后,可在一定程度上提高人脂肪源性干细胞对糖尿病肾病模型大鼠受损肾组织的修复作用。

黄芪甲苷孵育脂肪源性干细胞对顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

目的观察黄芪甲苷（Ast）孵育后的脂肪源性干细胞（ADSC）对顺铂诱导的肾小管上皮细胞（HKC）损伤的影响。方法HKC被分为4组：（1）对照组；（2）顺铂组；（3）ADSC与损伤HKC共培养组（ADSC＋HKC组）；（4）Ast孵育ADSC后与损伤HKC共培养组（Ast＋ADSC＋HKC组）。分别用不同浓度的顺铂（2．5、5、10、20μmol／L）诱导HKC6、24h，建立肾小管细胞损伤模型。用Transwell小室与20mg／LAst孵育的ADSC间接共培养48h。流式细胞术（FCM）和原位末端转移酶标记法（TUNEL）检测HKC的细胞凋亡；以增殖细胞核抗原（PCNA）反映HKC增殖情况；ELISA法检测下室HKC培养液中白细胞介素6（IL－6）、T细胞表达和分泌因子（RANTES）、红细胞生成素（EPO）、类胰岛素一号增长因子（IGF－1）的表达；结晶紫染色观察上室膜下ADSC的迁移指数。结果FCM和TUNEL结果均显示，与顺铂组相比，ADSC＋HKC组和Ast＋ADSC＋HKC组细胞凋亡的比例和数量减少，差异有统计学意义（均P〈0．05）；PCNA染色结果显示ADSC＋HKC组和Ast＋ADSC＋HKC组的细胞增殖数量高于顺铂组，差异有统计学意义（P〈0．05）；与顺铂组相比，Ast＋ADSC＋HKC组IL－6、RANTES水平明显降低，EPO、IGF－1水平升高，差异均有统计学意义（均P〈0．05）；结晶紫染色显示Ast＋ADSC＋HKC组ADSC的迁移指数高于其他3组（均P〈0．05）。结论黄芪甲苷可刺激ADSC的旁分泌效应，增强ADSC向受损部位定向迁移，从而减少HKC凋亡。

LncRNAROR对Ad36诱导人脂肪源性干细胞棕色化的作用

目的探讨LncRNA ROR在腺病毒36型（Ad36）诱导的人脂肪源性干细胞棕色化过程中的作用。方法对鸡尾酒法诱导组和Ad36诱导组第2、4、6、8天细胞进行油红O染色，观察人脂肪源性干细胞（hADSC）成脂情况，采用实时定量PCR方法检测2组LncRNA ROR、解耦联蛋白1（UCP1）及PRDM16的mRNA表达水平，Western印迹法检测UCP1及PRDM16的蛋白表达水平。siRNA干扰LncRNA ROR后，实时定量PCR和Western印迹法分别检测Ad36诱导脂肪细胞分化过程中干扰组与对照组UCP1及PRDM16的mRNA和蛋白表达水平。结果油红O染色结果显示，鸡尾酒诱导组的脂肪细胞中脂滴较大，而Ad36诱导组则为颗粒状较小脂滴。与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组LncRNA ROR、UCP1及PRDMl6的mRNA表达水平及UCP1和PRDM16蛋白表达水平显著升高（P〈0．05）。与对照组相比，LncRNA ROR干扰组UCP1及PRDMl6的mRNA及蛋白表达水平显著降低（P〈0．05）。结论Ad36诱导hADSC分化过程中．上调的LncRNA ROR可能通过正向调控UCP1及PRDM16表达，从而促进hADSC的棕色化。

Ad36-Exosome改善脂肪细胞和肝细胞胰岛素抵抗的作用

研究腺病毒36型(Ad36)感染的人脂肪源性间充质干细胞(hADSC)分泌的外泌体(Exosome)对肝细胞和脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。方法 培养人脂肪源性间充质干细胞(hADSC),用鸡尾酒法诱导成脂,油红O染色检测其定向分化为成熟脂肪细胞的能力。用5MOI Ad36感染hADSC后提取外泌体。电镜检测和NTA实验鉴定外泌体大小,采用western-blot的方法检测外泌体标记基因TSG101、CD9、CD63、CD81鉴定外泌体。用Ad36感染的hADSC分泌的外泌体干预肝细胞和脂肪细胞,利用葡萄氧化酶法检测第0、2、4、6、8天培养基中葡萄糖的含量,并以培养皿中细胞总蛋白的含量进行校正。结果 油红O染色结果显示,hADSC可以定向诱导为成熟的脂肪细胞。Ad36可以诱导A549细胞形成细胞病变效应。Ad36感染hADSC细胞后脂肪细胞内甘油三酯合成增多。电镜实验和NTA实验结果显示,分离得到的Ad36感染hADSC细胞分泌的外泌体大小在100nm左右。Western-blot检测外泌体标记基因结果显示外泌体提取成功。外泌体干预肝细胞和脂肪细胞后的第2、4、6、8天与第0天未干预组相比,培养基葡萄糖浓度降低且差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Ad36可能通过外泌体来增加肝细胞和脂肪细胞的葡萄糖摄取,进而改善胰岛素抵抗的作用。

Notch信号在人脂肪源间充质干细胞成脂中的作用

目的通过研究Notch在hADSCs成脂中的作用,为肥胖提供新的药物靶点。方法分离脂肪抽吸液中的hADSCs并进行成脂诱导。RT-qPCR分析成脂中Notch1、Notch2、DLL1和DLL3的表达;DAPT抑制Notch信号,Western-blot检测NICD、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt、PPARγ的表达。结果所分离的细胞可成功诱导成脂。Notch1、Notch2、DLL1和DLL3表达水平在成脂过程中逐渐降低;10μM DAPT可显著降低NICD的表达水平,PPARγ表达水平升高,p-PI3K/PI3K与p-Akt/Akt表达水平均降低。同时使用PI3K/Akt激活剂IGF-1后,PPARγ表达水平下降。结论 Notch信号抑制可通过降低PI3K/Akt通路的活性促进hADSCs成脂。

腺病毒36型对PPARγ和CIDEC在脂肪细胞分化过程的调节作用

为探讨腺病毒36型在人脂肪细胞分化过程中对PPARγ及CIDEC基因表达的调节作用,利用腺病毒感染人脂肪源性间充质干细胞(h AMSC)、油红O染色和RT-q PCR鉴定Ad36诱导h AMSC分化为脂肪细胞模型;葡萄糖氧化酶法和甘油三酯终点法测定人类腺病毒36型(Ad36)诱导h AMSC分化为脂肪细胞的过程中培养基葡萄糖浓度及细胞甘油三酯含量;RT-q PCR、Western Blotting方法检测Ad36诱导的人脂肪细胞中,PPARγ和CIDEC蛋白表达水平的变化;用PPARγ特异性抑制剂GW9662抑制PPARγ表达后,Western Blotting方法检测Ad36诱导的人脂肪细胞中CIDEC蛋白质的表达。Ad36诱导的h AMSC定向分化成人脂肪细胞,分化过程中培养基葡萄糖含量较对照组显著降低(P<0.05),细胞内甘油三酯含量较对照组显著升高(P<0.05),PPARγ和CIDEC基因表达水平较对照组显著升高(P<0.05),在诱导第6天表达水平最高,在使用GW9662抑制PPARγ蛋白质表达后,CIDEC蛋白质表达水平较对照组显著降低(P<0.05)。从细胞水平证实,Ad36诱导人脂肪细胞分化过程中,Ad36通过PPARγ上调CIDEC基因的表达水平。