汉黄芩素对人胃癌细胞SGC-7901和人脐静脉内皮细胞ECV304增殖抑制及能量代谢的影响

目的探讨汉黄芩素(Wogonin)对人胃癌细胞SGC-7901和人脐静脉内皮细胞ECV304增殖抑制及能量代谢的影响及机制。方法采用MTT法和生长曲线法检测汉黄芩素对2种细胞的增殖抑制活性;HE染色法观察细胞形态变化;检测己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)的活力及三磷酸腺苷(ATP)含量;Western Blot法检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和单羧基转运体4(MCT4)蛋白表达水平。结果15μg·mL-1汉黄芩素对SGC-7901、ECV304的细胞增殖抑制率较好,且作用相近(P>0.05),故选择该浓度作为后续实验浓度。与对照组比较,汉黄芩素对2种细胞均有明显的持续增殖抑制作用,实验组细胞浓度在第6天下降最为明显(P<0.01);汉黄芩素干预后2种细胞均出现数量变少、胞质凝集等形态变化,SGC-7901细胞改变更为明显;SGC-7901汉黄芩素组的LDH、SDH活力及ATP含量显著降低(P<0.05,P<0.01),ECV304汉黄芩素组的HK活力及ATP含量显著下降(P<0.01);SGC-7901、ECV304细胞在汉黄芩素干预后HIF-1α及MCT4蛋白表达均明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论汉黄芩素可能通过下调SGC-7901、ECV304细胞的HIF-1α及MCT4表达,抑制2种细胞不同能量代谢酶活力,减少ATP生成,改善细胞酸性微环境,抑制胃癌细胞增殖和肿瘤血管生成,其对不同细胞能量代谢的影响具有差异性。

PTEN抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖和VEGF的表达

目的:探讨与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin hemology deleted on chromo-some ten gene,PTEN)对人脐静脉内皮细胞ECV304细胞增殖、凋亡,及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体1(VEGF receptor 1,VEGFR1)的影响。方法:将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的腺病毒Ad-PTEN-GFP及空载体腺病毒Ad-GFP感染ECV304细胞,MTT实验、Hoechst3342染色法及流式细胞术检测ECV304细胞的增殖和凋亡。实时荧光定量PCR法检测Ad-PTEN-GFP感染后ECV304细胞中PTEN、VEGF和VEG-FR1 mRNA表达水平,ELISA检测ECV304细胞培养上清中VEGF的水平。鸡胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)血管生长实验检测PTEN对鸡胚血管生长的影响。结果:与Ad-GFP相比,Ad-PTEN-GFP感染能明显抑制ECV304细胞的增殖,诱导细胞凋亡,5 d时增殖抑制率可达(50.38±5.42)%、细胞凋亡率达(73.3±5.3)%。当感染复数为100时,Ad-PTEN-GFP组ECV304细胞的VEGF及VEGFR1 mRNA表达水平分别为未感染组的(13.40±1.32)%及(46.12±5.20)%。同时,Ad-PTEN-GFP感染能够明显抑制CAM体内血管生长[血管指数(57.6±3.37)%vs(92.2±4.37)%,P<0.05]。结论:PTEN能显著抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖、促进其凋亡,其机制可能与抑制VEGF和VEGFR1表达,抑制血管新生有关。

川芎嗪对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响

川芎为活血化瘀代表性中药,临床应用甚广.川芎嗪(Tranethylpyrazine,TMP)为川芎主要有效成分之一.前期研究表明,川芎嗪注射液能抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠移植瘤的生长和肺转移,可降低肿瘤组织微血管密度和抑制肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达.本试验旨在进一步探讨川芎嗪含药血清对人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖和对VEGF诱导的ECV304的增殖是否具有抑制作用,为深入研究川芎嗪抗血管生成的机制,应用川芎嗪治疗血管新生性疾病(肿瘤、类风湿性关节炎、增殖性视网膜病变等)[1]提供实验依据.

丙氨酰谷氨酰胺二肽对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用

目的观察丙氨酰谷氨酰胺二肽(丙谷二肽)对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法在以低氧低糖培养人脐静脉内皮细胞ECV304为细胞损伤模型的基础上,以噻唑蓝(MTT)比色法优化丙谷二肽的最佳作用浓度,显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测线粒体膜电位。自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)活性,比色法检测谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的浓度,RT-PCR方法检测细胞内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、热休克蛋白70(HSP70)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA的表达。结果丙谷二肽能够使细胞在缺氧缺糖应激下存活率增加,线粒体损伤减轻,LDH分泌降低,GSH产生增加,HSP70和HIF-1αmRNA的表达增加。结论丙谷二肽对细胞缺氧缺糖损伤有明显的保护作用,这种保护作用可能与保护线粒体、维持细胞膜结构完整、上调细胞中应激基因HSP70和HIF-1α的表达有关。

同种异体NK细胞对人脐静脉内皮细胞ECV304的杀伤活性差异及分子机制探讨

目的探讨供者KIR分子表达差异对NK细胞杀伤人脐血内皮细胞系ECV304活性的影响,并观察参与杀伤的活化信号通路。方法RT-PCR及流式细胞仪检测ECV304细胞NKG2D配体MICA/B、ULBP1-3表达,PCR-SSP法行HLA-A、B、Cw分型。自8例健康供者分离外周血NK细胞,流式细胞仪检测KIR2DL1的表达率,LDH释放法测定NK细胞在效靶比20∶1时对ECV304细胞的杀伤活性及anti-KIR2DL1mAb对NK细胞杀伤活性的影响。结果ECV30细胞在mRNA水平表达MICA/B、ULBP1-3,但在膜蛋白水平均不表达。HLA分型表明,ECV304表达KIR2DL1的配体,而不表达KIR2DL2/3、KIR3DL1的配体。8例健康供者NK细胞KIR2DL1表达率有较大差异,对ECV304细胞的杀伤活性也有不同,双变量相关分析示个体KIR2DL1表达率与NK细胞对ECV304的杀伤率存在负相关(rS=-0.994,P=0.000)。anti-KIR2DL1mAb明显增强NK细胞对ECV304的杀伤活性(t=-4.860,P=0.002)。结论NK细胞对ECV304细胞的杀伤分子机制主要为HLA-KIR信号系统错配,目前已知的NKG2D配体MICA/B、ULBP1-3并不参与,这有助于临床活体器官移植时在遗传指导下选择供体。

簇分化抗原74基因转染对人脐静脉内皮细胞ECV304特性的影响

目的探讨簇分化抗原74(cluster of differentiation 74,CD74)基因在人脐静脉内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cell,HUVEC)的转染条件和CD74基因转染对细胞特性及功能的影响,为深入研究基于调节CD74表达的生物治疗打下基础。方法①将含有CD74 cDNA的pCMV-CD74增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescentprotein,EGFP)质粒通过转化大肠杆菌进行扩增、质粒提取、并经酶切和测序进行鉴定;②将pCMV-CD74质粒转染脐静脉内皮细胞ECV304,通过EGFP荧光质粒对ECV304细胞进行转染率的检测;③采用免疫组化法和Western blot,检测转染前后ECV304细胞CD74分子的表达;采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcriptase poly-merase chain reaction,RT-PCR)法检测转染后CD74 mRNA水平的表达;④pCMV-CD74质粒转染前后ECV304细胞功能相关基因人类白细胞抗原-A(human leukocyte antigens A,HLA-A)、人类白细胞抗原-DR(human leukocyte anti-gens DR,HLA-DR)、γ-干扰素受体(interferon-γreceptor,IFNGR)表达的检测:采用RT-PCR比较转染前后脐静脉内皮细胞各功能相关基因的表达;⑤应用RT-PCR分析软件分析实验数据。结果转染前后ECV304细胞HLA-A△Ct值分别为9.4881和12.1097,2-△△Ct为6.1543大于2,说明转染前后HLA-A表达有统计学差异;IFNGR△Ct值分别为4.9828和5.5228,2-△△Ct为1.4539小于2,转染前后无统计学差异;HLA-DR△Ct值分别为14.1098和14.7924,2-△△Ct为1.3036小于2,转染前后无统计学差异。结论人脐静脉内皮细胞ECV304表达HLA-A、HLA-DR、IFNGR和CD74mRNA;pCMV-CD74转染可增加ECV304细胞CD74基因和膜分子的表达,增加HLA-A基因的表达,但不增加HLA-DR和IFNGR的表达。

EDA-A1基因突变体对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖及细胞周期的影响

目的研究少汗型外胚层发育不良症EDA-A1基因突变体对人脐静脉内皮细胞(ECV)周期和增殖活性的影响。方法构建EDA-A1基因编码序列(CDS)突变体和野生型的真核表达载体pcDNA3.1(-)-EDA-A1-M/W,转染人脐静脉内皮细胞,逆转录PCR(RT-PCR)扩增EDA-A1基因,蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测EDA-A1蛋白表达,MTT法、流式细胞术检测EDA-A1基因突变体对ECV细胞增殖和细胞周期的影响。结果 RT-PCR、Western blot结果显示,野生型组和突变体组ECV细胞表达EDA-A1基因及其蛋白,而空质粒转染组[pcDNA3.1(-)]和空白对照组细胞无表达。与对照组(空质粒租)相比,突变体组ECV细胞增殖活性下降,生长抑制率为45.70%(P<0.01),野生型细胞增殖活性无明显改变(P>0.05)。突变体组中有更多细胞进入G0/G1期、S期;野生型组S期细胞增多,G2/M期细胞明显减少(P<0.05)。结论突变体和野生型EDA-A1基因对ECV细胞增殖和细胞周期有不同的生物学功能。

加减清营汤对H_2O_2损伤的人脐静脉内皮细胞ECV304 VEGF表达的影响

目的:观察加减清营汤对H2O2损伤的人脐静脉内皮细胞(ECV304)VEGF表达的影响。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(ECV304),随机分成正常组、模型组、血清对照组、阳性药物对照组、加减清营汤含药血清组。加减清营汤含药血清组用加减清营汤含药血清进行干预。用380μmol/L H2O2损伤细胞,培养24h后收集细胞总蛋白,用Western-blotting法检测VEGF表达水平。结果:氧化应激状态下ECV304 VEGF的表达有所增加,加减清营汤含药血清则能显著提高VEGF的表达以有效应对氧化损伤。结论:加减清营汤能促进H2O2氧化损伤的血管内皮细胞的代偿性修复。

彩色多普勒超声辐照对人脐静脉内皮细胞ECV304生物学特征的影响

目的探讨不同辐照时间的彩色多普勒超声(CDUS)对人脐静脉内皮细胞ECV304(ECV304)生物学特性的影响。方法收集对数生长期ECV304细胞,分别给予CDUS辐照1、5、10、20、30 min。未辐照细胞作为对照。MTT法观察细胞生长,流式细胞术测定细胞生长周期及凋亡率,Matrix试剂检测细胞管形形成能力,transwell法检测细胞迁移率。结果 CDUS辐照5、10 min时能促进ECV304细胞生长,辐照20、30 min时抑制ECV304细胞生长,抑制率明显高于辐照1 min时(P均<0.05)。CDUS辐照30 min时,ECV304细胞G2/M期比例和凋亡率(分别为22.14%和11.91%)均明显高于对照组(16.32%、0.11%),P均<0.05;细胞管状结构形成明显低于对照组,小管间距离减小;迁移率亦显著低于对照组(P均<0.05)。结论 CDUS辐照可能影响脐静脉内皮细胞ECV304周期分布、增殖、凋亡、迁移和管状结构的形成;对胎儿行彩色多普勒超声检查应严格控制在10 min内,最长不超过20 min。

雷帕霉素上调人脐静脉内皮细胞自噬活性抑制细胞增殖

目的探讨人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬激活对细胞增殖的影响。方法使用雷帕霉素(Rapa)处理HUVECs,Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin 1和unc-51样激酶1(ULK1)的表达,透射电镜(TEM)检测自噬小体,丹酰尸胺染色(MDC)检测自噬荧光;CCK-8法和EdU法检测自噬激活对细胞增殖的影响;血管形成实验检测成管能力。结果Rapa处理后,与对照组相比,LC3、Beclin 1和ULK1表达增强,实验组绿色自噬荧光表达强于对照组,TEM可见自噬小体;CCK-8和EdU结果显示,与对照组相比,实验组细胞自噬活化后细胞增殖能力减弱,成管能力降低。结论在一定时间内,Rapa上调HUVECs自噬活性抑制细胞增殖。

利伐沙班对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞功能的影响

目的探讨利伐沙班(RIV)对氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)功能损伤的影响。方法根据干预措施,将实验分为空白对照组(A组,常规培养液),Ox-LDL组(B组,100μg/mL Ox-LDL的培养液),Ox-LDL+RIV125组(C1组,100μg/mL Ox-LDL和125 ng/mL RIV的培养液),Ox-LDL+RIV250组(C2组,100μg/mL Ox-LDL和250 ng/mL RIV的培养液)和Ox-LDL+RIV500组(C3组,100μg/mL Ox-LDL和500 ng/mLRIV的培养液),各组细胞均处理48 h。采用CCK-8法检测各组细胞存活率的变化,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,采用免疫印迹(Western blot)法检测细胞核因子-κB(NF-κB)和尿激酶型纤溶酶原激活因子受体(uPAR)蛋白表达水平。结果与B组比较,C1组、C2组、C3组细胞存活率显著升高(P<0.05),细胞凋亡率和uPAR表达水平均显著降低(P<0.05);C3组IL-1β,TNF-α,IL-6水平和p-NF-κB p65表达水平显著降低(P<0.05)。结论RIV能显著恢复细胞活力、减少细胞凋亡和由Ox-LDL引起的炎性反应,可能通过NF-κB和uPAR的调节而发挥作用。

高糖诱导下人脐静脉内皮细胞形态、增殖活性及钙黏蛋白表达变化

目的探讨不同糖浓度状态下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)形态、增殖活性及VE-钙黏蛋白(VE-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达变化。方法将HUVECs分为正常对照组(葡萄糖浓度5.5 mmol/L)、甘露醇组(葡萄糖浓度5.5 mmol/L+甘露醇浓度24.5 mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度分别为11.1、22.2、33.3 mmol/L),分别培养24、48、72 h,以显微镜观察细胞形态,用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,Western blotting法检测各组HUVECs VE-cadherin、E-cadherin、N-cadherin表达。结果培养72 h,正常对照组细胞形态呈类圆形,高糖组、甘露醇组细胞形态由圆形、椭圆形逐渐到条索状,细胞数量减少、细胞间隙较前增加。培养24h,高糖组细胞增殖率高于正常对照组;随糖浓度升高,高糖组细胞增殖率呈现先升高后降低趋势。培养48、72h,高糖组细胞增殖率低于正常对照组;随着糖浓度升高,高糖组细胞增殖率逐渐降低。以上各组细胞增殖率比较均有统计学差异(P均<0.05)。培养24、72 h,与正常对照组比较,高糖组HUVECsN-cadherin、VE-cadherin、E-cadherin蛋白表达明显升高(P均<0.05);且随着葡萄糖浓度升高,高糖组细胞N-cadherin、VE-cadherin、E-caderin蛋白表达呈现先升高后降低的趋势。结论在高糖条件下,HUVECs发生形态转变,增殖率下降,且伴有细胞钙黏蛋白N-cadherin、VE-cadherin、E-cadherin表达变化。

环状RNA hsa-circ-0001360在同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用

背景:同型半胱氨酸水平上升会诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡,但机制尚不清楚。目的:探讨hsa-circ-0001360在同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡中的作用。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞,将其分为对照组、同型半胱氨酸组、干扰对照组、干扰对照+同型半胱氨酸组、干扰hsa-circ-0001360组、干扰hsa-circ-0001360+同型半胱氨酸组、过表达对照组、过表达对照+同型半胱氨酸组、过表达hsa-circ-0001360组和过表达hsa-circ-0001360+同型半胱氨酸组,同型半胱氨酸的干预浓度均为100μmol/L。干预细胞72 h后,应用Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达;流式细胞仪检测细胞的凋亡率;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测hsa-circ-0001360的表达水平。结果与结论:①与对照组相比,同型半胱氨酸组人脐静脉内皮细胞中Caspase-3和Bax的表达明显升高(P<0.01),Bcl-2的表达明显降低(P<0.01),细胞凋亡率明显增高(P<0.01);②与对照组相比,同型半胱氨酸组人脐静脉内皮细胞中hsa-circ-0001360的表达明显升高(P<0.01);③hsa-circ-0001360在人脐静脉内皮细胞的细胞质中表达显著高于细胞核(P<0.01);④与干扰对照组或干扰对照+同型半胱氨酸组相比,干扰hsa-circ-0001360组和干扰hsa-circ-0001360+同型半胱氨酸组人脐静脉内皮细胞中Caspase-3、Bax的表达明显降低(P<0.01),Bcl-2的表达明显升高(P<0.01),细胞凋亡率明显降低(P<0.01);⑤与过表达对照组或过表达对照+同型半胱氨酸组相比,过表达hsa-circ-0001360组和过表达hsa-circ-0001360+同型半胱氨酸组人脐静脉内皮细胞中Caspase-3、Bax的表达明显升高(P<0.01),Bcl-2的表达明显降低(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.01);⑥以上结果表明,hsa-circ-0001360可以促进同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡。

丹参酮ⅡA磺酸钠对尿毒症毒素作用下人脐静脉内皮细胞功能的影响

目的:探讨丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)对尿毒症毒素作用下人脐静脉内皮细胞(hUVECs)功能的影响,并阐明其作用机制。方法:将hUVECs进行传代培养并分为空白对照组、尿毒症毒素刺激组、尿毒症毒素+STS组和尿毒症毒素+STS+细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂组,其中后2组中STS的浓度为10 mg·L^(-1);先给予各组剪切力刺激,剪切力大小为12 dyn·cm^(-2);采用CCK-8法测定各组细胞增殖活性,Western blotting法检测各组细胞中ERK、核因子κB(NF-κB)和Ⅰ型胶原蛋白表达水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测细胞中ERK、NF-κB和Ⅰ型胶原mRNA表达情况;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)法检测各组细胞凋亡率。结果:CCK-8法检测,在剪切力作用后,尿毒症毒素刺激组和尿毒症毒素+STS+ERK抑制剂组细胞增殖活性低于尿毒症毒素+STS组(P<0.01)。Western blotting法检测,与尿毒症毒素组比较,尿毒症毒素+STS组细胞中ERK、NF-κB和Ⅰ型胶原蛋白表达水平升高(P<0.01);抑制ERK信号通路后,与空白对照组、尿毒症毒素组和尿毒症毒素+STS组比较,尿毒症毒素+STS+ERK抑制剂组细胞中ERK、NF-κB和Ⅰ型胶原蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。RT-qPCR法检测,与尿毒症毒素组比较,尿毒症毒素+STS组细胞中ERK、NF-κB和Ⅰ型胶原mRNA表达水平升高(P<0.01);抑制ERK通路后,与空白对照组、尿毒症毒素组和尿毒症毒素+STS组比较,尿毒症毒素+STS+ERK抑制剂组细胞中ERK、NF-κB和Ⅰ型胶原mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。TUNEL法检测,尿毒症毒素+STS组的细胞凋亡率小于尿毒症毒素刺激组和尿毒症毒素+STS+ERK抑制剂组(P<0.05)。结论:一定浓度STS能通过ERK信号通路调节NF-κB和Ⅰ型胶原mRNA及蛋白表达来改善尿毒症毒素作用下的内皮细胞增殖,减少细胞凋亡。

山药总蛋白对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞氧化应激的保护作用及机制研究

探究山药总蛋白对高浓度D-葡萄糖(High concentrations of D-glucose,HG)诱导的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)氧化应激损伤的保护作用及其机制。利用50 mmol/L HG建立HUVECs损伤模型。将HUVECs随机分为对照组、模型组、山药总蛋白低剂量组(0.5 mg/mL)以及山药总蛋白高剂量组(1 mg/mL),评估山药总蛋白对HG处理的HUVECs的细胞活力、细胞形态及血管生成能力的影响;检测细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的水平和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)的活力;以及培养基上清液中一氧化氮(Nitric oxide,NO)、8-羟基脱氧鸟苷(8-Hydroxy deoxyguanosine,8-OHdG)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的水平;测定B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(Txnip)、NOD样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶剪切体-1(Cleaved caspase-1)和IL-1β蛋白的表达水平。结果显示,山药总蛋白能显著提高HG处理后的HUVECs的细胞活力(P<0.01),改善细胞凋亡形态,并显著升高SOD和CAT的活力(P<0.05或P<0.01)以及凋亡相关蛋白(Bcl-2/Bax)的比值、血管形成能力、NO分泌量。此外,山药总蛋白还显著降低了HUVECs的ROS、MDA、8-OHdG、IL-1β和IL-6的水平(P<0.05或P<0.01)及炎症相关蛋白(Txnip、NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β)的表达水平(P<0.05或P<0.01),并且上述指标的变化均呈现明显的浓度依赖性。本研究结果表明,山药总蛋白可能通过抑制Txnip/NLRP3信号通路从而保护HUVECs拮抗HG诱导的氧化应激,恢复HUVECs内的氧化平衡,进一步减轻细胞的炎症反应。

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯致人脐静脉内皮细胞氧化损伤及白藜芦醇的修复作用

目的:探究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的氧化损伤,以及白藜芦醇对该损伤的修复作用。方法:通过CCK8实验筛选DEHP的损伤浓度和白藜芦醇的修复浓度;化学分光光度比色法检测HUVEC丙二醛和超氧化物歧化酶(SOD)的不同表达情况;活性氧荧光探针检测不同处理组HUVEC内活性氧水平;JC-1试剂盒检测不同组HUVEC线粒体膜电位;CCK8实验、Transwell实验、划痕愈合实验观察HUVEC增殖、迁移能力;细胞流式实验、蛋白质印迹实验观察HUVEC的凋亡情况和凋亡相关蛋白的表达。结果:80μmol/L DEHP作用HUVEC 24 h后,细胞增殖能力明显降低(P<0.01),40μmol/L白藜芦醇对细胞无明显毒性;损伤组细胞的丙二醛水平和SOD活性较对照组均明显上升(P均<0.01),修复组丙二醛水平和SOD活性较损伤组均明显下降(P均<0.05);损伤组细胞的活性氧表达较对照组明显上升(P<0.01),修复组较损伤组明显下降(P<0.01);损伤组细胞的线粒体膜电位较对照组明显下降(P<0.01),修复组较损伤组明显上升(P<0.01);损伤组细胞的增殖、迁移、成管能力较对照组明显下降(P均<0.05),修复组较损伤组明显上升(P均<0.05);损伤组细胞的凋亡水平较对照组明显上升(P<0.05),修复组较损伤组明显下降(P<0.05)。结论:DEHP能够通过氧化应激途径抑制HUVEC的增殖、迁移和成管能力,并诱导其凋亡,而白藜芦醇可以有效修复该种损伤。

靶向B7-H3抑制人脐静脉血管内皮细胞生长、迁移和血管形成

目的探讨靶向抑制协同信号分子B7-H3对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)生长、迁移及血管生成能力影响。方法使用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲减HUVECs B7-H3分子,采用CCK-8实验检测24 h、48 h和72 h细胞增殖;采用Transwell实验检测24 h细胞迁移;三维细胞培养观察细胞血管生成。结果与空序列转染的阴性对照(siRNA-Control)组比较,siRNA-720、siRNA-1707和siRNA-16903条备选siRNA对B7-H3表达的抑制效果不同,siRNA-1690抑制率明显高于siRNA-720和siRNA-1707,因此,选择使用siRNA-1690序列进行后续实验。CCK-8细胞活力实验结果显示,敲减B7-H3后24 h、48 h和72 h HUVECs增殖能力分别下降24%、22%(P>0.05,与24 h比较)和15%(P<0.05,与48 h比较);Transwell迁移实验表明,与siRNA-Control组对比,敲减B7-H3的HUVECs 24 h迁移能力明显减低(P<0.01);三维细胞培养结果表明,采用si-B7-H3敲减B7-H3基因后,HUVECs血管生成能力明显下降(P<0.01)。结论靶向B7-H3抑制HUVECs生长、迁移及血管生成。

基于人脐静脉内皮细胞的OGD/R模型研究当归-川芎药对中7个活性成分对VEGF-PI3K-AKT/NF-κB信号通路的影响

目的探讨当归-川芎药对中7个活性成分(绿原酸、阿魏酸、咖啡酸、丁烯基苯酞、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、藁本内酯)对VEGF-PI3K-AKT/NF-κB信号通路关键蛋白及其上下游血管活性物质、黏附因子和炎症因子的调控作用。方法构建人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型,采用细胞增殖试剂盒(CCK-8法)检测细胞活力,探索7个成分的最佳造模时间;通过检测乳酸脱氢酶(LDH)释放探索最佳给药浓度;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测7个成分对VEGF、VCAM-1、PAI-1、NF-κB、IL-1和IL-6表达的影响;采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测7个成分对VEGF-PI3K-AKT/NF-κB信号通路关键蛋白mRNA表达的影响。结果HUVEC氧糖剥夺6 h再复氧为最佳造模时间。高剂量绿原酸组、阿魏酸组、洋川芎内酯H组,低、中剂量丁烯基苯酞组,中、高剂量洋川芎内酯A、藁本内酯组显著降低LDH漏出率(P<0.05,P<0.01);绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯H部分剂量组细胞中VEGF、ICAM-1、VCAM-1的表达显著降低,绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯H、藁本内酯部分剂量组细胞NF-κB的表达显著下降,绿原酸、咖啡酸、丁烯基苯酞、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A部分剂量组细胞中IL-6的表达显著增加,绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯A部分剂量组细胞IL-1表达显著减少,阿魏酸、洋川芎内酯H部分剂量组细胞中PAI-1的表达量显著下降(P<0.05,P<0.01);绿原酸、阿魏酸、咖啡酸、丁烯基苯酞和洋川芎内酯A部分剂量组细胞中ERK、VEGF、NF-κB、VEGFR2和MMP9的mRNA相对表达量显著下调,洋川芎内酯H和洋川芎内酯A部分剂量组细胞中AKT的mRNA相对表达量均显著上调(P<0.05,P<0.01)。结论当归-川芎中的药效成分可能通过抑制黏附因子、炎症因子和VEGF-PI3K-AKT/NF-κB信号通路关键蛋白mRNA的表达,从而发挥抗缺血性中风的作用。

越婢汤对阿霉素诱导的人脐静脉内皮细胞高通透性的影响及机制研究

目的研究越婢汤对阿霉素诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)高通透性的影响,探讨其治疗肾病综合征水肿的可能作用机制。方法将HUVEC分为对照组、模型组和越婢汤低、中、高剂量组(200、300、400μg/mL),CCK-8法检测细胞活力,Transwell法检测细胞通透性,Western blot检测凋亡信号调节激酶1(ASK1)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、血管内皮-钙黏蛋白(VE-cadherin)、p38蛋白表达,免疫荧光法检测ZO-1和VE-cadherin表达。结果与对照组比较,模型组HUVEC细胞活力明显降低,细胞通透性明显增加,细胞肿胀、膜结构破坏,ASK1、p-p38蛋白表达明显升高,ZO-1、VE-cadherin蛋白表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,越婢汤各剂量组细胞活力明显增加,细胞通透性明显降低,ASK1、p-p38蛋白表达明显降低,ZO-1、VE-cadherin蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论越婢汤可改善阿霉素诱导的HUVEC高通透性,其作用机制可能与抑制ASK1/p38信号通路、上调细胞连接蛋白表达相关。

幽门螺杆菌感染所致人脐静脉内皮细胞功能异常及炎性反应的作用机制研究

目的探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)通过激活转录激活因子3(STAT3)/核转录因子κB(NF-κB)通路对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增殖、迁移、凋亡及炎性反应的影响。方法将HUVEC分为对照组(未感染Hp)和Hp感染组(Hp感染复数=25),通过倒置显微镜观察感染Hp的HUVEC形态变化;细胞计数试剂盒8细胞增殖实验和平板克隆实验检测2组HUVEC增殖能力,Transwell实验和划痕愈合实验检测HUVEC的迁移能力,流式细胞术检测HUVEC的凋亡率,实时荧光定量聚合酶链反应检测2组HUVEC中Hp细胞毒素相关基因A、白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)信使核糖核酸表达情况;Western blot检测HUVEC细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、原癌基因(C-Myc)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、B淋巴细胞瘤2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关x蛋白(Bax)、STAT3/NF-κB信号通路蛋白表达情况。结果与对照组比较,Hp组细胞增殖、纵向、横向迁移能力明显降低,CyclinD1、PCNA、C-Myc、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达量降低,Bax、磷酸化STAT3/STAT3、磷酸化NF-κB P65/NF-κB-P65蛋白表达量和HUVEC凋亡率升高(P<0.05,P<0.01),炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-αmRNA水平升高(2.71±0.05 vs 1.06±0.41,1.42±0.02 vs 0.92±0.11,2.50±0.29 vs 1.00±0.10,5.34±0.57 vs 1.00±0.16,P<0.01)。结论Hp通过激活STAT3/NF-κB通路抑制HUVEC增殖、迁移,并诱导其凋亡和炎性反应的发生。