软骨脱细胞基质复合脂肪源性干细胞构建软骨组织的实验研究

[目的]探讨软骨脱细胞基质支架材料的制备,及其体外复合脂肪源性干细胞构建软骨组织的技术方法。[方法]成年新西兰大白兔脂肪源性干细胞获得,培养,扩增。成年新西兰大白兔新鲜软骨,低温冻干12 h,后经曲拉通、DNA、RNA酶等处理制备成为软骨脱细胞基质支架材料,终浓度为2×107/L的脂肪干细胞种植于软骨脱细胞基质中于软骨细胞方向诱导培养基中培养2周,构建软骨组织。新鲜制备的软骨脱细胞基质及构建的软骨组织分别行组织学、免疫组织化学及透射电镜检测。[结果]实验制备的软骨脱细胞基质支架材料内无细胞结构存在,仅残留空白软骨陷窝。具有合适的孔隙率和孔径大小;复合脂肪源性干细胞后细胞向材料内部迁移,粘附,生长良好。部分载体内细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。[结论]软骨脱细胞基质可作为支架材料应用于软骨组织工程,复合脂肪源性干细胞培养可成功构建软骨组织。

组织块培养法扩增人脂肪源性干细胞的生物学特征鉴定

背景:组织块培养法分离人脂肪源性干细胞并进行体外培养,培养体系简单,节约时间,较好地保持了干细胞的生物学特性,并据此向多方向诱导分化,为组织工程学种子细胞的临床应用提供理论依据和参考路线。目的:观察组织块培养法分离的人脂肪源性干细胞的基本生物学特性、表面抗原特点及其向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化潜能。方法:取健康人腹部皮下脂肪组织,组织块培养法分离出脂肪源性干细胞,进行体外培养,观察其形态特征。流式细胞仪检测第 3 代脂肪干细胞的细胞周期及表面抗原。取第 3 代人脂肪干细胞,分别用成骨和成脂诱导培养液诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,Von Kossa 染色、油红 O 染色定性鉴定。结果与结论:原代及传代的人脂肪干细胞形态均类似成纤维细胞,生长能力旺盛。第 3 代人脂肪干细胞中,超过 88%的细胞都处于 G0/G1期。第 3 代脂肪干细胞表面抗原表达:CD29、CD44、CD90、CD105 表达阳性,CD34、CD45、CD106表达阴性。人脂肪干细胞经成脂诱导后 21 d,油红 O 染色阳性;成骨诱导培养后,茜素红染色和 Von Kossa 染色阳性。因此,实验证实人脂肪源性干细胞能向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化。

脂肪组织源性干细胞研究进展

增加具有完整功能的种子细胞数目是细胞移植的首要环节。近来研究发现,成体动物脂肪组织中含有大量的具有多向分化潜能的间充质干细胞,在特定条件下可分化为多种组织细胞,如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞及神经星状细胞等,且具有极强的自我复制能力,有望成为组织工程理想的种子细胞。本文综述了脂肪组织源性干细胞(ADSCs)的发现、生物学特性、多向分化潜能、应用前景及存在的问题。

以脂肪源性干细胞膜片构建组织工程皮肤

背景:细胞膜片技术以细胞自分泌的透明质酸及胶原蛋白做为内源性支架,能消除外源性支架的各种弊端。人脂肪源性干细胞结合细胞膜片技术用于全层皮肤缺损成为当前的研究热点。目的:综述脂肪源性干细胞膜片研究现状及进展。方法:计算机检索维普、PubMed数据库中1993年1月至2014年4月关于脂肪源性干细胞、细胞膜片技术及皮肤组织工程相关文章。在关键词中以"脂肪源性干细胞,创面愈合,组织工程皮肤,细胞膜片"或"adipose-derived stem cell,wound healing,tissue-engineered skin,cell sheet"为检索词进行检索。最终选择27篇文献进行分析。结果与结论:来源于人废弃脂肪组织的脂肪干细胞具有成体干细胞的多向分化潜能和免疫相容性,可理想的用于再生医学。细胞膜片技术与传统的外源性可降解材料支架构建的组织相比具有多种优势。脂肪源性干细胞结合细胞膜片技术相结合,有利于组织血管化,能从多个方面促进创面愈合,其所分泌的细胞外基质层能提供适宜于细胞分化和生长的微环境,对全层皮肤缺损创面愈合具有正调控作用,可望构建真正的3-D化组织工程皮肤。

地黄低聚糖对人脂肪组织源性间充质干细胞分泌血管内皮细胞生长因子的影响

目的探讨地黄低聚糖(RGO)对分离、培养的人脂肪组织源性间充质干细胞(ADMSCs)分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)的影响。方法人脂肪组织用2.5 g/L胶原蛋白酶Ⅰ消化、分离ADMSCs。取沉淀的细胞进行培养,用免疫细胞化学染色法鉴定其表面CD44、CD105、CD45和CD34分子的表达。以IMDM培养基作为空白对照,加入RGO配成不同浓度(0、1、10、100及400 mg/L)的IMDM分别培养ADMSCs,用MTT比色法检测ADMSCs的增殖。培养72 h后,用ELISA法测定不同培养基中VEGF的含量。结果免疫细胞化学染色显示,分离培养的细胞表面CD44+、CD105+、CD34-、CD45-。MTT比色法的结果显示,与空白对照组相比,1和10 mg/L组无明显差别,100及400 mg/L组明显升高(均P<0.01),且100 mg/L组明显高于400 mg/L组(P<0.05)。0、1、10、100、400 mg/L5个组VEGF的含量,分别为(627.88±33.86)、(655.50±40.29)、(666.50±43.20)、(843.50±53.05)和(722.88±51.34)ng/L。结论RGO对ADMSCs的增殖有促进作用,且呈一定的浓度依赖性,并导致其分泌VEGF的作用增强。

多因子联合诱导脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞

背景:国内均可见有探讨脂肪干细胞向神经元诱导分化的相关研究报道,但运用差速贴壁法纯化脂肪组织源性干细胞,多因子联合诱导脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞的研究鲜有报道。目的:观察多因子联合诱导和分步诱导方案诱导大鼠脂肪组织源性干细胞体外分化为神经元样细胞的可行性。方法:取SD雄性大鼠腹股沟和附睾脂肪垫脂肪组织,酶消化法分离、差速贴壁法纯化脂肪组织源性干细胞。免疫荧光细胞化学法鉴定脂肪组织源性干细胞(CD44,CD49d,CD106);"鸡尾酒"式神经元诱导培养基对脂肪组织源性干细胞进行诱导分化,并用免疫荧光细胞化学法鉴定(Nestin和NeuN)分化结果。结果与结论:大鼠腹股沟和附睾脂肪垫脂肪组织内分离、原代培养的脂肪组织源性干细胞形态均一,呈长梭形,细胞核椭圆形,核仁明显,细胞质染色浅,呈旋涡状克隆样生长;CD44和CD49d阳性表达而CD106阴性;诱导培养基内培养6h后脂肪组织源性干细胞呈锥体形或不规则,有短而细的指状突起;24h后多数细胞显示类神经元的形态学特征,且Nestin和NeuN阳性。提示肪组织源性干细胞在多因子"鸡尾酒"式培养基内可向神经元方向分化。

经脂肪源性干细胞诱导的施万样细胞用于组织工程化人工神经的实验研究

目的研究经大鼠脂肪源性干细胞（ADSCs）体外诱导分化的施万样细胞应用于组织工程化外周神经，修复大鼠坐骨神经缺损的效果。方法Wistar大鼠48只，体重200-250g，随机分成3组，每纽i6只，分别用下面3种不同的方法修复15mm坐骨神经缺损：DMEM组（支架内注射培养基）、诱导组（支架内注射施万样细胞）和自体神经移植组．通过足迹实验（坐骨神经功能指数测定）、神经电生理检测、胫前肌湿重比率测定进行功能检测；应用透射电镜、图像分析系统进行组织学观察。结果术后12周诱导组的SFI指数、神经传导速度、潜伏期、波幅以及胫前肌重量恢复、神经纤维数目、轴突直径、髓鞘厚厦好于DMEM组（P〈0．05），接近自体移植组。再生神经中标记细胞观察显示PKH-26标记的ADSCs，依然呈红色荧光。结论ADSCs诱导分化后的施万样细胞与去细胞同种异体神经两者构建的组织工程化神经能有效地修复大鼠坐骨神经缺损，其效果与自体神经移植相似：ADSCs经诱导后的细胞可以作为组织工程种子细胞新的来源。

脂肪组织源性干细胞分步诱导分化为神经元样细胞

目的探讨脂肪组织源性干细胞(ADSCs)诱导分化为神经元样细胞的可行性。方法 ADSCs分离自雄性SD大鼠附睾脂肪垫,差速贴壁法纯化ADSCs,传至第3代培养细胞行流式细胞术行表型鉴定(CD106,CD11b,CD45,CD90,CD29,CD49d),并进行成脂诱导。取鉴定后的ADSCs用分步诱导法,即先用含10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20ng/ml表皮生长因子(EGF)、2%B27的DMEM/F12培养基I培养,诱导其向神经干细胞转分化,再用含10 ng/ml胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),10 ng/ml脑源性神经营养因子(BDNF),1μmol/L维甲酸(RA)的培养基II诱导分化为神经元样细胞(NLCs),免疫细胞化学法鉴定细胞表面标记物巢蛋白(nestin),神经细胞特异性标志微管相关蛋白(MAP2),神经元核蛋白(NeuN)。结果分离纯化的ADSCs CD90、CD29表达强阳性;成脂诱导分化后细胞油红O染色阳性;ADSCs经培养基I培养7 d后聚集成球样细胞团悬浮于培养液中,表达nestin;继而用培养基II诱导分化4 h后细胞球逐渐贴壁,球周边少数细胞向外发出突起,形似神经元,MAP2、NeuN均呈阳性。结论特定条件下,ADSCs在体外可被逐步诱导分化为NLCs。

脂肪源性干细胞在骨组织工程中的研究进展

脂肪源性干细胞由于其多系分化能力,在多项研究中发挥作用。其在组织工程中具有广阔的应用前景尤其是作为骨组织工程的新型种子细胞,可诱导成骨,应用于临床骨缺损修复。本文就脂肪源性干细胞在骨组织工程中的生物学特性及应用展开综述。

脂肪组织源性干细胞在临床脂肪雕塑术中的指导意义

注射器法吸脂术与自体脂肪颗粒注射填充移植术临床亦称脂肪雕塑术,取材安全方便，供源充足丰富，容易获取，微创无痕，无排斥反应，无伦理学问题，可反复取材，减少术后瘢痕，受区外形满意，手感自然，无供区畸形并能同时获得吸脂减肥瘦身塑体事半功倍的效果，具有良好的组织免疫相容性。脂肪组织是一种新发现的内分泌组织，是现今整形美容外科领域较理想，最具发展潜力的良好的人体软组织填充材料叫。其中脂肪组织源性于细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs）作为组织工程学的种子细胞有着非常重要的研究和应用价值。

脂肪源性干细胞生物学特性及在组织工程中的应用

背景:脂肪源性干细胞具有自我更新及多向分化潜能,在体外适当的诱导条件下可向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、神经细胞和肝细胞等多种细胞分化,在组织工程中具有良好的应用前景。目的:了解脂肪源性干细胞的生物学特征及其在组织工程中的应用。方法:以"tissue-derived stem cells,tissue engineering,脂肪,间充质干细胞,组织工程"为关键词检索Elsevier数据库2000-01/2010-05与中国期刊全文数据库2000-01/2010-05相关文章。结果与结论:脂肪源性干细胞增殖速度快,取材方便、材料来源广,并且能自体取材,避免了免疫排斥问题。目前尚未找到鉴定脂肪源性干细胞的金标准,但研究者采用流式细胞仪和免疫组织化学方法研究发现体外培养的脂肪源性干细胞具有间充质干细胞这一类细胞的特异性表面标记。脂肪源性干细胞可向脂肪、骨、软骨、肌肉、造血、肝和神经等多种细胞分化。组织或器官缺损性疾病、退行性疾病及遗传性疾病可尝试通过组织工程技术将组织来源的干细胞与支架材料复合移植入体内,来解决这一临床难题已成为研究热点。

脂肪源性干细胞体外分离培养及向内皮祖细胞的诱导分化

背景:脂肪源性干细胞是目前组织工程种子细胞的研究热点,通常采用胶原酶消化脂肪组织来获得,但是存在着操作繁琐,花费高等不足。目的:观察组织块培养法分离的脂肪源性干细胞的基本生物学特性及其向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞的诱导分化潜能。方法:无菌条件下切取大鼠双侧腹股沟脂肪组织,组织块法分离培养脂肪源性干细胞,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪分析干细胞表面标志表达。取第4代脂肪源性干细胞用成骨诱导液、成脂诱导液、内皮祖细胞诱导液培养两三周并进行鉴定。结果与结论:组织块培养法得到的脂肪源性干细胞易扩增,传代后以长梭形细胞生长为主,呈漩涡状排列,克隆样生长;经多次传代仍能保持较强的增殖能力,细胞生长曲线呈抛物线形;细胞表面标志CD44、CD90、CD29呈阳性表达,CD45、CD31呈阴性表达。成脂诱导后细胞油红O染色阳性、成骨诱导后细胞茜素红染色阳性。诱导后的内皮祖细胞CD34及Di I-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性。以上结果显示组织块培养法能成功分离培养出脂肪源性干细胞,且获得的细胞纯度较高、易于增殖培养,能高表达干细胞表面抗原以及具有向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞多向分化的潜能,可以满足组织工程研究种子细胞的需求。

利用月经血建立的经血源性基质干细胞系

背景:经血源性基质干细胞被证实是一种新型的成体干细胞,目前国内关于其系统的建系方法报道极少。目的:建立经血源性基质干细胞系,并鉴定其表型和多能性。方法:收集健康成年女性的月经血,通过密度梯度离心法分离出经血源性基质干细胞进行培养,观察细胞的形态及增殖特性;采用CCK-8法检测各株细胞的增殖能力,定期收集细胞进行核型分析,采用流式细胞术检测细胞表面抗原CD34,CD38,CD44,CD45,CD73,CD90,CD105,Oct-4的表达,对细胞进行体外成脂和成骨诱导分化并鉴定。结果与结论:成功从6名健康志愿者的经血中分离获得4株经血源性基质干细胞系。细胞呈现典型的梭状结构,具有46,XX核型,能在体外稳定迅速增殖,传代后大约48 h进入对数生长期,表达CD44,CD73,CD90,CD105及Oct-4,不表达CD38,CD34,CD45;成脂诱导22 d后油红O染色阳性,成骨诱导2周后茜素红染色阳性。实验表明经血源性基质干细胞具备扩增迅速、核型稳定、多潜能性等优点,通过建立经血源性基质干细胞系,为进一步的临床治疗应用以及科学研究奠定了基础。

同种异体脂肪源性间充质干细胞复合β-磷酸三钙支架修复兔桡骨大段骨缺损

目的探讨以β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)陶瓷为支架材料复合兔脂肪源性间充质干细胞(rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells,rADSCs)构建组织工程骨修复骨缺损的可行性。方法将体外培养的rADSCs接种于β-TCP支架上,构建rADSCs/β-TCP骨组织工程复合体,并进行体外培养。将24只新西兰大白兔在双侧桡骨中下段造成2cm长度的节段性骨缺损模型,随机平均分为3组,A组:空白对照组,不植入任何材料;B组:单β-TCP人工骨对照组;C组:rADSCs/β-TCP复合体实验组。在手术后2周、4周、6周和8周时进行X线检查,然后每组各选2只兔处死后取出标本,对标本进行大体观察以及常规HE染色,光镜下观察骨修复情况,并观察是否发生免疫排斥反应。结果 rADSCs在适当的诱导条件下具有成骨细胞分化潜能,复合β-TCP后对其生长分化无影响。X线检查结果发现,A组有稍多的骨组织形成,未见髓腔及正常骨影像学表现;B组虽然骨连接性基本恢复,但骨髓腔尚未完全再通;C组骨连接性完全恢复,骨缺损基本修复,骨髓腔再通。术后4周,C组可观察到骨缺损周围开始形成新生骨,并随着时间的延长新生骨量逐渐增多。术后6周,材料逐渐降解,材料孔隙内有新生骨长入。术后8周,C组材料降解明显,材料孔隙基本消失,髓腔已基本再通;B组部分骨髓腔再通,而A组未发现骨髓腔再通。新生骨组织面积比较,各时间点C组的面积最大,且其差异有统计学意义。组织学检测未见免疫排斥现象。结论 rADSCs在适当的诱导条件下具有成骨细胞分化潜能。ADSCs有望成为理想的修复骨缺损、促进骨折愈合的组织工程骨所需要的种子细胞,为大段骨缺损组织工程的修复提供可行的技术方案,为临床治疗大段骨缺损提供新的方法。

脂肪源干细胞-聚丙烯复合网片的生物相容性实验研究

目的如何避免合成补片与人体组织产生的排异反应是目前急需解决的问题,文中探讨脂肪源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)与聚丙烯网片在动物体内的生物相容性。方法制备兔脂肪源性干细胞悬液。ADSCs传代扩增后,接种到聚丙烯网片支架上,体外培养1周。分别将聚丙烯网片、ADSCs-聚丙烯复合网片植入家兔的腹直肌表面,4周后观察网片腐蚀、粘连情况,HE染色进行组织学观察,采用RT-PCR检测VEGF mRNA的表达水平。结果流式细胞仪检测结果提示ADSCs CD90、CD44、CD73、CD45、CD34及CD14表达分别为98.54%、95.32%、98.49%、1.21%、3.01%、2.14%。聚丙烯网片、ADSCs-聚丙烯复合网片均有不同程度的腐蚀、粘连,但聚丙烯网片粘连更致密。与聚丙烯比较,ADSCs-聚丙烯复合网片诱导慢性炎症反应轻,炎症评分降低[(1.1±0.2)分vs(0.6±0.1)分,P=0.001],新生血管形成评分升高[(1.7±0.0)分vs(2.6±0.3)分,P=0.000],成纤维细胞增殖评分升高[(0.9±0.1)分vs(2.2±0.2)分,P=0.001]。ADSCs-聚丙烯复合网片周围组织VEGF mRNA含量高于聚丙烯网片(t=94.6,P<0.05)。结论 ADSCs-聚丙烯复合网片具有良好的生物相容性,可作为脂肪组织工程较理想的生物支架材料。

脂肪源性干细胞无酶分离培养方法的研究

目的探索适合临床治疗应用的脂肪源性干细胞(ADSCs)分离培养方法。方法分别采用无酶分离法和胶原酶消化法从脂肪抽吸术抽吸的人脂肪组织中分离培养细胞,对比分析分离的间充质干细胞特性。结果无酶分离法所需时间仅为胶原酶消化法的1/3,分离的细胞在细胞形态学、增殖能力、免疫表型、分化潜能等特性与胶原酶消化法分离培养的细胞一致。结论无酶分离法能够从脂肪抽吸术抽吸的人脂肪组织中分离培养出ADSCs,是一种安全可靠、适合临床应用的ADSCs分离培养方法。

脂肪源性干细胞的研究进展

种子细胞一直是组织工程研究的焦点。继骨髓间充质干细胞以后,干细胞领域又发现一种新的成体干细胞——脂肪源性干细胞,它可向骨、软骨、脂肪、肌肉、内皮和神经等多种细胞分化。脂肪干细胞由于具有多种优点而逐渐成为组织工程的种子细胞。通过分析脂肪干细胞的多向分化能力,对这一领域最新的研究进展及应用前景进行探讨。