人脐带血间充质干细胞条件培养基在白血病患儿口腔黏膜炎中的疗效观察

目的探讨人脐带血间充质干细胞条件培养基在白血病患儿口腔黏膜炎中的临床疗效。方法 2015年1-12月收治的白血病患儿312例,共发生口腔黏膜炎124例,随机分为两组,每组62例。对照组采用生理盐水漱口后,在溃疡面涂抹外用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子凝胶(金扶宁rhGM-CSF);观察组采用生理盐水漱口后,在溃疡面涂抹人脐带血间充质干细胞培养基(hUCB-MSC-CM)。观察两组患儿口腔创面愈合时间及愈合率。结果观察组口腔创面愈合时间5~14d,愈合率91.9%;对照组口腔创面愈合时间5~14d,愈合率67.7%,观察组明显优于对照组(P<0.05)。结论人脐带血间充质干细胞培养基在白血病患儿口腔黏膜炎中疗效显著。

人脐带血间充质干细胞条件培养基的制备及其生物学特性

目的探讨人脐带血(human umbilical cord blood,hUCB)来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)条件培养基(conditionedmedium,CM)的制备方法,并分析MSCs的旁分泌作用。方法无菌条件下收集足月健康新生儿的脐带血,经肝素抗凝,离心后分离、培养、传代hUCB-MSCs,用倒置显微镜观察不同时期细胞的生长情况和形态特征,并用酶标仪检测细胞增殖情况,待细胞融合达80%时更换培养基,再继续培养24h后收集培养上清液即为人脐带血间充质干细胞条件培养基(hUCB-MSCs-CM)。结果经过传代后,人脐带血间充质干细胞形态趋于均一,为梭形或成纤维样、体积较大、单个核,呈漩涡样生长,且增殖能力较强,能较好的制备出其条件培养基。结论能通过此方法成功制备人脐带血间充质干细胞条件培养基,其中含有MSCs旁分泌的各种生物活性因子,可以作为一种新的治疗来源应用于临床。

人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

背景:间充质干细胞可通过分泌含细胞因子、生长因子和外泌体的细胞外囊泡调节肿瘤微环境,对肿瘤细胞生物学行为进行精准调控。目的:研究人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞生物学特性的影响。方法:收集人脐带间充质干细胞培养上清,通过高速离心并过滤获得人脐带间充质干细胞条件培养基;收集人脐带间充质干细胞培养上清,通过超高速梯度离心法提取人脐带间充质干细胞外泌体。使用PKH26标记人脐带间充质干细胞外泌体,与肝癌细胞MHCC97-H共培养,荧光显微镜观察MHCC97-H细胞摄取外泌体情况。通过CCK-8增殖实验、Transwell迁移和侵袭实验以及流式凋亡实验评估人脐带间充质干细胞条件培养基、人脐带间充质干细胞外泌体对肝癌细胞生物学功能的影响。结果与结论:(1)人脐带间充质干细胞外泌体可被MHCC97-H细胞摄取且主要分布于细胞质中;(2)人脐带间充质干细胞条件培养基处理后,MHCC97-H细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著增强(P<0.001,P<0.05,P<0.01),凋亡能力显著下降(P<0.001);而人脐带间充质干细胞外泌体处理后,MHCC97-H细胞的增殖能力下降(P<0.001),迁移、侵袭及凋亡能力显著增强(P<0.001);(3)结果表明,人脐带间充质干细胞条件培养基具有促进MHCC97-H细胞增殖、迁移、侵袭和抑制凋亡的能力;而人脐带间充质干细胞外泌体则具有促进MHCC97-H细胞迁移、侵袭及凋亡和抑制增殖的能力。

年轻化间充质干细胞条件培养基促进小鼠创面愈合的研究

背景间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)条件培养基无细胞疗法是创伤修复领域的一种新型治疗方案,但其治疗效果受间充质干细胞状态的影响。目的探究年轻化MSC培养基对小鼠创面愈合的作用。方法建立间充质干细胞复制性衰老(传代至15~20代)模型,检测其衰老指征;使用小分子化合物[丙戊酸(valproic acid,VPA)和RepSox]逆转衰老间充质干细胞并验证逆衰老效果。分别收集衰老MSC培养基与年轻化MSC培养基。用收集到的两种条件培养基培养人成纤维细胞,使用CCK-8实验、Ki-67免疫荧光、划痕实验和Transwell实验检测这两种条件培养基对成纤维细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。分别用衰老MSC培养基、年轻化MSC培养基和0.9%氯化钠注射液治疗C57BL/6小鼠背部皮肤全层缺损模型,评估3种治疗方法对创面愈合的影响。结果与衰老的间充质干细胞相比,经小分子处理后衰老间充质干细胞SA-β-gal阳性率降低(P<0.01),且免疫荧光检测显示其衰老基因P21、P16表达降低(P<0.01)。经年轻化MSC培养基处理的成纤维细胞增殖、迁移和侵袭能力增强(P<0.01)。创伤模型显示,与对照组相比,年轻化MSC培养基治疗组小鼠创面愈合速度加快(P<0.01);年轻化MSC培养基治疗组小鼠创面HE染色显示表皮细胞再上皮化加快(P<0.01)、Masson染色显示创面胶原沉积量增加(P<0.01)、CD31免疫荧光染色显示创面血管量增加(P<0.01)。结论年轻化MSC培养基对小鼠创面修复或有促进作用。

骨髓间充质干细胞条件培养基治疗大鼠糖尿病足溃疡的疗效及机制

目的探讨骨髓间充质干细胞条件培养基(mesenchymal stem cell-conditioned medium,MSC-CM)治疗大鼠糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcer,DFU)的疗效与机制。方法通过高脂饮食和腹腔注射STZ建立2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)SD大鼠模型,对大鼠后肢进行手术,制作DFU模型,大鼠分为正常对照(normal control,NC)组、糖尿病对照(diabetes mellitus control,DM-C)组、MSC-CM组和间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)组共4组,每组各6只。MSC-CM组在溃疡周围注射大鼠骨髓MSC-CM,MSC组给予大鼠骨髓MSC注射治疗,其他两组给予PBS注射治疗。治疗后,对创面部位皮肤愈合、再上皮化(通过HE染色检测皮肤颗粒层的厚度)、细胞增殖(通过免疫组化法检测ki-67)、血管生成(通过免疫荧光法检测CD31)、自噬(通过免疫荧光法和Western blot法检测LC3B,电镜观察自嗜溶酶体)和细胞焦亡(通过Western blot法检测IL-1β、NLRP3、caspase-1、GSDMD和GSDMD-N)进行评估。结果治疗后,MSC-CM组创面面积与IL-1β、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N均低于DM-C组;MSC-CM组皮肤颗粒层厚度、ki-67、CD31和LC3B均高于DM-C组。对DFUs大鼠注射MSC-CM能够加速创面愈合、促进细胞增殖和血管生成、增强细胞自噬和减少创面中的细胞焦亡。结论MSC-CM可用于治疗大鼠DFU,加速伤口愈合过程,有望成为一种新的无细胞治疗方法。

人脐带间充质干细胞来源外泌体降低脊髓损伤后血脊髓屏障的通透性

背景:研究发现,内皮素参与了脊髓损伤后血脊髓屏障的破坏,干细胞来源外泌体可降低血脊髓屏障的通透性,修复脊髓损伤。目的:观察人脐带间充质干细胞来源外泌体是否可以通过抑制内皮素1表达降低血脊髓屏障的通透性,进而修复脊髓损伤。方法:用超速离心法从人脐带间充质干细胞培养上清液中提取外泌体,透射电子显微镜观察其形态,Western blot检测tsg101、CD63的表达。80只SD大鼠随机分成假手术组、模型组、外泌体组、内皮素1组(n=20),采用改良Allen’s法制备大鼠脊髓损伤模型,内皮素1组用微量注射器直接向损伤部位注射10μL(1μg/mL)内皮素1,术后即刻及1,2 d,分别给予假手术组、模型组尾静脉注射200μL PBS,外泌体组、内皮素1组尾静脉注射200μL外泌体(200μg/mL)。脊髓损伤后第1,3,7,14,21天进行后肢运功功能评分;损伤后第7天通过伊文思蓝染色观察血脊髓屏障通透性,Western blot检测脊髓组织中紧密连接蛋白ZO-1、β-Catenin、Occludin和内皮素1的表达。结果与结论:①外泌体组BBB评分在损伤后3-21 d显著高于模型组(P<0.05),苏木精-伊红染色显示外泌体组脊髓损伤较模型组明显减轻;内皮素1组BBB评分较外泌体组显著降低(P<0.05),内皮素1组脊髓损伤较外泌体组加重;②模型组内皮素1表达量较假手术组显著增加(P<0.05),外泌体组内皮素1表达量较模型组显著降低(P<0.05);③与模型组比较,外泌体组血脊髓屏障伊文思蓝渗出量显著减少(P<0.05),紧密连接蛋白β-Catenin、Occludin、ZO-1的表达增加(P<0.05);与外泌体组比较,内皮素1组伊文思蓝渗出量显著增加(P<0.05),上述紧密连接蛋白表达量显著减少(P<0.05);④结果表明,人脐带间充质细胞来源外泌体通过下调内皮素1表达来保护血脊髓屏障的通透性,起到了修复脊髓损伤的作用。

补肾活血解毒方联合脐带间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠的治疗作用

目的:观察补肾活血解毒方联合大鼠脐带间充质干细胞(rUCMSCs)移植对急性肝衰竭(ALF)大鼠的治疗作用。方法:采用两步消化法提取rUCMSCs。使用D-氨基半乳糖/脂多糖(D-gal/LPS)构建ALF大鼠模型,24 h后将存活的40只模型大鼠随机分成中药联合移植组、移植对照组、中药对照组及空白对照组。中药联合移植组和移植对照组予以2×10^(6)个rUCMSCs尾静脉注射,余下两组予以等体积无菌PBS溶液尾静脉注射;中药联合移植组和中药对照组予以补肾活血解毒方灌胃(每次10 mL/kg),其余两组予以等量生理盐水灌胃,每日观察各组大鼠一般情况。治疗后第7天,计算各组大鼠7天生存率,并检测其血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(TBIL)水平,然后通过苏木-伊红(HE)染色观察其肝、肺组织病理学改变。结果:造模后,模型大鼠生存状态逐渐下降,肝功能明显异常。经治疗后,中药联合移植组、移植对照组、中药对照组、空白对照组生存率分别为70%、50%、40%、20%,中药联合移植组生存率显著高于空白对照组(P﹤0.05);中药联合移植组大鼠血清TBIL、ALT、AST水平显著下降,与移植对照组、中药对照组、空白对照组相比,差异有统计学意义(P﹤0.05);病理检测显示中药联合移植组大鼠肝脏组织明显修复,肝小叶结构完整,炎性细胞浸润明显减少,且未见肺栓塞、肺纤维化等不良反应。结论:补肾活血解毒方联合rUCMCSs移植治疗可明显缓解ALF大鼠肝脏炎症反应,改善肝功能,促进肝再生,提高ALF大鼠的存活率,且治疗效果优于二者单独应用,补肾活血解毒方与rUCMCSs联合应用对ALF的治疗具有协同作用。

脐带血间充质干细胞对角膜新生血管形成的抑制作用

目的:研究球结膜下注射人脐带血来源的间充质干细胞悬液治疗角膜碱烧伤新生血管的有效性。方法:本研究将30只新西兰家兔制备右眼碱烧伤模型,随机分实验组和对照组各15只(15眼)。实验组球结膜下注射脐带血来源间充质干细胞悬液,对照组不给予球结膜下治疗。采用裂隙灯生物显微镜观察并拍照记录注射后第5天,14天角膜新生血管情况,计算角膜新生血管面积。取两组角膜进行HE染色,观察角膜上皮愈合情况。结果:实验结果显示,第5天实验组和对照组之间的角膜新生血管面积差异没有显著性统计意义(P > 0.05),但第14天实验组的新生血管面积显著小于对照组(P < 0.05)。结论:本研究结果证明,球结膜下注射人脐带血间充质干细胞可抑制角膜新生血管并促进碱烧伤角膜上皮的修复。

人脐带间充质干细胞条件培养基体外支持造血的功能

本研究旨在探讨单纯人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)的条件培养基对脐血CD34+细胞体外造血支持作用。分离得到的hUC-MSC以2×106接种于75 cm2培养瓶中,48 h后收集培养上清作为条件培养液。用人脐血CD34阳性分选试剂盒分选CD34+细胞。将CD34+细胞接种在3个培养体系中:hUC-MSC条件培养液+不完全甲基纤维素培养基、完全甲基纤维素阳性培养基和含10%胎牛血清的DMEM/F12+不完全甲基纤维素作为阴性培养基。培养14d观察集落的形态特征,统计细胞数≥50的造血集落单位数。流式细胞术检测组成集落形成单位的细胞免疫表型。结果表明:hUC-MSC条件培养基中能够形成集落形成单位,且以粒系和粒-巨噬集落形成单位为主(CFU-G 47.67±0.58、CFU-GM 48.67±4.73、CFU-M 3.00±2.00),未观察到红细胞系相关的集落形成单位。阳性培养基中各种集落形成单位均可见,阴性培养体系中无集落形成单位。流式细胞术检测条件培养基组CD45+细胞比例为(97.43±2.15)%,显著高于阳性对照中CD45+细胞比例(39.69±0.96)%(P<0.05)。结论:在体外hUC-MSC条件培养基能够促进CD34+细胞的发育分化,单纯hUC-MSC条件培养基具有造血支持功能,并促进CD34+细胞向髓系分化,但不能促进向红细胞分化。

外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶修复大鼠皮肤损伤

背景:近来多数研究将组织工程材料与干细胞或细胞因子复合来改善动物模型皮肤损伤。鼻黏膜来源的外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉可以长期保存,用于修复皮肤损伤具有独特的优势。目的:观察外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶修复大鼠皮肤缺损的效果。方法:体外培养SD大鼠鼻黏膜来源的外胚间充质干细胞,第3代细胞的培养基透析后冷冻干燥制成冻干粉。将30只皮肤缺损SD大鼠按治疗方法分为3组(n=10):损伤对照组,不接受特殊治疗作为对照;纤维蛋白胶组,局部应用纤维蛋白胶;条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶组,局部应用含有外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉的纤维蛋白胶。治疗后动态观察创面愈合情况,测量创面面积,对皮肤组织切片进行苏木精-伊红染色和CK8、P63免疫组化染色。结果与结论:条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶组创面愈合速度高于纤维蛋白胶组和损伤对照组(P<0.001)。条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶组创面表皮和真皮在21 d全部再生修复;纤维蛋白胶组再生皮肤较薄;单纯创伤组皮肤再生不完全。在大鼠模型中,外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶联合使用可以促进损伤皮肤的伤口愈合。

多发性骨髓瘤细胞条件培养液对人脐带间充质干细胞增殖和分化的影响

背景:近年来,在肿瘤微环境中干细胞与肿瘤的相互作用已成为研究热点,但是多发性骨髓瘤细胞条件培养液对人脐带间充质干细胞影响的实验鲜有报道。目的:探讨多发性骨髓瘤细胞条件培养液对人脐带间充质干细胞增殖、迁移及分化能力的影响。方法:以组织块贴壁法提取人脐带间充质干细胞,同时培养并提取人多发性骨髓瘤RPMI8226和U266细胞上清液制备条件培养液。按培养基的不同进行细胞分组:对照组人脐带间充质干细胞仅用L-DMEM完全培养液培养;实验组人脐带间充质干细胞用20%RPMI8226细胞条件培养液或20%U266细胞条件培养液和80%L-DMEM完全培养液培养。培养24 h,通过CCK-8、EDU、结晶紫染色观察细胞增殖情况,划痕法评估细胞迁移情况,成骨成脂诱导实验检测细胞分化能力,Real-time PCR检测细胞中周期蛋白基因p16、p21 mRNA表达。结果与结论:实验组细胞的增殖数量多于对照组(P <0.05),迁移率高于对照组(P <0.05),矿化结节染色面积小于对照组(P <0.05),脂滴阳性染色面积大于对照组(P <0.05);实验组的细胞周期基因p16、p21 mRNA表达低于对照组(P <0.05)。结果表明,人多发性骨髓瘤细胞条件培养液可促进人脐带间充质干细胞的增殖、迁移和成脂分化,抑制成骨分化,可能与其抑制p16、p21基因表达有关。

间充质干细胞治疗皮瓣缺血再灌注损伤的作用机制及优势

背景:间充质干细胞因具有抗氧化、抑制炎症反应和诱导血管新生等作用而被用于皮瓣缺血再灌注损伤中。目的:综述间充质干细胞在治疗皮瓣缺血再灌注损伤方面的作用机制和最新进展,为其进一步理论研究和临床合理应用提供依据。方法:检索CNKI中国期刊全文数据库、万方数据库和PubMed数据库收录的相关文献。中文检索词为“间充质干细胞;皮瓣缺血再灌注损伤;条件培养基;外泌体;氧化应激;炎症反应;血管新生”。英文检索词为“mesenchymal stem cells;flap ischemia reperfusion injury;Conditioned medium;exosomes;Oxidative stress;Inflammatory reaction;Angiogenesis”。检索2010年以来相关文献,通过阅读文章剔除研究内容与文章主题关系不大、质量较差及内容陈旧文献,最终纳入74篇文献进行归纳总结。结果与结论:①间充质干细胞在抗氧化、抑制炎性反应及诱导血管新生等方面作用显著,在治疗皮瓣缺血再灌注损伤中蕴含着巨大潜力。②然而,间充质干细胞自身的缺陷及近年来治疗效果的下降使间充质干细胞的发展和应用陷入了瓶颈期,间充质干细胞条件培养基及其外泌体和间充质干细胞可塑性研究应运而生,且治疗效果明显优于单纯使用间充质干细胞。③因此,更全面地了解间充质干细胞治疗皮瓣缺血再灌注损伤的作用机制和最新治疗进展,对于间充质干细胞的研究和皮瓣缺血再灌注损伤的治疗都具有非常重要的意义。

人脐带间充质干细胞制备工艺研究

建立人脐带间充质干细胞标准化的制备工艺。比较不同培养基、消化液及消化时间处理人脐带间充质干细胞的增殖水平、表型、分化功能;设计不同细胞接种密度及汇合度进行培养,观察细胞生长状态并计算细胞倍增时间。人脐带间充质干细胞在MSC-T4培养基中,CTS消化酶消化3 min表现出更佳的增殖水平、间充质干细胞表型、成骨、成脂的能力;10000 cells/cm^(2)和8000 cells/cm^(2)的细胞接种密度分别是最合适的人脐带间充质干细胞复苏接种密度和传代接种密度;90%~95%汇合度为人脐带间充质干细胞传代最佳汇合度。

脐带血来源间充质干细胞体外分离培养条件的优化

脐带血间充质干细胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)不仅可以作为滋养层细胞支持造血干细胞在体外的大规模扩增,在造血移植过程中还能够降低并发症的发生率以及加速造血重建功能的恢复.但是,目前UCB-MSCs的原代分离培养成功率一般只有30%左右,为进一步提高该成功率,利用正交实验方法对UCB-MSCs体外培养的主要影响因素:细胞的接种密度、细胞因子的组合及用量、是否添加血清和滋养层细胞,进行逐层筛选,并对培养出的间充质干细胞进行了流式细胞分析和向成骨、软骨及脂肪方向的诱导分化检测,以期获得UCB-MSCs培养的最佳方法.实验结果表明,细胞的接种密度是UCB-MSCs培养最显著的影响因素(P<0.1),接种密度越大,MSCs越容易生长,能够培养出MSCs的几率就越大,其次为细胞因子,添加细胞因子能有效地刺激MSCs的生长.在高接种密度的基础上,添加细胞因子IL-3(15μg/L)和GM-CSF(5μg/L),可大大提高UCB-MSCs体外原代培养的成功率,从30%左右提高到90%以上.流式细胞检测结果显示,所分离培养的细胞表达间充质干细胞的抗原(CD13+、CD29+、CD44+、CD105+、CD166+),不表达造血细胞的抗原(CD34-、CD45-、HLA-DR-),并能够向成骨、软骨及脂肪方向分化,这与源于骨髓的间充质干细胞相一致.所建立的培养方法能够为UCB-MSCs的临床应用提供大量优质的种子细胞.

不同胎牛血清浓度培养的人脐带间充质干细胞的条件培养基对角膜上皮细胞损伤修复的影响

目的探讨不同胎牛血清(FBS)浓度培养下人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)条件培养液(hUCMSCCM)对角膜上皮细胞损伤修复的促进作用。方法采用贴壁法培养,以含有1%,3%,5%,10%的FBS培养基培养P6代hUCMSCs并收集4种培养条件下的培养基,利用CCK-8方法检测细胞hUCMSCCM对角膜上皮细胞增殖的影响;收集4种hUCMSCCM培养损伤的角膜上皮细胞,检测其对角膜上皮细胞损伤修复的影响;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测4种hUCMSCCM中血小板源性生长因子(PDGF)和白细胞介素-8(IL-8)的含量。结果①收集的4种hUCMSCCM均能促进角膜上皮细胞增殖,随着培养时间的延长,其中1%hUCM-SCCM和3%hUCMSCCM2组条件下,角膜上皮细胞的增殖能力显著高于其他实验组和对照组;②4种hUCM-SCCM均促进角膜上皮细胞的迁移,1%hUCMSCCM在24 h促进角膜上皮细胞损伤修复最为显著,随着时间延长,除10%hUCMSCCM组外其余组均表现出显著的促进角膜上皮细胞损伤修复的能力;③4种UCMSCCM中PDGF的分泌具有差异性,随着血清浓度的增大,PDGF的含量逐渐减少;而IL-8的分泌与血清浓度的增加呈现正相关性。结论不同浓度FBS培养的hUCMSCCM对角膜上皮细胞增殖和损伤修复具有促进作用,其中1%FBS hUCMSCCM在24 h修复和促增殖最为显著;其作用是通过分泌修复因子促进角膜上皮细胞的增殖和迁移,从而保护角膜上皮细胞。干细胞条件培养基将成为角膜上皮损伤的新治疗方法。

电针联合人脐带间充质干细胞移植对缺血性脑损伤大鼠血脑屏障及腺苷A2A受体、GSK-3β/β-catenin表达的影响

【目的】观察电针百会、风府、双侧肾俞穴联合人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)移植对缺血性脑损伤大鼠的脑保护作用及机制。【方法】将40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、移植组、联合组,每组10只。除正常组,其他各组大鼠建立脑缺血再灌注损伤模型。在造模结束24 h后,移植组大鼠给予0.5 m L 2×10^(6)个hUC-MSCs细胞悬液一次性尾静脉植入,联合组在移植组治疗基础上,给予电针百会穴、风府穴、双侧肾俞穴,每次30 min,每日1次,连续针刺3周。治疗结束后,苏木素-伊红(HE)染色法观察海马组织病理形态,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法观察脑组织细胞凋亡情况,免疫荧光法检测脑组织腺苷A2A受体(ADORA2A)表达,免疫组织化学法检测脑组织糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、β-连环蛋白(β-catenin)表达,Western Blot法检测脑组织跨膜蛋白闭锁蛋白(Occludin)、胞质附着蛋白(ZO-1)表达。【结果】与正常组比较,模型组脑组织细胞凋亡率升高,脑组织ADORA2A阳性表达率及GSK-3β蛋白表达水平升高,Occludin、ZO-1、β-catenin蛋白表达水平降低(P<0.05),HE染色结果显示,模型组海马组织结构明显异常;与模型组比较,移植组和联合组大鼠脑组织细胞凋亡率降低,脑组织ADORA2A阳性表达率及GSK-3β蛋白表达水平降低,Occludin、ZO-1、β-catenin蛋白表达水平升高(P<0.05),海马组织病理程度明显减轻;与移植组比较,联合组脑组织细胞凋亡率降低,脑组织ADORA2A阳性表达率及GSK-3β蛋白表达水平降低,Occludin、ZO-1、β-catenin蛋白表达水平升高(P<0.05)。【结论】电针百会、风府、双侧肾俞穴联合hUC-MSCs可改善缺血性脑损伤大鼠血脑屏障,抑制脑组织ADORA2A、GSK-3β表达,提高β-catenin表达,抑制脑组织细胞凋亡,起到脑保护作用,且作用效果优于单纯hUC-MSCs移植。

人脐带间充质干细胞经添加B27的无血清培养基诱导后分化成神经元样细胞

目的评价人脐带间充质干细胞(HUCMSCs)经添加B27的无血清培养基诱导后向神经元样细胞分化的能力和效率。方法将第4代HUCMSCs分为4组:A组:血清培养基(SCM)处理14 d;B组:给予SCM+20 ng/mL神经生长因子(NGF)+10 ng/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)治疗14 d;C组:无血清培养基(SFM)处理14 d;D组:SFM+20 ng/mL NGF+10 ng/mL bFGF处理。每3 d更换各组细胞培养液。倒置显微镜观察神经球生长情况,流式细胞术分析细胞标记物。巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、人重肽神经丝蛋白(NEFH)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)通过qRT-PCR和Western blotting进行定量。结果在诱导前,HUCMSCs表现出丰富的间充质干细胞表面标志物(CD29、CD44和CD105分别为99.5%、49.6%和77.7%)的表达。在第7、10、14天观察神经元样细胞的形成,D组最优,其次是C、B、A组。qRT-PCR和Western blotting结果显示,A、B、C、D组Nestin和GFAP表达逐渐减少,NEFH和NSE表达逐渐增加,A组与其他3组的GFAP、NEFH、Nestin和NSE表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论添加B27的SFM可以有效地将HUMSCs分化为神经元样细胞,添加细胞因子(NGF和bFGF)使分化效果更显著。

人脐带间充质干细胞的条件培养基对炎症因子致人脐静脉内皮细胞凋亡的保护作用

目的:研究人脐带间充质干细胞(MSC)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)和脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的保护作用。方法:随机分为Control、TNF-α、TNF-α+CM、LPS和LPS+CM组。倒置显微镜观察细胞形态,CCK-8法测定细胞增殖活性,Hoechst染色和流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡关键蛋白的表达。结果 :倒置显微镜下Control组HUVEC形态正常,TNF-α和LPS组部分细胞形态改变,但TNF-α+CM组较TNF-α组和LPS+CM组较LPS组,细胞形态改变数量显著降低。CCK-8法结果示,Control组细胞数量随时间增加,TNF-α和LPS组明显下降,而TNF-α+CM组和TNF-α组,LPS+CM组和LPS组相比,细胞数量则显著增加。Hoechst和流式结果示:与Control组相比,其余4组HUVEC凋亡率升高,TNF-α和LPS组最显著,但TNF-α+CM组较TNF-α组,LPS+CM组较LPS组,细胞凋亡率显著下降(P<0.05)。此外,TNF-α和LPS组中活化型Caspase 3表达量较Control组显著增高,Bcl-2/BAX显著降低,但TNF-α+CM组较TNF-α组,LPS+CM组较LPS组,活化型Caspase 3表达量显著下降和BCL-2/BAX显著增加(P<0.05)。结论:人脐带MSC的条培可显著降低由TNF-α和LPS诱导HUVEC增殖活性降低和细胞凋亡率增加的程度,可能与条培中含有大量细胞因子发挥抑制促凋亡关键蛋白表达的机制有关。

间充质干细胞条件培养基和细胞因子联合应用扩增造血干细胞

目的:优化造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)体外扩增方案,提高扩增效率。方法:从脐带血中通过免疫磁珠分选法获得CD34+HSCs;组织块贴壁法原代分离培养获得脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),扩增后收集条件培养基;将固定细胞因子组合与MSCs条件培养基联合应用于HSCs扩增培养,通过细胞计数、流式检测及集落分析来判定扩增效应。结果:联合培养方案的造血细胞的数量、CD34+HSCs的比例及集落形成的数量均明显多于单独利用细胞因子组合时。结论:MSCs条件培养基和细胞因子联合应用能明显提高HSCs扩增效率。

人骨髓间充质干细胞通过YAP影响人脂肪肉瘤SW872细胞的生物学行为

目的:观察人骨髓间充质干细胞(hMSCs)条件培养基(CM)与人脂肪肉瘤SW872细胞共培养后对肿瘤细胞增殖和迁移能力的影响,探讨hMSCs CM对脂肪肉瘤细胞的作用及可能的作用机制。方法:体外培养hMSCs,采用慢病毒方法分别转染慢病毒空载体shNS(对照组)和慢病毒shRNA Yes相关蛋白(YAP)(shYAP-hMSCs组),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组hMSCs中YAP mRNA和蛋白表达水平,提取CM。体外培养SW872细胞,分为对照组(正常培养)、hMSCs CM组和shYAP-hMSCs CM组。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,细胞划痕实验检测各组细胞划痕愈合率,Western blotting法检测各组细胞中YAP、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)蛋白表达水平。结果:与对照组比较,shYAP-hMSCs组hMSCs中YAP mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01),表明成功构建了shYAP-hMSCs稳定转染细胞株。CCK-8法,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞增殖活性升高(P<0.05),shYAP-hMSCs CM组SW872细胞增殖活性降低(P<0.01);流式细胞术,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞凋亡率无明显变化(P>0.05),shYAP-hMSCs CM组SW872细胞凋亡率升高(P<0.01);细胞划痕实验,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞划痕愈合率升高(P<0.05),shYAP-hMSCs CM组SW872细胞划痕愈合率降低(P<0.01);Western blotting法,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞中YAP、MMP-9和cyclin D1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),shYAP-hMSCs组SW872细胞中YAP、MMP-9和cyclin D1蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。结论:hMSCs参与调控人脂肪肉瘤SW872细胞增殖和迁移,其机制可能与YAP表达有关。