微球化人脐带Wharton胶间充质干细胞移植裸鼠皮下构建异位软骨

背景:软骨细胞外基质具有众多的信号分子蛋白和因子,其成分和特性最接近天然软骨组织,因而其很可能是构建组织工程软骨的最理想原料。目的:探讨海藻酸钙-软骨细胞外基质混合凝胶微球复合人脐带Wharton胶间充质干细胞在裸鼠皮下异位构建组织工程软骨的可行性。方法:制备软骨细胞外基质微丝悬液,将人脐带Wharton胶间充质干细胞接种于海藻酸钙-软骨细胞外基质混合凝胶微球中体外培养后植入裸鼠背部皮下(实验组),以人脐带Wharton胶间充质干细胞混合于单纯藻酸盐凝胶微球作为对照组,于4周后取材进行大体和组织学苏木精-伊红、甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组化观察。结果与结论:体外培养时微球中干细胞呈球形软骨细胞样形态,生长、增殖情况良好;实验组术后第4周取材可见外形呈类软骨样组织块,甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,镜下观察可见大量类软骨样细胞及类软骨陷窝样结构,植入的混合凝胶微球周围组织无明显炎症反应;对照组显示微球部分降解,周围仅有少量炎症细胞及淋巴细胞。结果可见海藻酸钙-软骨细胞外基质具有良好的组织相容性,复合干细胞形成的微球植入裸鼠皮下可以构建为类软骨样组织。

自体脂肪间充质干细胞复合人脐带Wharton胶支架修复兔膝关节软骨缺损

背景:脐带Wharton胶富含透明质酸,糖胺多糖及胶原等,成分与天然软骨细胞外基质类似,因此由人脐带提取的Wharton胶很可能是一种较为理想的软骨组织工程支架材料。目的:评价自体脂肪间充质干细胞复合人脐带Wharton胶支架修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法:将终浓度为1010L-1、成软骨方向诱导后的兔自体脂肪间充质干细胞与人脐带Wharton胶支架复合,继续培养1周构建组织工程软骨,对兔膝关节全层软骨缺损进行修复(实验组),并与单纯支架修复的对照组及空白组进行比较。术后3个月对修复组织行大体观察、组织学检测、糖胺多糖、总胶原定量检测及生物力学测定。结果与结论:实验组的缺损多为透明软骨修复,对照组以纤维组织修复为主,空白组无明显组织修复。提示脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞具有可行性;实验构建的组织工程软骨能有效的修复关节软骨缺损,人脐带Wharton胶可作为软骨组织工程良好的支架材料。

关节软骨细胞外基质/人脐带Wharton胶复合多孔支架的制备及评估

背景:软骨组织工程主要包括种子细胞、支架材料、细胞因子及生物反应器等,其中支架材料是构建组织工程软骨的关键环节。目的:制备关节软骨细胞外基质/人脐带Wharton胶复合多孔支架,评估其理化特性及细胞相容性。方法:采用物理法分别制备猪关节软骨细胞外基质及人脐带Wharton胶,然后以冻融干燥法制备关节软骨细胞外基质/人脐带Wharton胶复合多孔支架,检测支架的孔隙率、吸水率、组织成分及纵向压缩弹性模量,并进行组织学染色。将关节软骨细胞外基质/人脐带Wharton胶复合多孔支架与兔软骨细胞共培养7 d,进行扫描电镜观察、活-死细胞染色及苏木精-伊红染色;分别采用关节软骨细胞外基质/人脐带Wharton胶复合多孔支架浸提液与细胞培养液培养兔软骨细胞6 d,MTT法检测细胞增殖。结果与结论:(1)关节软骨细胞外基质/人脐带Wharton胶复合多孔支架横断面为均匀的多孔网状结构,孔壁上密布软骨纤维,纵断面为垂直管状结构,支架苏木精-伊红红染、番红O及甲苯胺蓝染色均呈阳性,含有胶原和糖胺多糖成分,支架的吸水率、孔隙率和纵向压缩弹性模量分别为(17.418 8±0.909 0)%、(81.495 1±6.621 0)%和(2.833 3±0.456 4)k Pa;(2)共培养7 d,兔软骨细胞在支架上黏附和增殖,并均匀长入支架孔隙内;(3)关节软骨细胞外基质/人脐带Wharton胶复合多孔支架浸提液对软骨细胞无毒性;(4)结果表明,关节软骨细胞外基质/人脐带Wharton胶复合多孔支架的理化性能及生化成分与天然软骨相似,具有良好的细胞相容性。

人脐带Wharton胶来源间充质干细胞复合藻酸钠水凝胶构建组织工程软骨修复兔膝关节软骨缺损

目的探索以人脐带Wharton胶来源间充质干细胞(MSCs)作为种子细胞复合藻酸钠水凝胶(Alg)构建组织工程软骨,并观察以此修复兔全层关节软骨缺损的效果。方法体外分离培养人脐带Wharton胶来源MSCs,与藻酸钠水凝胶复合构建组织工程复合物,用于修复兔膝关节全层骨软骨缺损。根据关节软骨缺损修复方式的不同,实验分为三组:Alg+MSCs组以人脐带Wharton胶来源MSCs/藻酸钠水凝胶组织工程复合物修复骨软骨缺损; Alg组以单纯藻酸钠水凝胶修复骨软骨缺损;单纯缺损组旷置骨软骨缺损作为对照。术后3个月、6个月处死实验动物取材。根据Micro-CT、蕃红O染色、天狼猩红染色、ICRS大体观分、组织学评分及力学分析等结果评估兔膝关节骨软骨缺损修复效果。结果 Micro-CT扫描结果显示三组软骨下骨均得到不同程度重建,Alg+MSCs组效果显著优于其他两组;蕃红O染色、天狼猩红染色等病理学染色显示Alg+MSCs组获得透明软骨修复,其他两组修复组织主要为纤维软骨;力学分析结果显示Alg+MSCs组新生软骨力学强度接近正常关节软骨,明显优于其他两组,差异统计学意义(P<0. 05)。结论以人脐带Wharton胶来源MSCs作为种子细胞复合藻酸钠水凝胶构建组织工程软骨可成功修复兔膝关节骨软骨缺损。

负载小鼠脐带间充质干细胞壳聚糖双胍盐酸盐水凝胶的制备与表征

背景:随着水凝胶材料研究的深入,水凝胶的适用领域也逐渐拓宽,搭载干细胞进行疾病治疗成为研究的一个新方向,但如何构建适宜干细胞生长的水凝胶材料,是目前需要解决的关键问题。目的:探究壳聚糖-壳聚糖双胍盐酸盐-胶原蛋白复合水凝胶的理化性能并评价其负载小鼠脐带间充质干细胞的能力。方法:以壳聚糖、壳聚糖双胍盐酸盐和胶原蛋白为原料,加入交联剂β-甘油磷酸钠和碳酸氢钠物理交联制备水凝胶,根据成胶时间和成胶效果筛选出合适的水凝胶(以此记为Gel-1、Gel-2、Gel-3)。表征3组水凝胶电子显微镜下的形态、孔隙率、溶胀性能、降解性,并进行溶血实验考查3组水凝胶的溶血情况。将小鼠脐带间充质干细胞与表征综合性能最好的水凝胶共培养,测定复合水凝胶的细胞毒性、细胞存活情况、细胞黏附效应,从而评价该水凝胶负载脐带间充质干细胞的性能。结果与结论:①扫描电镜表征结果显示,3组水凝胶内部均呈多孔网状结构,添加了壳聚糖双胍盐酸盐的Gel-2、Gel-3内部结构更加多孔且立体;②Gel-3组水凝胶孔隙率高于其余两组,孔隙率高且孔径分布均匀;③3组水凝胶溶胀性能都在100%以上,且具有壳聚糖双胍盐酸盐组分的水凝胶溶胀性能更好;④3组水凝胶的降解率在15 d的时间尺度内可以降解90%以上,降解性能良好;⑤溶血性能测定结果表明各组水凝胶搭载鸡红细胞所测得的吸光度值与生理盐水搭载鸡红细胞所测得的吸光度值基本相同,无溶血现象出现;⑥毒性实验和活死细胞染色实验显示各组水凝胶中细胞存活率都在100%以上,表明无明显细胞毒性,脐带间充质干细胞可在水凝胶包裹下生存且水凝胶对细胞存活率有正向的影响;⑦脐带间充质干细胞可以黏附在水凝胶表面且形态正常。

软骨细胞复合人脐带Wharton胶取向支架的体外评估

目的将软骨细胞复合于人脐带Wharton胶取向支架,体外评估该支架对软骨细胞的影响和作用。方法取成年新西兰大白兔肩关节软骨组织分离培养软骨细胞。取正常新生儿脐带组织,通过湿润粉碎结合化学脱细胞技术脱细胞,利用冷冻干燥及交联等技术制备人脐带Wharton胶取向支架。取第2代软骨细胞与人脐带Wharton胶取向支架复合培养,倒置显微镜、扫描电镜观察细胞在支架上分布及黏附情况;甲苯胺蓝、番红O染色观察细胞细胞外基质分泌情况;二乙酰荧光素-碘化丙啶双色荧光检测法染色及Hoechst33258染色评估细胞在支架上的活力及增殖情况;将体外PKH26荧光标记的软骨细胞与支架复合培养,荧光显微镜观察。结果倒置显微镜观察示,培养3 d细胞在支架孔隙内分布较均匀,呈圆形或椭圆形;扫描电镜观察示,培养7 d大量细胞黏附于支架孔隙间,呈圆形或椭圆形,且细胞沿取向孔道伸展排列,相互聚集,增殖旺盛;组织学观察示,培养7 d,细胞在支架中分布均匀且增殖旺盛,细胞分泌大量细胞外基质,取向支架能引导细胞迁徙和增殖,并能有效保留和促进细胞外基质分泌;细胞活力评估结果示,培养3 d见支架上黏附的大部分细胞为活细胞,细胞成活率高达90%以上。荧光显微镜观察示,荧光标记细胞与支架复合培养1 d,细胞在支架内部均匀分布,增殖旺盛。结论人脐带Wharton胶取向支架具有良好的亲和性和细胞相容性,有利于软骨细胞黏附和增殖,细胞存活率高,是一种比较理想的软骨组织工程支架材料。

人脐带Wharton胶细胞外基质对软骨种子细胞的作用

目的观察人脐带Wharton胶细胞外基质(hWJECM)对兔软骨细胞增殖的影响。方法用差速离心法制作hWJECM,制成0.5%浓度浆料分别铺于六孔细胞培养板和96孔细胞培养板上,形成1 mm厚的薄膜,包被有此膜的培养板作为试验组,未铺膜单纯培养液组作为空白对照组,在培养板上培养兔关节软骨细胞。通过倒置显微镜观察,甲苯胺蓝染色观察两个组的兔软骨细胞5,10,15天的生长形态和增殖情况,用CCK8细胞增殖实验比较两组的1、3、5、7 d的增殖情况,来评估软骨种子细胞的增殖和表型维持情况。结果倒置显微镜观察5、10、15 d的细胞增殖情况好于单纯培养液组,5、15 d的甲苯胺蓝染色的结果也证明这个观点,CCK8细胞增殖试验1,3天时试验组和对照组的增殖没有明显的统计学差异(P=0.7142;P=0.0657),第5,7天显示hWJECM组在细胞增殖方面明显地优于单纯培养液的对照组(P=0.0001;P=0.0006)。结论 hWJECM免疫原性低,无细胞毒性作用,能够很好地促进软骨细胞的增殖。

负载人脐带间充质干细胞的水凝胶对糖尿病小鼠皮肤创面愈合的疗效

背景:目前,缺乏有效的治疗方法促进糖尿病患者的皮肤创面愈合。人脐带间充质干细胞已被证明对皮肤再生具有多种治疗作用,可注射水凝胶具有良好的生物相容性和可调节性,可以提高干细胞治疗的效果。目的:以负载人脐带间充质干细胞的水凝胶为切入点,观察其对小鼠糖尿病皮肤创面的疗效,并探索可能的作用机制。方法:①链脲佐菌素溶液连续腹腔注射5 d构建C57BL/6J小鼠糖尿病模型,经尾静脉采血测血糖值评估模型是否建立成功。②造模成功后,利用打孔器建立小鼠背部皮肤损伤模型,水凝胶组给予纯水凝胶敷胶治疗,复合水凝胶组给予负载有人脐带间充质干细胞的水凝胶治疗,对照组给予等量生理盐水治疗,治疗第7,14天观察创面愈合情况。结果与结论:①敷胶后的14 d内,水凝胶组、复合水凝胶组小鼠皮肤创面面积明显低于对照组(P<0.05),复合水凝胶组的皮肤创面面积明显低于水凝胶组(P<0.05);②苏木精-伊红染色结果显示:复合水凝胶组创面肉芽组织新生率明显高于水凝胶组和对照组(P<0.05);③Masson染色结果显示:与对照组和水凝胶组相比,复合水凝胶组创面组织胶原沉积率明显增加(P<0.05);④免疫组化CD31染色结果显示:复合水凝胶组创面组织中新生微血管数量明显高于水凝胶组和对照组(P<0.05);⑤免疫组化CD45染色结果显示:与对照组和水凝胶组相比,复合水凝胶组创面组织中炎症面积明显减少(P<0.05);⑥免疫荧光染色和qRT-PCR结果显示:与对照组和水凝胶组相比,复合水凝胶组创面组织中M2巨噬细胞及其标志性因子白细胞介素10表达显著升高,且M1巨噬细胞及其标志性因子白细胞介素6表达明显降低(P<0.05);⑦上述结果提示:负载人脐带间充质干细胞的氯化壳聚糖-β-甘油磷酸钠复合水凝胶通过促进糖尿病创面肉芽组织和微血管形成,减轻炎症反应,从而促进创面愈合。

脐带间充质干细胞生长因子凝胶对雄激素性脱发模型小鼠毛发生长的影响

目的探讨脐带间充质干细胞生长因子凝胶对AGA模型小鼠毛发生长是否有促进作用。方法把20只C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组和凝胶组,在背部做脱毛处理,比较各组小鼠新生毛发长度、毛发直径和毛囊数的差异;苏木精-伊红染色观察毛囊细胞数量和形态改变,比较皮肤组织雄激素受体mRNA、蛋白表达量。结果相较于空白组,模型组小鼠毛发长度变短,毛发直径减小,病理学观察可见毛囊总数明显减少且毛囊微型化;阳性对照组和凝胶组小鼠新生毛发长度、毛发直径和毛囊数均高于模型组;模型组雄激素受体mRNA、蛋白表达量明显高于空白组,凝胶组蛋白表达量低于模型组。结论脐带间充质干细胞生长因子凝胶对雄激素性脱发模型小鼠毛发生长有促进作用。

胶原/丝素蛋白支架联合人脐带源间充质干细胞干预犬创伤性脑损伤

背景:迄今为止,创伤性脑损伤颠覆性的治疗手段非常有限,医学与工程的结合为中枢神经系统神经修复与再生带来了新的前景。目的:探讨可携带种子细胞、兼具安全性与多孔隙的胶原/丝素蛋白支架联合人脐带间充质干细胞对犬创伤性脑损伤的治疗作用。方法:(1)将第3代人脐带间充质干细胞接种至胶原/丝素蛋白支架上,倒置相差显微镜、扫描电镜、免疫荧光染色、苏木精-伊红染色观察人脐带间充质干细胞生长情况。(2)将24只比格犬利用随机数字法分为4组:创伤组只建立创伤性脑损伤模型不做其他处理,干细胞组造模后移植人脐带间充质干细胞,支架组造模后移植胶原/丝素蛋白支架,联合组造模后移植人脐带间充质干细胞与胶原/丝素蛋白支架,移植物均在损伤灶局部移植。术后1 d以及1,4,8,12,16,20,24周分别进行改良格拉斯哥昏迷评分评估,术后1,3,6个月进行运动诱发电位检测,术后6个月行核磁共振成像弥散张量成像和脑组织修复RNA原位杂交,评估创伤性脑损伤恢复情况。结果与结论:(1)人脐带间充质干细胞贴附胶原/丝素蛋白支架表面生长良好并伸出许多伪足;(2)术后1,4,8,12,16,20,24周,联合组改良格拉斯哥评分显著高于创伤组、干细胞组、支架组(P<0.05);(3)不同恒压刺激下,1,3,6个月时联合组运动诱发电位潜伏期、振幅均极其显著优于创伤组(P<0.01);(4)核磁共振成像弥散张量成像显示:联合组皮质脊髓束完整性好于创伤组、干细胞组和支架组,损伤侧可见皮质新生;(5)脑组织修复RNA原位杂交结果:联合组Syn、MAP-2、vWF、NEFM、MBP表达量多于创伤组、干细胞组和支架组;(6)结果表明:人脐带间充质干细胞联合胶原/丝素蛋白支架对犬创伤性脑损伤后皮质脊髓束新生、运动功能恢复、血管新生与突起生长发挥了积极作用。

具有抗氧化能力的人脐带间充质干细胞制备及评价策略研究

目的:从人脐带中分离制备一种具有抗氧化能力的间充质干细胞(antioxidant mesenchymal stem cell,AO-MSC)并评价其细胞生物学特性。方法:采用无血清培养体系,结合胶原酶消化培养法以及胶原酶消化组织块培养法,从人脐带华通氏胶组织分离培养MSC。使用0.2%Ⅱ型胶原酶消化,未完全消化的组织块贴壁培养收获AO-MSC。以常规消化培养法为对照。成纤维细胞集落形成实验检测MSC集落形成能力;CCK-8检测MSC增殖能力;流式细胞术及免疫荧光染色检测MSC表面标志物;体外诱导分化评价MSC成脂成骨能力,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测成骨和成脂关键转录因子的表达差异;RT-qPCR检测MSC抗氧化还原物质SOD-1、GSH、GAT、NQO1的表达情况。结果:本策略分离的AO-MSC在18 d汇合率为80%-90%,细胞呈漩涡状生长。流式细胞术及免疫荧光染色检测结果显示,AO-MSC高表达CD73、CD29、CD105、CD90,低表达CD31、CD45、HLA-DR;胶原酶消化组织块培养法收获的AO-MSC自我更新及分化能力强于对照组MSC;对照组MSC体外成脂成骨能力强于胶原酶消化组织块培养法所得AO-MSC;RT-qPCR检测结果显示,胶原酶消化组织块培养法收获的AO-MSC其表达的抗氧化还原物质水平高于对照组。结论:成功制备了基于无血清体系的具备抗氧化能力的人脐带MSC。

人脐带间充质干细胞对大鼠肺成纤维细胞分泌Smad2蛋白、结缔组织生长因子的影响

目的探究人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对转化生长因子-β(TGF-β)诱导的大鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的过程及结局的影响。方法从10只健康雌性无特定病原体级(SPF级)大鼠中提取肺成纤维细胞,用5 ng/mL TGF-β处理大鼠原代肺成纤维细胞的同时,给予不同浓度的hUC-MSCs对其共培养,其中A组(模型组,加入40μL TGF-β)、B组(5×10^(5)hUC-MSCs治疗组,加入40μL TGF-β和1 mL 5×10^(5)个hUC-MSCs)、C组(2×10^(6)hUC-MSCs治疗组,加入40μL TGF-β和1 mL 2×10^(6)个hUC-MSCs)、D组[正常组,加入磷酸盐缓冲液(PBS)40μL],采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞内胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)、α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)蛋白表达量;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测各组细胞内结缔组织生长因子(CTGF),Smad2 mRNA的相对表达量。用5 ng/mL TGF-β处理大鼠原代肺成纤维细胞48 h后,将其诱导转化为肌成纤维细胞,再和不同浓度的hUC-MSCs共培养24 h,其中A组(模型组,加入40μL TGF-β)、B组(5×10^(5)hUC-MSCs治疗组,加入1 mL 5×10^(5)个hUC-MSCs)、C组(2×10^(6)hUC-MSCs治疗组,加入1 mL 2×10^(6)个hUC-MSCs)、D组(正常组,不用40μL TGF-β诱导,加入PBS 40μL),采用蛋白免疫印迹法检测各组肌成纤维细胞内CollagenⅠ、a-SMA蛋白表达量;采用RT-PCR检测各组肌成纤维细胞CTGF、Smad2 mRNA的相对表达量。结果在TGF-β诱导的大鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程中,A、B、C、D组大鼠CollagenⅠ和a-SMA的蛋白表达量均呈现降低趋势(均P<0.05);A、B、C、D组大鼠CTGF和Smad2 mRNA的相对表达量均呈现逐渐降低趋势(均P<0.05);大鼠原代肺成纤维细胞诱导转化为肌成纤维细胞后与不同浓度的hUC-MSCs共培养中,A、B、C、D组小鼠CollagenⅠ蛋白相对表达量和a-SMA蛋白相对表达量均呈现降低趋势(均P<0.05),但A组和B组小鼠CollagenⅠ蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05);A、B、C、D组大鼠CTGF和Smad2 mRNA的相对表达量均呈现逐渐降低趋势(均P<0.05),但B组和C组大鼠Smad2 mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(均P<0.05)。结论hUC-MSCs可减少TGF-β诱导大鼠肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞过程中表达Collagen、a-SMA蛋白及CTGF、Smad2 mRNA,降低肌成纤维细胞表达CollagenⅠ、a-SMA蛋白及CTGF、Smad2 mRNA,且高浓度的hUC-MSCs效果最显著。

脐带华通胶间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养方法,并通过成脂成骨诱导及表面标记物的检测进行鉴定。方法剔除脐带动脉、静脉和外膜,取遗留的华通胶组织,将其剪成细小的碎块,用浓度为0.2%的Ⅱ型胶原酶消化,提取脐带华通胶间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44、CD90、CD105、CD73、HLA-ABC、CD34、CD45及HLA-DR,成骨细胞、成脂细胞分化诱导。结果脐带华通胶经胶原酶消化后,可提取大量间充质干细胞,流式细胞仪检测脐带华通胶干细胞不表达造血干细胞的表面特征,而表达间充质干细胞的标志,例如CD44、CD90、CD105及CD73,并且干细胞HLA-ABC阳性表达,CD34、CD45及HLA-DR呈阴性。组织化学染色显示茜素红、碱性磷酸酶及油红染色强阳性。结论该方法可较好地分离脐带华通胶间充质干细胞,将为实验研究和临床应用提供一种新的干细胞来源。

脐带Wharton'sJelly中间充质干细胞的生物学特性

背景:脐带Wharton’sJelly中的间充质干细胞免疫原性低,增殖能力优于骨髓间充质干细胞,受到广泛关注。目的:分离、培养人脐带Wharton’sJelly中的间充质干细胞,并观测其生物学特性。方法:利用组织块培养法分离培养脐带Wharton’sJelly中的间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法测定细胞倍增时间,流式细胞仪检测细胞免疫表型。结果与结论:组织块培养第2天时,开始有细胞从组织块爬出;第7天细胞形态开始发生变化,部分细胞呈梭形。传至第3代的细胞形态均一,呈梭形或成纤维形。传至第7代、第10代的细胞形态无明显变化,仍呈梭形。MTT结果示细胞的倍增时间为三四天,传至10代后细胞倍增时间无明显差别。分离培养的脐带Wharton’sJelly中间充质干细胞表达CD44、CD29、CD105,不表达CD34、CD45、CD14。

人脐带华通胶间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的研究由脐带华通胶组织(Wharton’s jelly)在体外分离、培养、扩增获得脐带间充质干细胞(umbilical cord derived mesenchymal stem cells,以下简称UC-MSCs)的方法,并进行UC-MSCs的各项鉴定。方法脐带华通胶组织采用胶原酶以及胰酶序贯消化法分离得到UC-MSCs,用流式细胞仪分析其表型特征,向成骨、成脂以及成神经元细胞诱导分化并鉴定。结果由人脐带华通胶可以有效获得间充质干细胞。原代细胞培养24～48h内细胞开始贴壁生长,5～7d左右可以传代培养,在2～3周时间内可以迅速扩增至107到108数量级。各项分化鉴定试验证实UC-MSCs具有多向分化潜能,能分化成骨、成脂细胞以及神经元细胞。UC-MSCs在体外培养传至20～30代仍保持稳定的细胞表面标记。结论由人脐带华通胶可以有效地获得间充质干细胞,这种UC-MSCs能在体外长期传代培养,生物学特性稳定,具有多向分化的潜能,是今后细胞治疗很有前景的种子细胞。

人脐带Wharton’s jelly源间充质干细胞培养中碱性成纤维细胞生长因子的作用

背景：培养脐带源间充质干细胞过程中,细胞形态常易变得宽大不规则,传代不易贴壁,死亡率高,找到一个维持细胞稳定的方法是有必要的。目的：拟采用组织块培养法从人脐带Wharton’s jelly中分离培养间充质干细胞,观察碱性成纤维细胞生长因子对其生物学特性的影响。方法：采用组织块法分离培养和扩增脐带组织间充质干细胞,对照组用DMEM/F12培养基＋体积分数为10%胎牛血清培养,实验组用DMEM/F12培养基＋体积分数为10%胎牛血清＋20μg/L碱性成纤维细胞生长因子培养。观察组织块游出细胞的时间和细胞形态,每隔3d或4d更换培养液,待细胞达到80%~90%融合时,用0.25%胰酶消化后,按1：2或1：3的比例传代。结果与结论：倒置显微镜下观察对照组中从8~10d开始有细胞从组织块四周游出贴壁,实验组中从6~8d开始有细胞从组织块四周游出贴壁,1周后可见多数呈长梭形或扁平形的成纤维样细胞,围绕组织块成旋涡状,前3代细胞形态及传代间隔时间两组基本相同;3代以后实验组细胞较对照组易于贴壁,传代死亡率低,生长曲线提示增殖能力强。流式细胞术分析两组细胞周期显示第3,6代70%以上的细胞处于G0/G1期,且第3,6代细胞均阳性表达CD29,CD44,弱表达HLA-ABC,不表达CD34、CD45和HLA-DR。结果提示采用组织块培养法可从人脐带Wharton’s jelly中分离出具有间充质干细胞特性的细胞,且碱性成纤维细胞生长因子能使细胞从组织块游出时间提前和有助于促使细胞贴壁,一定程度上维持细胞形态稳定性,提高增殖能力,并且不改变细胞的表面标志物表达。

脐带沃顿胶间充质干细胞的分离培养及其诱导分化

背景:骨髓是目前间充质干细胞的主要来源,但由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因,其应用具有一定局限性。近年来,脐带作为间充质干细胞的新来源已经得到广泛关注。目的:探讨从人脐带沃顿胶中分离、扩增间充质干细胞的方法,鉴定其免疫表型与分化潜能。方法:种植法分离和扩增间充质干细胞;用FasGrow培养基培养,光镜观察获得的人脐带沃顿胶间充质干细胞的形态;免疫组织化学方法检测其免疫表型;Gomori钙钴碱性磷酸酶染色、vonKossa钙结节染色、四环素荧光标记鉴定其向成骨方向分化的能力及油红O染色鉴定其向成脂肪分化的能力。结果与结论:种植法容易从人脐带沃顿胶中获得间充质干细胞;原代培养后12～16d达70%～80%融合,传代后可维持未分化状态并稳定增殖;细胞倍增时间为2d左右,体外增殖达20代以上;表面标记分析显示:CD44、CD105、CD133、MHC-Ⅰ呈阳性,CD34、CD45呈阴性;体外诱导实验表明:该细胞具有体外成脂肪、成骨和神经样细胞分化的能力。

不同消化方式对脐带华通胶间充质干细胞提取的影响

目的探讨使用不同酶浓度、消化不同时间及不同浓度胎牛血清的培养基稀释对消化脐带华通胶后提取培养间充质干细胞的影响。方法无菌条件下取出正常剖腹产胎儿脐带,剔除动脉、静脉及外膜,取其之间的胶状物,剪成1 mm3及更小的块状,分别加入0.1%和0.2%的Ⅱ型胶原酶,分为A、B两组,37℃水浴消化。每一组消化时间分别为4、81、2、16、202、4、28、323、6、40 h共10个消化时间点,每一个消化时间点又分为两组,分别为A1、A2组和B1、B2组。消化后的黏稠细胞悬液用完全DMEM稀释,并加入特级胎牛血清至浓度为10%(A1、B1)和20%(A2、B2),充分混匀。悬液移至75 cm2培养瓶,15 ml/瓶,37℃、5%CO2、饱和湿度培养,3 d换液。通过细胞计数观察原代细胞贴壁生长的最早时间和80%细胞铺满瓶底的时间和生长活力。结果 0.2%的Ⅱ型胶原酶消化脐带华通胶在消化时间为20h,且稀释血清浓度为20%时,获得的细胞悬液在培养36 h即有细胞贴壁,培养6 d细胞贴壁达到80%,其余各组细胞生长情况各不相等,均弱于此组。其中消化时间在8 h以内和32 h以上时不论使用多少的酶浓度和稀释时使用多少的血清浓度,细胞均不生长。结论在使用胶原酶消化脐带华通胶提取间充质干细胞的过程中,使用0.2%Ⅱ型胶原酶、消化16～24 h、稀释培养时加入至20%的血清对干细胞的提取效果最佳。

Ⅰ型胶原膜的类液晶结构对人脐带间充质干细胞黏附、增殖和分化性能的影响

模拟天然组织中Ⅰ型胶原的有序排列,利用高浓度胶原的液晶态获得表面具有类液晶有序结构的胶原膜,并通过体外培养考察其对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)生物性能的影响.结果表明,当Ⅰ型胶原膜浓度为120 mg/mL时,膜表面的胶原纤维呈定向有序排列,这种有序结构不仅有利于hUCMSCs的黏附和增殖,而且能促进ALP,CollagenⅠ,RUNX2,Ostreix,OCN和OPN等成骨相关基因的表达,表明hUCMSCs在此表面有更强的成骨分化潜能.

Sox9基因转染的人脐带血干细胞复合骨基质明胶/生物蛋白胶构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨Sox9基因转染的人脐带血干细胞(hUCMSC)复合骨基质明胶/生物蛋白胶体内外构建组织工程软骨的效果。方法体外分离培养hUCMSC;采用脂质体转染Sox9载体质粒,将转染的细胞在骨基质明胶/生物蛋白胶材料上体外培养8周,行扫描电子显微镜和组织学观察。选择雄性SD大鼠55只,体质量(150±20)g。将体外形成的软骨样组织移植入SD大鼠背部皮下,8周时行组织学检查,观察软骨形成能力,并进行宿主免疫反应监测。结果体外培养8周后hUCMSC在支架材料上生长良好,分泌大量蛋白多糖和Ⅱ型胶原。移植入大鼠体内8周后,形成软骨样组织,形态学和免疫组织化学染色显示蛋白多糖和Ⅱ型胶原阳性。移植后IgG、IgA、IgM、C3和C4水平与对照组差异无统计学意义[IgG(1.105 6±0.019 2)μg/mL vs(1.145 0±0.023 1)μg/mL(术后28 d),IgM(0.219 1±0.034 3)μg/mL vs(0.348 7±0.030 3)μg/mL(术后28 d),IgA(0.350 7±0.058 5)μg/mL vs(0.367 7±0.042 4)μg/mL(术后28 d),C3(122.65±4.40)μg/mL vs(130.63±2.98)μg/mL(术后28 d),C4(49.89±2.11)μg/mL vs(51.45±3.74)μg/mL(术后28 d)]。Sox9基因转染的hUCMSC复合骨基质明胶/生物蛋白胶构建的组织工程软骨移植入体内后未引起明显的宿主免疫反应。结论Sox9基因转染的hUCMSC可作为组织工程软骨的一种良好的种子细胞来源。