人脐血基质细胞自发分泌多种造血生长因子的实验研究

目的 探讨体外培养的人脐血基质细胞分泌血小板生成素(thrombopoietin ,TPO)、粒 巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophagecolonystimulatingfactor,GM CSF)、干细胞生长因子(stemcellfactor ,SCF)的能力。方法 留取不同培养时相点的培养液上清,ELISA法检测上清中TPO、GM CSF、SCF的浓度,并与骨髓基质细胞的培养上清液对照比较其特点。结果 人脐血基质细胞和骨髓基质细胞均可分泌TPO、GM CSF和SCF等造血生长因子,二者造血生长因子的分泌随着培养时间的延长而逐渐下降,其中人脐血基质细胞分泌TPO和SCF的高峰期出现在第7天,而GM CSF的分泌则无高峰期的出现;通过与骨髓基质细胞分泌三种造血生长因子量进行对比发现,人脐血基质细胞SCF和GM CSF的分泌量低于骨髓基质细胞,而TPO的分泌高于同期培养的骨髓基质细胞。结论 人脐血基质细胞与骨髓基质细胞一样具有分泌造血生长因子,支持调控造血的作用。

人脐血基质细胞深低温保存的实验研究

目的 探讨一种简便可行的人脐血基质细胞冻存方法。方法 采用 5 %二甲基亚砜 (DMSO) ,3%羟乙基淀粉 (HES)和 4 %人血白蛋白 (HAS)作冷冻保护剂 - 80℃冻存人脐血基质细胞 ,观察不同时相点的基质细胞活性、细胞计数 ,回收率 ,基质细胞集落形成单位 (CFU F)及其支持集落生长的作用 (CFU S ,CFU GM ,CFU E)。结果 保存 6个月后人脐血基质细胞的细胞活性仍保持在 (90 .6± 2 .8) % ,CFU F产率也达到 (83.6± 1 .8) % ,其支持集落生长的作用与保存前无统计学差异。

骨髓基质细胞与人脐血基质细胞表达造血生长因子的实验研究

目的在分子生物学水平上探讨体外培养的骨髓基质细胞与人脐血基质细胞表达TPO、GM-CSF、SCF的mRNA的能力的差异。方法收集培养28d的骨髓基质细胞与人脐血基质细胞,采用RT-PCR方法在mRNA水平上分析其造血生长因子GM-CSF、SCF、TPO的表达,比较二者表达TPO、GM-CSF、SCF等造血生长因子的mRNA能力的差异。结果体外培养的人脐血基质细胞与骨髓基质细胞均能表达:(1)TPO的mRNA,人脐血基质细胞表达能力强于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为1.57;(2)SCF的mRNA,人脐血基质细胞表达能力弱于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为0.83;(3)GM-CSF的mRNA,人脐血基质细胞表达能力弱于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为0.68。结论人脐血基质细胞和骨髓基质细胞均可以表达造血生长因子TPO、GM-CSF、SCF的mRNA,具有支持调控造血的物质基础。

TNF-α对人脐血基质细胞体外扩增作用的观察

目的 观察造血抑制因子TNF α对人脐血基质细胞体外扩增的效果。方法 采用Dexter培养法 ,加入含TNF α的不同细胞因子组合 ,计数培养 2 1d时的基质细胞集落数 ,测定培养 7,1 4 ,2 1 ,2 8d的细胞周期。结果 对人脐血基质细胞的扩增效果 ,TNF α单用与对照组比较 ,P <0 .0 1 ,TNF α+SCF +BFGF与其他实验组比较 ,P <0 .0 1 ;人脐血基质细胞扩增培养不同时相点的G2 +M +S期细胞分别占 :2 5 .6 % ,2 9.8% ,36 % ,2 2 .1 %。结论 TNF α单独或联合使用对人脐血基质细胞有较明显的扩增作用 。

人脐血基质细胞分离培养的实验研究

目的 探讨人脐血CD34+ 细胞群中分离培养造血基质细胞的可行性。方法 分离人脐血CD34+ 细胞 ,采用Dexter法培养 ,对贴壁细胞进行观察和鉴定。结果 Dexter培养 9～ 1 4d(平均 1 1 .2d)开始形成基质细胞集落 ,1 5～ 2 2d(平均 1 9.6d)集落数量最多 ,培养 2 8d贴壁细胞铺满培养皿底。细胞类型以成纤维样细胞、巨噬样细胞、“小圆”类细胞为主 ;细胞化学染色 :非特异性酯酶染色 (NSE)、糖原染色 (PAS) :1 0 0 %阳性 ,过氧化物酶染色 (POX) :阴性 ,碱性磷酸酶 (ALP) :2 8%阳性 ;免疫组化染色 :CD1 0 6 :阳性 96 % ,CD2 9:93%阳性 ,CD4 4 :98%阳性 ,CD4 5 :阴性 ,CD5 0 :6 2 %阳性 ,纤维粘连蛋白 (Fn) :92 %阳性 ,层粘连蛋白(Lm) :74 %阳性 ,胶原Ⅳ :83%阳性。

ConA诱导的人脐血基质细胞上清对脐血细胞DNA合成代谢的影响

目的探讨脐血综合利用途径.方法收集脐血基质细胞培养1～5周的上清,观测其对脐血细胞DNA合成代谢的影响.结果ConA诱导的人脐血基质细胞上清对脐血细胞DNA合成随培养时间变化而表现出抑制和刺激作用.结论该上清中至少含有两种以上生长因子.

血管细胞粘附分子-1修饰的人脐血基质细胞对造血干细胞或祖细胞扩增作用的实验研究

目的探讨血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)修饰的人脐血基质细胞(hUCBSC)对造血干细胞或祖细胞的扩增作用。方法构建 VCAM-1-pcDNA3.1(+)真核表达载体,转染原代培养的人脐血基质细胞,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫细胞化学技术检测转染前后 hUCBSC及 VCAM-1的表达情况;以

血管细胞粘附分子-1真核表达载体的构建及其在人脐血基质细胞中的表达

目的研究血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)修饰的人脐血基质细胞(hUCBSC)在重建造血微环境方面的作用。方法采用半巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人脐静脉内皮细胞系 HUV-EC-C 中分3段扩增得到血管细胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)cDNA 片段,采用重叠延伸剪切技术(SOE)

人脐血源基质细胞移植促进裸鼠造血损伤修复的实验研究

目的观察人脐血源基质细胞(hUCBSCs)移植对裸鼠造血损伤的修复效果。方法6.5Gy辐照裸鼠后,分别从尾静脉输入1×105个人脐血源基质细胞及生理盐水,分别于移植+1、+3、+5、+7、+10、+14、+21d观察裸鼠血象、骨髓象以及不同时相点CFU-F、CFU-GM、BFU-E、CFU-Meg动态变化。结果HUCBSCs移植组裸鼠在血象、骨髓象恢复时间、不同时相点骨髓CFU-F、CFU-GM、BFU-E、CFU-Meg等方面与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论HUCBSCs移植具有促进裸鼠造血损伤修复的作用。

人脐血源基质细胞对小鼠淋巴细胞增殖作用的研究

目的探讨人脐血源基质细胞对小鼠淋巴细胞的增殖作用。方法将培养的人脐血源基质细胞(hUCBDSCs)与分离的小鼠脾脏淋巴细胞进行混合培养,采用CCK-8检测淋巴细胞增殖,流式细胞仪检查细胞周期。结果hUCBDSCs组OD值明显高于对照组(P<0.05),rhIL-2+hUCBDSCs组OD值更高(P<0.05),而细胞因子作用(hUCBDSCs培养上清液)组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。实验(混合培养)组淋巴细胞S+G2/M期明显高于对照(单纯培养)组(P<0.05)。结论hUCBDSCs具有促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖作用。

人脐血源基质细胞分离培养条件的优化

目的探索人脐血源基质细胞（hUCBOSCs）的分离扩增条件,并观察其生物学特性。方法取产科胎儿脐带血,比较不同的分离方法、首次换液时间及培养体系对人脐血源基质细胞原代培养的影响。倒置显微镜动态观察细胞生长情况,瑞氏染色观察细胞形态特征,并采用细胞化学和免疫细胞化学方法对获得的细胞进行鉴定。结果明胶沉淀法优于其他分离方法,首次换液时间为第4天、改良Dexter培养体系培养效果最好。原代培养9-14d（平均12.1d）时贴壁细胞开始形成集落,15-21d（平均19.4d）时集落数量最多,培养28d贴壁细胞铺满培养皿底,细胞类型以“成纤维样”细胞、“巨噬样”细胞、“小圆”类细胞为主。细胞化学染色显示非特异性酯酶（NSE）染色阳性率100%,糖原染色（PAS）阳性率为100%,碱性磷酸酶（ALP）染色阳性率26%,过氧化物酶（POX）染色阴性;免疫细胞化学染色显示CD31阳性率96%,CD68阳性率95%,Fn阳性率94%,CD45阴性。结论在体外可以成功培养人脐血源基质细胞,为进一步的基础及临床研究提供了基础。

人脐血源基质细胞与骨髓基质细胞对造血功能损伤修复作用的比较研究

目的比较人脐血源基质细胞(hUCBDSCs)与骨髓基质细胞(hBMSCs)对造血功能损伤的修复作用。方法取63只BALB/c小鼠均给予6.0 Gy60Co射线全身照射,随机分为hUCBDSCs组(n=21)、hBMSCs组(n=21)和对照组(生理盐水组)(n=21),分别于移植后1、3、5、7、10、14、21 d检测1次外周血细胞,于照射后7和21 d分别制备股骨骨髓涂片观察骨髓细胞形态学改变,收集小鼠骨髓细胞并作集落培养。结果 3组小鼠移植后白细胞、血小板、红细胞在3～5 d降至最低,hUCBDSCs组白细胞和血小板均从7 d开始回升,10 d后回升速度与程度提高,21 d时回升接近未照射水平,hBMSCs组从7 d开始回升,回升趋势与hUCBDSCs组相似,21 d后回升程度低于未照射水平,对照组从7 d后开始回升,回升较慢,21 d回升程度低于实验组(P<0.05);hUCBDSCs组,hBMSCs组及对照组红细胞均在3 d时降至最低,21 d后恢复,但实验组较对照组回升更快,(P<0.05),hUCBDSCs组与hBM-SCs无甚差异(P>0.05)。集落培养CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GMEM,hUCBDSCs组21 d为(113±6)、(167±6)、(131±6)、(14±4)个,hBMSCs组(46±6)、(141±11)、(118±18)、(10±1)个,对照组为(87±3)、(122±4)、(84±7)、(5±1)个(P<0.05)。hUCBDSCs组所有小鼠均存活。结论 hUCBDSCs较hBMSCs修复造血功能损伤和血小板恢复的作用更佳,hUCBDSCs移植是1种安全有效的促进造血损伤修复的方法。

不同培养体系培养人脐血源基质细胞的探索性研究

目的:探索不同培养体系对人脐血源基质细胞原代培养的影响,并观察人脐血源基质细胞的生物学特性。方法:取产科胎儿脐带血,采用经典和改良Dexter培养体系培养人脐血源基质细胞。倒置显微镜动态观察细胞生长情况,瑞氏染色观察细胞形态特征,采用细胞化学和免疫细胞化学进行鉴定。结果:改良Dexter培养体系在48h细胞贴壁数、细胞开始伸展时间及原代培养时间明显优于经典Dexter培养体系。原代培养9～14d(平均12.1d)时贴壁细胞集落开始形成,15～21d(平均19.4d)时集落数量最多,培养28d贴壁细胞铺满培养皿底,细胞类型以成纤维样细胞、巨噬样细胞、"小圆"类细胞为主。细胞化学染色显示为,非特异性酯酶染色法显示阳性,阳性率100%;过氧化物酶染色法显示阴性;糖原染色显示阳性,阳性率为100%;碱性磷酸酶染色显示部分阳性,阳性率26%。免疫细胞化学染色显示为,CD31显示阳性率为96%,CD68显示阳性率为95%,CD45阴性,纤维粘蛋白显示阳性率94%。结论:改良Dexter培养体系是一种理想的人脐血源基质细胞培养体系,人脐血源基质细胞在体外的成功培养为从一新的角度进一步研究其在临床的早日应用提供理论基础。

CM-DiI示踪人脐血源基质细胞体内迁移定位的研究

目的:课题组前期实验发现人脐血源基质细胞(hUCBDSC)体外具有促进造血细胞集落扩增的能力,文中拟采用CM-DiI荧光标记技术,观察hUCBDSC移植后的归巢、定位和增殖情况。方法:传代培养hUCBDSC,CM-DiI荧光染料预染后经尾静脉输入BALB/c-nu/nu裸鼠体内,分别于移植后1、7、14、21 d取裸鼠骨髓、脾脏、肝脏、肺脏组织,激光共聚焦显微镜观察CM-DiI标记hUCBDSC体内分布情况。结果:传代培养hUCBDSC呈成纤维样,CM-DiI染色后胞膜呈红色。经尾静脉移植至裸鼠体内,移植后1 d,hUCBDSC广泛分布在骨髓、脾脏、肝脏、肺脏等组织中,移植7 d以后,hUCBDSC主要分布在骨髓,在骨髓中增殖、分化;脾脏、肝脏、肺脏等组织中的hUCBDSC明显减少。结论:人脐血源基质细胞经尾静脉输注可"归巢"至骨髓,并在骨髓中增殖、分化,重建受损造血微环境。

Cx43修饰人脐血源基质细胞输注阻抑白血病MRD小鼠造血干细胞移植后复发

目的观察间隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)修饰人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells,h UCBDSCs)体外对L615小鼠白血病细胞株凋亡以及在体对白血病微小残留病(minimal residual disease,MRD)小鼠疾病进展的影响。方法通过Cx43过表达腺病毒(Ad-Cx43-GFP)上调h UCBDSCs中Cx43表达,体外构建L615+Cx43+h UCBDSCs共培养模型,检测其对L615细胞凋亡的影响。建立L615细胞低瘤负荷的MRD小鼠模型,分为骨髓(bone marrow,BM)移植组和Cx43+h UCBDSCs+BM移植组进行移植,以正常L615小鼠作为对照,检测移植后外周血象、骨髓涂片、组织病理及骨髓Cx43表达变化等。结果 Ad-Cx43-GFP能够在mRNA和蛋白水平显著上调h UCBDSCs中Cx43表达。L615+Cx43+h UCBDSCs移植组L615细胞凋亡比例较对照组显著升高[(8.93±1.24)%vs(3.53±0.13)%,P<0.01]。对MRD小鼠移植后,Cx43+h UCBDSCs+BM移植组外周血WBC和PLT恢复更快,17 d时接近正常水平,而BM移植组外周血WBC和PLT恢复延迟,17 d时低于正常水平;17 d时,Cx43+h UCBDSCs+BM移植组骨髓涂片原始细胞比例较BM移植组显著降低[(7.67±1.25)%vs(56.33±1.25)%,P<0.01];与BM移植组比较,Cx43+h UCBDSCs+BM移植组肝、脾、骨髓的白血病浸润程度较低,同时骨髓中Cx43蛋白表达增加。结论上调h UCBDSCs中Cx43表达能在体外促进L615细胞凋亡,Cx43+h UCBDSCs+BM联合移植能够促进MRD小鼠外周血WBC和PLT恢复,阻抑MRD小鼠移植后复发。

不同来源基质细胞对骨髓瘤KM3细胞增殖和凋亡的影响

目的观察人脐血基质细胞及骨髓瘤患者骨髓基质细胞对骨髓瘤KM3细胞生物学特性的作用。方法体外分离培养骨髓瘤骨髓基质细胞和人脐血源基质细胞,与骨髓瘤KM3细胞共培养。采用扫描电镜观察共培养后基质细胞和KM3细胞的位相关系;应用CCK-8、PI染色流式细胞仪和AnnexinV/PI双标法检测不同培养条件下KM3细胞的增殖、细胞周期和凋亡率。结果人脐血基质细胞比骨髓瘤患者骨髓基质细胞有更强的抑制KM细胞增殖的作用;共培养后骨髓瘤患者骨髓基质细胞使KM3细胞阻滞于G0/G1期[(59.70±1.28)%],人脐血基质细胞使S期的KM3细胞比例增高[(46.07±2.46)%];KM3/MM-BMSCs组KM3细胞凋亡率为(3.26±0.12)%明显低于KM3/hUCBDSCs组KM3细胞凋亡率(4.76±0.12)%(P<0.01);KM3/MM-BMSCs组KM3细胞BaxmRNA的表达较KM3/hUCBDSCs组明显下降(P<0.01);KM3/hUCBDSCs组KM3细胞Bcl-2mRNA的表达较KM3细胞悬浮培养组下降(P<0.05),KM3/MM-BMSCs组KM3细胞Bcl-2mRNA的表达则明显升高,为悬浮培养组的1.982倍(P<0.01)。结论骨髓瘤基质细胞微环境抑制骨髓瘤细胞凋亡和死亡;而人脐血源基质细胞有更强的抑制骨髓瘤细胞增殖的作用,并促进其凋亡。

多发性骨髓瘤骨髓基质细胞IL-6和TNF-α的表达及其临床意义

目的研究骨髓瘤骨髓基质细胞(BMSCs)分泌的白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在多发性骨髓瘤(MM)进展中的变化和意义以及人脐血源基质细胞(hUCBDSCs)分泌IL-6和TNF-α的水平。方法用ELISA法检测单独培养的hUCBDSCs和骨髓瘤BMSCs以及它们与KM3细胞共培养后IL-6、TNF-α在培养上清液中的浓度。结果(1)单独培养和共培养时骨髓瘤BMSCs分泌IL-6和TNF-α的水平高于hUCBDSCs;(2)共培养后骨髓瘤BMSCs和hUCBDSCs分泌IL-6和TNF-α的水平明显高于共培养前;(3)Ⅲ期患者BMSCs分泌IL-6的水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者,但是TNF-α水平无变化。结论IL-6与MM的进展有关;hUCBDSCs表达IL-6和TNF-α的水平较骨髓瘤BMSCs低。

Ad-VCAM-1-GFP重组腺病毒转染人脐血源基质细胞的实验研究

目的探讨血管细胞粘附分子(VCAM-1)修饰的人脐血源基质细胞(HUCBSCs)在造血调控中的作用。方法采用 DNA 重组技术,将目的基因 VCAM-1克隆至含有报告基因 GFP 的穿梭质粒;在 BJ5183细胞中与 pAdeasy-1质粒进行同源重组。

VCAM-1基因的克隆及VCAM-1-pcDNA3.1(+)真核表达载体的构建

目的克隆人血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)cDNA全长,并构建VCAM-1-pcD-NA3.1(+)真核表达载体。方法采用半巢式RT-PCR从人脐静脉内皮细胞系HUV-EC-C中分三段扩增得到VCAM-1cDNA片段,采用重叠延伸剪切技术(SOE)并经SacⅠ酶切、T4连接酶连接获得VCAM-1完整片段,克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,得到VCAM-1-pcDNA3.1(+)真核表达载体。结果酶切及测序结果证明VCAM-1-pcDNA3.1(+)真核表达载体构建成功。结论成功扩增人VCAM-1基因,构建VCAM-1-pcDNA3.1(+)真核表达载体,为探索VCAM-1修饰人脐血基质细胞(human umbilical cord blood stromal cell,hUCBSC)重建造血微环境奠定了实验基础。