剪切修复基因D通过下调mTOR/LOX-1抑制ox-LDL诱导的人脐静脉平滑肌细胞增殖

[目的]探讨剪切修复基因D(XPD)在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)促血管平滑肌细胞增殖中的作用及分子机制。[方法]将重组质粒pEGFP-N2/XPD利用脂质体转染人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMC),沉默哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因,用MTT、EdU法测定各组细胞的增殖;流式细胞仪检测各组凋亡率;利用Western blot检测XPD、血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)、mTOR、p-mTOR、Bcl-2及Bax的表达。[结果]与对照组比较,ox-LDL组XPD表达明显下调(P<0.05),Bax蛋白表达下调(P<0.05),Bcl-2蛋白、Bcl-2/Bax、mTOR磷酸化活性及LOX-1蛋白表达升高(P<0.05);MTT、BdU结果显示,ox-LDL组细胞增殖较对照组上调(P<0.05)。转染pEGFP-N2/XPD重组质粒能上调Bax蛋白表达(P<0.05)并抑制Bcl-2蛋白、mTOR磷酸化活性及LOX-1蛋白表达(P<0.05),Bcl-2/Bax比值下调(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示,转染pEGFP-N2/XPD重组质粒后,细胞凋亡率较对照组增加(P<0.05);MTT、BdU结果显示,转染pEGFP-N2/XPD重组质粒后,细胞增殖较对照组下调(P<0.05)。沉默mTOR基因后,与对照组相比,siRNA mTOR组HUVSMC中LOX-1蛋白表达被抑制(P<0.05)。[结论]XPD能抑制HUVSMC的增殖并且促进其凋亡,下调mTOR和LOX-1蛋白表达,抑制ox-LDL的促HUVSMC增殖和抗凋亡作用,有可能成为抗动脉粥样硬化治疗的靶点。

金雀异黄素抑制ox-LDL诱导的人脐静脉平滑肌细胞MCP-1表达的信号途径初探

目的 研究金雀异黄素抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白 1mRNA和蛋白表达的作用机制。方法 采用逆转录聚合酶链反应技术和酶联免疫吸附试验测定细胞中单核细胞趋化蛋白 1mRNA的表达量及蛋白的含量。观察雌激素受体拮抗剂他莫昔芬对金雀异黄素抑制单核细胞趋化蛋白 1表达作用的影响。结果 他莫昔芬不能阻断金雀异黄素抑制单核细胞趋化蛋白 1mRNA和蛋白表达的作用(P >0 .0 5 )。结论 金雀异黄素下调氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白

不同浓度β-甘油磷酸盐对人脐静脉平滑肌细胞钙化的影响

目的探寻β-甘油磷酸盐诱导原代培养人脐静脉平滑肌细胞(HUSMC)钙化的适宜浓度。方法采用原代培养人脐静脉平滑肌细胞,根据培养液中β-甘油磷酸盐浓度不同依次分为8组:正常对照组、10mM组、12mM组、14 mM组、16 mM组。以更换培养液当天记为第1天,培养10d,von kossa染色观察细胞钙沉积情况、显微图像分析法测量钙化阳性细胞百分比、比色法检测细胞内钙含量和碱性磷酸酶活性。结果对照组SMC银染无钙结节,显微图像分析阳性细胞为(0.1060±0.05)%;12mM组SMC银染可见明显钙结节存在,钙化阳性细胞数为(4.7009±1.35)%,钙含量和碱性磷酸酶活性较对照组明显升高(P<0.05)。10mM组、16mM组、20mM组、30mM组与对照组相比钙含量和碱性磷酸酶活性差异无统计学意义(P>0.05),但10mM组、16mM组钙化阳性细胞百分比升高明显(P<0.05),20mM组、30mM组与对照组相比钙化阳性细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05);40mM组钙含量和碱性磷酸酶活性明显降低(P<0.001),灰度扫描钙化阳性细胞随之降低。结论12mMβ-甘油磷酸盐可刺激人脐静脉平滑肌细胞出现钙盐沉积,且人脐静脉SMC钙化对β-甘油磷酸盐无浓度依赖性。

不同浓度葡萄糖环境下Fe^2＋对人脐静脉平滑肌细胞增殖及基质金属蛋白酶-2分泌的促进作用

目的:探讨正常及高葡萄糖环境下,Fe2+对人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMC)增殖及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)分泌的作用。方法:以相同浓度接种普通培养液及高浓度葡萄糖培养液培养的3～5代HUVSMC为正常组及高糖组,分别以不同浓度Fe2+处理。培养24h后,四甲基氮唑盐(MMT)比色法测定细胞增殖水平,ELISA试剂盒检测细胞培养上清中MMP-2含量。结果:不同浓度葡萄糖环境下,0.0125～0.1000g/L浓度Fe2+均能促进HUVSMC增殖,且高糖组作用较正常组强;正常组Fe2+浓度在0.1g/L时能促进HUVSMC分泌MMP-2,高糖组所有浓度Fe2+均表现促分泌作用。结论:适当浓度的Fe2+能影响HUVSMC的生物学特性,促进HUVSMC的增殖与MMP-2的分泌,且高糖环境下促进作用更为显著。

不同浓度硫氢化钠对人脐静脉平滑肌细胞生长的影响

目的摸索体外培养体系中不影响人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMCs)生长的硫氢化钠(NaHS)适宜浓度。方法采用原代培养人脐静脉平滑肌细胞,实验分为八组,分别是正常对照组和七个NaHS浓度组,依次为:5.0×10-3M、1.0×10-3M、2.0×10-4M、4.0×10-5M、8.0×10-6M、1.6×10-6M、3.2×10-7M。采用细胞计数法绘制细胞生长曲线并观察细胞的生长状态,MTT检测细胞生长活力,流式细胞术检测细胞周期并进行比较。结果 4.0×10-5M组、8.0×10-6M组、1.6×10-6M组、3.2×10-7M组从细胞生长活力、细胞周期及细胞生长曲线绘制三方面与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05);5.0×10-3M组、1.0×10-3M组、2.0×10-4M组与对照组相比,细胞生长受到抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 1.6×10-6M～4.0×10-5M中任意浓度的NaHS均不影响HUVSMCs的正常生长,其可作为培养HUVSMCs并作为实验材料的浓度范围。

柚皮苷和橙皮苷对人脐静脉平滑肌细胞增殖及凋亡的影响

目的通过对比两种主要的柑橘类黄酮—柚皮苷和橙皮苷对体外培养的人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMCs)细胞活力、增殖和凋亡的影响,探究不同结构柑橘类黄酮对HUVSMCs功能的影响。方法将柚皮苷和橙皮苷与氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)一起作用于HUVSMCs24 h后,MTT法测细胞活力,流式细胞术测细胞周期和凋亡,实时荧光定量PCR和Western blot分别检测细胞增殖(PCNA和Cyclin D1)和凋亡(Caspase-3和Caspase-8)相关基因和蛋白的表达。结果两种柑橘黄酮均能抑制由ox-LDL引起的HUVSMCs细胞增殖,且相同浓度下,橙皮苷抑制增殖的作用更强(P<0.05);柚皮苷和橙皮苷均能降低PCNA和Cyclin D1基因和蛋白表达量,升高Caspase-3和Caspase-8表达量,且橙皮苷升高Caspase-3的作用较柚皮苷更强(P<0.05);结论与柚皮苷相比,橙皮苷具有更强的抑制由ox-LDL诱导的HUVSMCs细胞增殖作用,并促进其凋亡。

氧化苦参碱对人脐静脉平滑肌细胞钙化的影响及其可能机制

目的:观察氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)对人脐静脉平滑肌细胞(humans umbilical vein smooth muscle cells,HUSMCs)钙化的影响及其可能机制。方法:以β-甘油磷酸盐诱导HUSMCs钙化,实验分为对照组、钙化组、单纯OMT组、OMT干预高、中、低剂量组。采用Von Kossa染色鉴定细胞钙化,比色法检测细胞钙含量,磷酸苯二钠法测定ALP活性,放射免疫法测定骨钙素(OC)含量,ELISA检测细胞培养液中TGF-β1和细胞内psmad2/3,smad2/3的含量变化,Western blot法检测细胞内Cbfα1蛋白的表达。结果:钙化组与对照组相比平滑肌细胞内可见大量黑色颗粒聚集,钙含量,ALP活性,OC,TGF-β1,smad2/3磷酸化和Cbfα1蛋白的含量均明显增加;OMT干预后钙化指标均下降,TGF-β1,smad2/3磷酸化和Cbfα1蛋白表达量亦明显减少,且高剂量OMT组效应强于中、低剂量组。结论:OMT可有效抑制β-甘油磷酸盐诱导的HUSMCs钙化,且OMT降低TGF-β1,smad2/3磷酸化和Cbfα1蛋白表达可能是OMT抑制HUSMCs钙化的机制之一。

反油酸对人脐静脉平滑肌细胞活力的影响

平滑肌细胞是血管壁中膜的主要细胞成分,是动脉粥样硬化（atherosclerosis,As）和血管成形术后再狭窄（restenosis after angioplasty,RAA）等病理过程形成和发展的重要部位,对血管壁的完整性和紧张性的调节也起重要作用,

IL-6通过STAT3/Oct-1/ATM途径调节人脐静脉平滑肌细胞增殖

该研究旨在探究白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)对人脐静脉平滑肌细胞(human umbilical vascular smooth muscle cells,HUVSMCs)增殖的影响及具体的调节机制。通过细胞活性检测试剂盒(cell count kit 8,CCK-8)和EdU成像试剂盒检测HUVSMCs增殖的变化,蛋白质免疫印迹(Western blot)分析细胞的蛋白表达变化,特异性小RNA抑制八聚体转录因子-1(octamer transcription factor-1,Oct-1)的表达,免疫荧光技术检测Oct-1在细胞中的位置变化。结果显示,IL-6可以显著促进HUVSMCs的增殖,激活信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的Ser727位点磷酸化,促进Oct-1和共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasia mutated,ATM)的表达;此外,IL-6刺激细胞0 h和6 h时,Oct-1主要集中在细胞核中,12 h和24 h时,Oct-1部分转移至细胞质中。同时,抑制Oct-1可以有效降低细胞增殖,减少IL-6和ATM的表达,加入IL-6可以缓解由Oct-1抑制的HUVSMCs增殖。以上结果表明,IL-6可以通过STAT3/Oct-1/ATM途径影响HUVSMCs的增殖。这一发现为心血管疾病的基础治疗带来新思路。

染料木黄酮对ox-LDL诱导人静脉平滑肌细胞MCP-1表达的影响

目的: 研究染料木黄酮(Gen)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉血管平滑肌细胞(hUVSMC)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA和蛋白表达的影响。方法: 以hUVSMC为对象,采用逆转录聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验观察不同浓度Gen(1.0×10-5、3.0×10-5、9.0×10-5 mol/L)对ox-LDL诱导的MCP-1 mRNA和蛋白表达的影响。结果:三种浓度的Gen均能明显降低ox-LDL诱导的hUVSMC MCP-1mRNA 和蛋白的表达,且高剂量与生理浓度的17b-雌二醇有相近的作用。结论:染料木黄酮能下调ox-LDL诱导的hUVSMC MCP-1mRNA和蛋白的表达,这可能是染料木黄酮抗动脉粥样硬化的重要机制之一。

TGF-β2调控血管平滑肌细胞表型转化在静脉血栓管壁重塑中的作用及其机制

目的探讨静脉血栓后管壁重塑过程中转化生长因子β2(TGF-β2)调控血管平滑肌细胞(SMC)表型转化的作用及其机制。方法用0、1、10、20 ng/ml TGF-β2刺激人脐静脉平滑肌细胞(HVSMCs)24 h,以及10 ng/ml TGF-β2刺激HVSMCs 0、2、6、24 h,分别提取RNA,采用RT-PCR检测HVSMCs表型标志物(收缩型:α-SMA和Elastin;合成型:Col1A1和Col1A2)mRNA的表达。建立SD大鼠下腔静脉血栓模型,将大鼠随机分为假手术组(n=5)、血栓组(n=9)和TGF-β2实验组(n=5)。造模后第4天和第7天,采用HE和Masson染色进行验证。造模后第14天,用含TGF-β2(10 ng/只)的水凝胶在血栓局部处理24 h,采用RT-PCR检测各组静脉管壁SMC表型标志物mRNA的表达。结果TGF-β2可上调HVSMC收缩型和合成型标志物mRNA的表达且呈剂量和时间依赖性(P<0.05),其中对收缩型标志物mRNA表达的上调作用更为明显。HE和Masson染色显示急性期(造模后第4天)血栓形成和慢性期(造模后第7天)血栓机化再通,证实下腔静脉血栓造模成功。造模后第14天,与假手术组比较,血栓组静脉管壁SMC收缩型标志物mRNA的表达明显下调,合成型标志物mRNA的表达明显上调(P<0.05)。在血栓局部使用TGF-β2处理后,收缩型标志物mRNA的表达上调更为明显(P<0.05)。结论TGF-β2可诱导HVSMC收缩型和合成型标志物的表达,其中对收缩型标志物的上调作用更为明显。在大鼠下腔静脉血栓模型中,TGF-β2可明显上调SMC收缩型标志物的表达,有利于维持血栓段静脉管壁SMC的收缩表型。

肿瘤坏死因子-α调控血管平滑肌细胞向巨噬细胞表型转化及其在静脉血栓管壁重塑中的作用及机制

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)调节血管平滑肌细胞(VSMC)向巨噬细胞表型转化及其在静脉血栓管壁重塑中的作用及相关机制。方法选取2020年6—12月上海交通大学医学院附属第九人民医院收治的16例患者为研究对象,以血栓累及下肢浅静脉中膜部分作为试验组,邻近未受血栓累及的正常浅静脉中膜部分作为对照组,将16例血栓性浅静脉炎患者中的6例进行基因芯片分析,剩余10例患者进行巨噬细胞表型标志物mRNA的检测。并于上海交通大学医学院实验动物中心获得清洁级雄性SD大鼠22只进行动物实验,下腔静脉血栓造模成功的SD大鼠随机分为血栓组(n=12)和实验组(n=10)。收集人血栓性静脉炎静脉管壁组织,通过基因芯片和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测人静脉管壁VSMC巨噬细胞样表型标志物mRNA的表达。TNF-α作用人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMC)3~4 d后,使用RT-PCR检测HUVSMC收缩表型、合成表型及巨噬细胞样表型标志物mRNA的表达。构建SD大鼠下腔静脉血栓模型,TNF-α局部处理血栓段静脉管壁24~48 h后,使用RT-PCR检测各组静脉管壁VSMC收缩表型、合成表型及巨噬细胞样表型标志物mRNA的表达。结果试验组人静脉管壁中膜巨噬细胞表型标志物白细胞分化抗原68(CD68)mRNA表达高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。TNF-α作用HUVSMC 3~4 d后,试验组收缩表型α2-肌动蛋白(ACTA2)、转凝蛋白(TAGLN)和合成表型标志物I型胶原蛋白α1链(COL1A1)mRNA均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),其中收缩表型标志物的mRNA变化更为明显;TNF-α作用HUVSMC后,试验组巨噬细胞表型相关标志物CD68、半乳糖凝集素3(LGALS3)和炎症因子标志物肿瘤坏死因子(TNF)mRNA均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。TNF-α处理下腔静脉血栓形成静脉管壁24 h后,实验组大鼠静脉管壁VSMC表型标志物中Tagln mRNA表达明显低于血栓组,差异有统计学意义(P<0.01),而两组大鼠Acta2、Col1a1 mRNA表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。TNF-α处理下腔静脉血栓形成静脉管壁24 h后,实验组大鼠巨噬细胞表型标志物Cd68、Lgals3、Tnf mRNA均明显高于血栓组,差异均有统计学意义(P<0.01);TNF-α处理下腔静脉血栓形成静脉管壁48 h后,实验组大鼠巨噬细胞表型标志物分子Cd68、Lgals3 mRNA表达均明显低于血栓组,差异均有统计学意义(P<0.01),而Tnf mRNA表达明显高于血栓组(P<0.01)。结论血栓形成后静脉管壁VSMC可在TNF-α刺激下向巨噬细胞样表型转化,且该巨噬细胞样VSMC拥有分泌TNF-α的能力,并可能成为管壁炎症反应的重要细胞来源,加重炎症反应,为血栓形成后综合征(PTS)的防治干预靶点提供新策略。

外源性硫化氢通过对抗氧化应激减轻血管平滑肌细胞钙化

目的探讨外源性硫化氢减轻人脐静脉平滑肌细胞(HVSMCs)钙化的机制。方法采用组织块重复贴壁法培养原代HVSMCs,经免疫细胞化学法鉴定后,将细胞随机分为对照组、高磷组(12mmolβ-GP)、高磷+Na HS组(8.0×10-6mol Na HS)、高糖组(25mmol D-葡糖糖)、高糖+Na HS组(8.0×10-6mol Na HS)。采用茜素红S染色法定性检测平滑肌细胞钙化程度;MTT法检测细胞存活率;比色法检测细胞内钙含量、碱性磷酸酶(ALP)活性、丙二醛(MDA)含量及总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力;DCFH-DA荧光标记染色法检测细胞活性氧(ROS)水平。结果 MTT结果显示,与正常组相比,高磷和高糖均使细胞存活率下降(P均<0.05),而加入Na HS干预的两组细胞存活率基本恢复至正常组水平。与正常组相比,高磷组和高糖组钙沉积明显增加,胞内钙含量、ALP活性显著升高(P<0.05),氧化应激指标ROS增加、MDA含量升高(P<0.05),而抗氧化应激指标T-SOD活力下降(P<0.05)。而分别加Na HS干预的两组细胞,与高磷组和高糖组相比钙沉积减轻,钙含量、ALP活性、ROS、MDA回升(P<0.05),而T-SOD活力升高(P<0.05)。结论外源性硫化氢部分通过对抗氧化应激而减轻血管平滑肌细胞钙化。

蛋白酶体抑制剂MG132诱导人血管平滑肌细胞凋亡及其机制研究

目的:观察蛋白酶体抑制剂MG132对人脐静脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)表达的影响。方法:采用多个浓度(2.5、5、10μmol/L)的蛋白酶体抑制剂MG132处理人脐静脉VSMC 24 h和48 h;流式细胞术分析细胞凋亡率;RT-PCR检测泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)相关基因泛素、泛素活化酶(E1)、泛素缀合酶(E2)、泛素连接酶(E3)、26S蛋白酶体和caspase3基因转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达。结果:蛋白酶体抑制剂MG132处理48 h后细胞凋亡率增加;细胞内UPP相关的基因mRNA表达降低,而caspase 3 mRNA表达增高;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达水平升高。结论:蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导人脐静脉VSMC凋亡,其作用呈量-效关系;MG132诱导VSMC凋亡与下调UPP相关基因和上调caspase3基因及蛋白的表达有关。