靶向B7-H3抑制人脐静脉血管内皮细胞生长、迁移和血管形成

目的探讨靶向抑制协同信号分子B7-H3对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)生长、迁移及血管生成能力影响。方法使用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲减HUVECs B7-H3分子,采用CCK-8实验检测24 h、48 h和72 h细胞增殖;采用Transwell实验检测24 h细胞迁移;三维细胞培养观察细胞血管生成。结果与空序列转染的阴性对照(siRNA-Control)组比较,siRNA-720、siRNA-1707和siRNA-16903条备选siRNA对B7-H3表达的抑制效果不同,siRNA-1690抑制率明显高于siRNA-720和siRNA-1707,因此,选择使用siRNA-1690序列进行后续实验。CCK-8细胞活力实验结果显示,敲减B7-H3后24 h、48 h和72 h HUVECs增殖能力分别下降24%、22%(P>0.05,与24 h比较)和15%(P<0.05,与48 h比较);Transwell迁移实验表明,与siRNA-Control组对比,敲减B7-H3的HUVECs 24 h迁移能力明显减低(P<0.01);三维细胞培养结果表明,采用si-B7-H3敲减B7-H3基因后,HUVECs血管生成能力明显下降(P<0.01)。结论靶向B7-H3抑制HUVECs生长、迁移及血管生成。

KIF2C对肝细胞癌细胞恶性生物学行为和人脐静脉内皮细胞血管生成的影响

目的:探究驱动蛋白-13家族2C(KIF2C)对肝细胞癌(HCC)细胞增殖、侵袭和迁移以及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管生成的影响,为HCC治疗提供潜在靶点。方法:用数据库数据分析KIF2C mRNA和蛋白在HCC组织中的表达及其与血管生成相关因子(VEGFR2和HIF-1α)表达的相关性,常规培养人正常肝细胞QSG-7701、HUVEC和HCC细胞Huh-7、Hep3B2.1-7,用Lipofectamine 3000转染试剂将sh-NC和sh-KIF2C转染至Huh-7、Hep3B2.1-7细胞,qPCR检测各组QSG-7701、Huh-7和Hep3B2.1-7细胞中KIF2C mRNA的表达,WB法检测各组细胞中KIF2C蛋白的表达,细胞克隆形成实验检测敲低KIF2C对Hep3B2.1-7和Huh-7细胞克隆形成的影响,小管生成实验检测敲低KIF2C表达的Huh-7和Hep3B2.1-7细胞的条件培养液对HUVEC血管生成能力的影响。结果:数据库分析结果显示,KIF2C mRNA和蛋白在HCC组织中均呈高表达(均P<0.01),用qPCR和WB法检测人HCC中KIF2C mRNA和蛋白的表达水平,结果显示其mRNA和蛋白在各HCC细胞中也呈高表达(均P<0.01),与数据库数据分析结果相符。数据库数据分析还显示,KIF2C与HCC组织中VEGFR2、HIF-1α的表达水平呈正相关(P<0.05或P<0.01)。成功构建了稳定低表达KIF2C的Huh-7和Hep3B2.1-7细胞(均P<0.01),敲低KIF2C表达均可明显抑制Huh-7和Hep3B2.1-7细胞的增殖能力(均P<0.01)、侵袭和迁移能力(均P<0.01),敲低KIF2C表达的HCC细胞条件培养液均可显著抑制体外HUVEC的血管生成能力(P<0.05或P<0.01)。结论:KIF2C可促进Huh-7和Hep3B2.1-7细胞增殖、侵袭和迁移以及HUVEC血管生成的能力,提示KIF2C可能是治疗HCC的潜在靶点。

ADAM10在人动静脉内瘘狭窄处血管组织中的表达及其对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨去整合素金属蛋白酶10 (ADAM10)在人动静脉内瘘(AVF)狭窄处血管组织中的表达及其对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移的影响,并阐明其可能的分子机制。方法:收集42例因AVF狭窄再次接受手术治疗的终末期肾病(ESRD)患者狭窄静脉血管组织(AVF组)及其首次手术的正常静脉血管组织(正常对照组)。采用免疫组织化学法检测2组患者静脉血管组织中ADAM10蛋白表达情况,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测2组患者静脉血管组织中ADAM10 mRNA表达水平。将VSMCs分为对照组、模型组[脂多糖(LPS)组,给予10 mg·L^(-1)LPS]、LPS+si-NC组(转染si-NC质粒+10 mg·L^(-1) LPS)、LPS+si-ADAM10组(转染si-ADAM10质粒+10mg·L^(-1)LPS)、 LPS+Notch信号通路抑制剂DAPT组(10mg·L^(-1)LPS+10μmol·L^(-1)Notch信号通路抑制剂DAPT)和LPS+si-ADAM10+DAPT组(转染si-ADAM10质粒+10 mg·L^(-1)LPS+10μmol·L^(-1) DATP),CCK-8法检测各组细胞增殖活性,Transwell法检测各组迁移细胞数,Western blotting法检测各组细胞中ADAM10、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、Notch同源蛋白1 (Notch1)、Notch细胞内片段(NICD)和发状分裂相关增强子1 (Hes1)蛋白表达水平。结果:与正常对照组比较,AVF组患者静脉血管组织中ADAM10蛋白表达量明显增加,ADAM10 mRNA表达水平明显增加(P<0.05)。与对照组比较,LPS组细胞增殖活性和迁移细胞数及细胞中ADAM10、PCNA、MMP-9、Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);与LPS组和LPS+si-NC组比较,LPS+si-ADAM10组细胞增殖活性和迁移细胞数及细胞中ADAM10、PCNA、MMP-9、Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+si-ADAM10组和LPS+DAPT组细胞增殖活性和细胞迁移数量及细胞中PCNA、MMP-9、 Notch1、 NICD和Hes1蛋白表达水平均明显降低(P<0.05);与LPS+si-ADAM10组比较,LPS+si-ADAM10+DAPT组细胞增殖活性和细胞迁移数及细胞中PCNA、MMP-9、Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。结论:ADAM10在人AVF狭窄处血管组织中高表达,沉默ADAM10基因表达可抑制LPS诱导的VSMCs增殖和迁移,其作用机制可能与阻断Notch信号通路有关。

Gal-3通过ERK1/2通路诱导血管平滑肌细胞增殖促进大鼠动静脉内瘘狭窄发生的机制

目的探讨半乳糖凝集素-3(Gal-3)诱导血管平滑肌细胞增殖及促进大鼠动静脉内瘘(AVF)狭窄发生的作用,并探讨可能机制。方法取30只AVF大鼠,随机数字法分为AVF组、柑橘果胶组、联合组,每组10只;另取10只大鼠行假手术,设为假手术组。联合组灌胃柑橘果胶生理盐水溶液(含柑橘果胶0.15 mg/kg),尾静脉注射表皮生长因子[细胞外信号调节激酶(ERK)通路激动剂(EGF)](10μg/kg);柑桔果胶组灌胃柑橘果胶生理盐水溶液(0.15 mg/kg),尾静脉注射等体积PBS;假手术组、AVF组灌胃等量生理盐水,尾静脉注射等体积PBS。每日1次。干预4周。MTT法检测血管平滑肌细胞增殖能力;ELISA法检测血清炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)]水平;ELISA法检测血管组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)水平;Western blot法检测血管组织p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达量。结果与AVF组比较,柑橘果胶组24、48、72 h吸光度值,血清TNF-α、IL-6水平,血管组织TGF-β1、VEGF水平,p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2降低(P<0.05);与柑橘果胶组比较,联合组24、48、72 h吸光度值,血清TNF-α、IL-6水平,血管组织TGF-β1、VEGF水平,p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高(P<0.05)。结论Gal-3抑制剂改良柑橘果胶可抑制血管平滑肌细胞增殖及炎症反应,缓解AVF狭窄,并抑制ERK信号通路活性。

剪切修复基因D通过下调mTOR/LOX-1抑制ox-LDL诱导的人脐静脉平滑肌细胞增殖

[目的]探讨剪切修复基因D(XPD)在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)促血管平滑肌细胞增殖中的作用及分子机制。[方法]将重组质粒pEGFP-N2/XPD利用脂质体转染人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMC),沉默哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因,用MTT、EdU法测定各组细胞的增殖;流式细胞仪检测各组凋亡率;利用Western blot检测XPD、血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)、mTOR、p-mTOR、Bcl-2及Bax的表达。[结果]与对照组比较,ox-LDL组XPD表达明显下调(P<0.05),Bax蛋白表达下调(P<0.05),Bcl-2蛋白、Bcl-2/Bax、mTOR磷酸化活性及LOX-1蛋白表达升高(P<0.05);MTT、BdU结果显示,ox-LDL组细胞增殖较对照组上调(P<0.05)。转染pEGFP-N2/XPD重组质粒能上调Bax蛋白表达(P<0.05)并抑制Bcl-2蛋白、mTOR磷酸化活性及LOX-1蛋白表达(P<0.05),Bcl-2/Bax比值下调(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示,转染pEGFP-N2/XPD重组质粒后,细胞凋亡率较对照组增加(P<0.05);MTT、BdU结果显示,转染pEGFP-N2/XPD重组质粒后,细胞增殖较对照组下调(P<0.05)。沉默mTOR基因后,与对照组相比,siRNA mTOR组HUVSMC中LOX-1蛋白表达被抑制(P<0.05)。[结论]XPD能抑制HUVSMC的增殖并且促进其凋亡,下调mTOR和LOX-1蛋白表达,抑制ox-LDL的促HUVSMC增殖和抗凋亡作用,有可能成为抗动脉粥样硬化治疗的靶点。

高糖诱导下人脐静脉内皮细胞形态、增殖活性及钙黏蛋白表达变化

目的探讨不同糖浓度状态下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)形态、增殖活性及VE-钙黏蛋白(VE-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达变化。方法将HUVECs分为正常对照组(葡萄糖浓度5.5 mmol/L)、甘露醇组(葡萄糖浓度5.5 mmol/L+甘露醇浓度24.5 mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度分别为11.1、22.2、33.3 mmol/L),分别培养24、48、72 h,以显微镜观察细胞形态,用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,Western blotting法检测各组HUVECs VE-cadherin、E-cadherin、N-cadherin表达。结果培养72 h,正常对照组细胞形态呈类圆形,高糖组、甘露醇组细胞形态由圆形、椭圆形逐渐到条索状,细胞数量减少、细胞间隙较前增加。培养24h,高糖组细胞增殖率高于正常对照组;随糖浓度升高,高糖组细胞增殖率呈现先升高后降低趋势。培养48、72h,高糖组细胞增殖率低于正常对照组;随着糖浓度升高,高糖组细胞增殖率逐渐降低。以上各组细胞增殖率比较均有统计学差异(P均<0.05)。培养24、72 h,与正常对照组比较,高糖组HUVECsN-cadherin、VE-cadherin、E-cadherin蛋白表达明显升高(P均<0.05);且随着葡萄糖浓度升高,高糖组细胞N-cadherin、VE-cadherin、E-caderin蛋白表达呈现先升高后降低的趋势。结论在高糖条件下,HUVECs发生形态转变,增殖率下降,且伴有细胞钙黏蛋白N-cadherin、VE-cadherin、E-cadherin表达变化。

不同浓度β-甘油磷酸盐对人脐静脉平滑肌细胞钙化的影响

目的探寻β-甘油磷酸盐诱导原代培养人脐静脉平滑肌细胞(HUSMC)钙化的适宜浓度。方法采用原代培养人脐静脉平滑肌细胞,根据培养液中β-甘油磷酸盐浓度不同依次分为8组:正常对照组、10mM组、12mM组、14 mM组、16 mM组。以更换培养液当天记为第1天,培养10d,von kossa染色观察细胞钙沉积情况、显微图像分析法测量钙化阳性细胞百分比、比色法检测细胞内钙含量和碱性磷酸酶活性。结果对照组SMC银染无钙结节,显微图像分析阳性细胞为(0.1060±0.05)%;12mM组SMC银染可见明显钙结节存在,钙化阳性细胞数为(4.7009±1.35)%,钙含量和碱性磷酸酶活性较对照组明显升高(P<0.05)。10mM组、16mM组、20mM组、30mM组与对照组相比钙含量和碱性磷酸酶活性差异无统计学意义(P>0.05),但10mM组、16mM组钙化阳性细胞百分比升高明显(P<0.05),20mM组、30mM组与对照组相比钙化阳性细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05);40mM组钙含量和碱性磷酸酶活性明显降低(P<0.001),灰度扫描钙化阳性细胞随之降低。结论12mMβ-甘油磷酸盐可刺激人脐静脉平滑肌细胞出现钙盐沉积,且人脐静脉SMC钙化对β-甘油磷酸盐无浓度依赖性。

人脐静脉血管平滑肌促内皮细胞组织因子表达的体外实验研究

目的 研究血管平滑肌细胞对血管内皮细胞组织因子表达的影响并探讨其临床意义。方法 用贴块法培养人脐静脉平滑肌细胞 ;酶消化法培养人脐静脉内皮细胞 ;用培养平滑肌细胞条件培养液 (SMC CM)刺激培养的内皮细胞 ,一步凝固法检测内皮细胞组织因子的活性 ;Northernblot检测内皮细胞组织因子的mRNA表达 ;并用酶联免疫吸附试验检测SMC CM中IL 1α、IL 1β、TNF α和VEGF的含量。结果 SMC CM使内皮细胞组织因子活性呈剂量依赖性增强 ,作用 6h增至最高 ,最高增强约 38倍 ;SMC CM使内皮细胞组织因子mRNA表达显著增强 ;SMC CM中的组织因子诱导剂不耐热 ,且并非IL 1α、IL 1β、TNF α和VEGF等已知的组织因子诱导剂。结论 血管平滑肌细胞能促进血管内皮细胞组织因子的表达 ,提示体内增生的平滑肌细胞 ,如动脉再狭窄新内膜中的平滑肌细胞可能诱导局部血管内皮细胞活化及表达组织因子 ,在局部血栓形成中起一定作用。

补阳还五汤促进人脐静脉内皮细胞血管生成的作用

目的观察补阳还五汤对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的血管生成作用。方法制备补阳还五汤含药血清,以HUVEC为研究对象,将细胞随机分为3组:空白组(10%空白血清)、含药组(含药血清)、含药+DKK组(含药血清+DKK1),CCK-8检测细胞活力,划痕试验检测细胞迁移能力,以Matrigel基质胶为基质,检测HUVEC体外形成血管的能力。结果与空白组比较,含药组能明显提高HUVEC的增殖活力、迁移能力、体外成管能力,但含药+DDK组随着时间延长细胞增殖活力、迁移能力及成管能力均明显下降(均P<0.05)。结论补阳还五汤能促进HUVEC增殖能力,进而促进内皮细胞的血管生成,但加入Wnt通路抑制剂后增殖能力及血管生成能力均下降。补阳还五汤通过改善Wnt信号通路促进血管内皮细胞的新生血管形成,因而可能具有改善下肢新生血管生成的作用。

越婢汤对阿霉素诱导的人脐静脉内皮细胞高通透性的影响及机制研究

目的研究越婢汤对阿霉素诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)高通透性的影响,探讨其治疗肾病综合征水肿的可能作用机制。方法将HUVEC分为对照组、模型组和越婢汤低、中、高剂量组(200、300、400μg/mL),CCK-8法检测细胞活力,Transwell法检测细胞通透性,Western blot检测凋亡信号调节激酶1(ASK1)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、血管内皮-钙黏蛋白(VE-cadherin)、p38蛋白表达,免疫荧光法检测ZO-1和VE-cadherin表达。结果与对照组比较,模型组HUVEC细胞活力明显降低,细胞通透性明显增加,细胞肿胀、膜结构破坏,ASK1、p-p38蛋白表达明显升高,ZO-1、VE-cadherin蛋白表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,越婢汤各剂量组细胞活力明显增加,细胞通透性明显降低,ASK1、p-p38蛋白表达明显降低,ZO-1、VE-cadherin蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论越婢汤可改善阿霉素诱导的HUVEC高通透性,其作用机制可能与抑制ASK1/p38信号通路、上调细胞连接蛋白表达相关。

马脐静脉内皮细胞分离培养及其功能验证

【目的】建立一种简便且高效的体外马脐静脉内皮细胞(equine umbilical vein endothelial cells,eUVECs)分离和培养方法,并提供一个可靠的细胞模型,用于研究马的血管生成功能。【方法】在无菌条件下,从马脐带中分离静脉,并用PBS液彻底冲洗。使用0.2%Ⅰ型胶原酶对脐静脉进行消化25~30 min后,收集分离的eUVECs进行培养。每12 h使用倒置显微镜观察eUVECs的生长状况。使用CCK-8法测定第1代(P1)和P3代eUVECs在7 d内的D450 nm值,并绘制生长曲线。通过免疫荧光染色方法鉴定内皮细胞标记物CD31和CD34的表达情况。使用间充质干细胞成脂和成骨分化诱导试剂诱导eUVECs,以验证其是否具有分化特性。确定内皮细胞后,添加梯度上升浓度(5、10、15、20、25 ng/mL)的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激eUVECs,使用CCK-8法检测细胞活性,观察细胞形态变化。使用Matrigel法培养eUVECs,用ImageJ软件分析数据,并统计新生血管的4个指标:成管交叉点、成管长度、成管数和成管面积。寻找体外血管生成能力的最佳TNF-α刺激浓度。【结果】使用0.2%Ⅰ型胶原酶消化法分离的eUVECs 4~5 d内的汇合度达到90%。在倒置显微镜下观察,这些细胞生长良好并呈铺路石状排列。通过免疫荧光染色确认了CD31和CD34在eUVECs中的阳性表达;并且eUVECs表现出薄弱的成脂和成骨分化能力。在Matrigel法培养条件下,20 ng/mL TNF-α处理组的成管交叉点数、成管长度、成管数和成管面积等血管形成能力指标最高,且极显著高于对照组(P<0.01)。然而,在常规培养条件下,随着TNF-α浓度增加到15 ng/mL,eUVECs的增殖受到显著抑制甚至开始导致细胞的凋亡。【结论】Ⅰ型胶原酶脐带注满消化法能够成功分离培养出原代eUVECs,20 ng/mL TNF-α显著增强eUVECs体外血管生成能力,eUVECs可以作为体外研究血管生成的细胞模型。

象皮生肌膏预处理的骨髓间充质干细胞源外泌体对人脐静脉内皮细胞血管生成的影响

目的探讨象皮生肌膏(Xiangpi Shengji Ointment,XPSJO)预处理的骨髓间充质干细胞源外泌体(XPSJO-Exos)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)血管生成的影响。方法制备象皮生肌膏溶液,CCK-8法检测不同浓度象皮生肌膏(0、10、20、50、100、200μg/mL)对骨髓间充质干细胞活力的影响;提取骨髓间充质干细胞中的外泌体(exosomes,Exos)和XPSJO-Exos,分别设为Exos组和XPSJO-Exos组,另设对照组(HUVEC),通过透射电子显微镜观察Exos的形态,采用粒径分析仪检测其粒径;Western blot检测Exos标志性蛋白TSG101、CD9和CD63的表达;采用PKH67标记Exos,观察其能否被HUVEC所摄取;采用CCK-8、划痕实验、小管形成实验、ELISA法检测Exos对HUVEC细胞增殖、迁移、小管形成和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)浓度的影响;采用RT-qPCR检测血管生成相关基因ANG1、PDGF、bFGF、EGF的mRNA的表达。结果10、20、50μg/mL的XPSJO与0μg/mL的XPSJO间细胞活力比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。与0μg/mL的XPSJO比较,100、200μg/mL的XPSJO细胞活力显著降低(P<0.01)。在后续的实验中选用浓度50μg/mL作为药物使用浓度。Exos组和XPSJO-Exos组均有呈球形、膜结合囊泡的典型Exos结构(大多数Exos粒径约为120 nm,且能被HUVEC摄取),并均检测到Exos标志性蛋白TSG101、CD9和CD63的表达。与对照组比较,Exos组和XPSJO-Exos组在72、96 h时细胞活力均显著增强(P<0.01),HUVEC小管数量、迁移率、VEGF浓度均显著增加或升高(P<0.05,P<0.01)。与Exos组比较,XPSJO-Exos组在72、96 h时细胞活力均显著增强(P<0.05),HUVEC小管数量、迁移率、VEGF浓度著增加或升高(P<0.05,P<0.01)。结论XPSJO-Exos能促进HUVEC的增殖、迁移及小管形成,并促进VEGF的分泌。

基于Wnt/β-catenin信号通路探究白及多糖对高脂高糖环境下人脐静脉内皮细胞的影响

目的研究白及多糖对高脂高糖环境下人脐静脉内皮细胞的影响,揭示白及多糖促进糖尿病足溃疡早期愈合的分子机制。方法用葡萄糖、棕榈酸干预人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模拟糖尿病体内高糖、高脂环境的血管内皮损伤模型,CCK-8法检测棕榈酸、白及多糖、通路抑制剂ICG-001最佳作用浓度及白及多糖细胞毒性,镜下观察最佳浓度葡萄糖、棕榈酸、白及多糖、ICG-001干预后的细胞生长状态,跨内皮细胞电阻实验检测细胞生长情况,免疫荧光法检测β-连环蛋白(β-catenin)在细胞中的核易位情况,Western blot法检测细胞中β-catenin、糖原合成激酶3β(GSK-3β)、c-Myc蛋白表达情况,RT-PCR法检测细胞中血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA表达情况。结果确定葡萄糖最佳浓度为25 mmol/L、棕榈酸为300μmol/L、白及多糖为300μg/mL、ICG-001为10μmol/L,使用最佳浓度葡萄糖和棕榈酸诱导建立血管内皮损伤模型。葡萄糖+棕榈酸300μmol/L组、葡萄糖+棕榈酸300μmol/L+ICG-001组细胞处于生长抑制状态,黏附性下降,细胞活力明显降低;葡萄糖+棕榈酸300μmol/L+白及多糖组、葡萄糖+棕榈酸300μmol/L+ICG-001+白及多糖300μg/mL组细胞碎片及形态异常的细胞数量明显减少,黏附性较前加强,细胞活力明显增高。葡萄糖+棕榈酸300μmol/L组电阻TEER值、胞浆胞核中β-catenin蛋白相对表达量、细胞核中c-Myc蛋白相对表达量及细胞中VEGF、bFGF mRNA相对表达量均明显低于正常对照组(P均<0.05),细胞质中GSK-3β蛋白相对表达量明显高于正常对照组(P<0.05),β-catenin在胞浆胞核表达的荧光强度较弱,葡萄糖+棕榈酸300μmol/L+白及多糖组上述指标均逆转。葡萄糖+棕榈酸300μmol/L+ICG-001组电阻TEER值、胞浆胞核中β-catenin蛋白相对表达量、细胞核中c-Myc蛋白相对表达量及细胞中bFGF mRNA相对表达量均明显低于葡萄糖+棕榈酸300μmol/L组(P<0.05),β-catenin在胞浆胞核表达的荧光强度均较弱,葡萄糖+棕榈酸300μmol/L+ICG-001+白及多糖组上述指标均逆转。结论白及多糖可通过激活Wnt/β-catenin通路,促血管生成,从而达到修复糖尿病足溃疡创面的作用。

过表达vWF对人脐静脉内皮细胞生物学影响的实验研究

目的:探讨过表达血管性血友病因子(vWF)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移、侵袭、凋亡及成管能力的影响。方法:设计构建5种过表达vWF的质粒CRISPRa载体,将HUVECs分为实验组(5组)与对照组。将5种质粒分别转染实验组细胞,Western blotting检测各组细胞vWF的表达效果,选取优势组。通过细胞增殖实验、细胞划痕实验、细胞侵袭实验、细胞凋亡实验、细胞成管实验等,观察过表达vWF对HUVECs增殖、迁移、侵袭、凋亡及成管能力的影响。Western blotting检测5个常见通路蛋白因子在2组细胞中的表达,探测可能相关的机制。结果:成功转染后各组HUVECs的vWF蛋白表达水平均明显升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。其中vWF-OE4组过表达量最高,故选取该引物序列进行后续实验。与对照组相比,vWF-OE组细胞增殖减慢,细胞划痕48 h迁移率降低、Transwell细胞侵袭率降低(P<0.05),细胞凋亡率、血管形成能力、HUVECs生成小管的长度均增高(P<0.05),JUN、P53蛋白含量均增高(P<0.05)。结论:过表达vWF对HUVECs增殖、迁移、侵袭行为具有显著抑制作用,促进凋亡,成管能力增强。

与人脐动脉平滑肌细胞共培养的人脐静脉内皮细胞的生物学特性

目的:通过共培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical venous endothelial ceils,HUVEC)与人脐动脉平滑肌细胞(hunlan umbilical arterial smooth muscle cells,HUASMC),初步探讨观察共培养的HUVEC的形态和增殖特性及经皮冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)后再狭窄的机制。 方法:用共培养装置将体外同时培养在一个培养孔中的HUVEC和HUASMC分离。在倒置显微镜下观察单独培养和共培养HUVEC的生长状态和形态;采用免疫荧光法标记细胞,流式细胞仪测定荧光强度和细胞周期。 结果:共培养的HUVEC逐渐转变为长梭形;单独培养的HUVEC仍保持鹅卵石样。单独培养的和共培养的HUVEC处于细胞周期GO/G1期和G_2+s期的百分率为:(70±3)％和(81±5)％:(22±4)％和(14± 4)％。二者均有Cyclin D的表达,但后者的表达显著低于前者。结论:共培养的HUVEC低血清干预48h形态逐渐变为长梭形,更接近于在体形状;而单独培养的HUVEC仍保持原鹅卵石状。此外,前者的增殖活性也显著低于后者。

与人脐静脉内皮细胞共培养的人脐动脉平滑肌细胞生物学特性研究

目的:通过共培养人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalvenousendothe-lialcells,HUVEC)与人脐动脉平滑肌细胞(humanumbilicalarterialsmoothmusclecells,HUASMC),初步探讨共培养的HUASMC的形态和增殖特性。方法:用共培养装置将体外同时培养在一个培养孔中的HUVEC和HUASMC分离。在倒置显微镜下观察单独培养和共培养HUASMC的生长状态和形态;采用免疫荧光法标记细胞,流式细胞仪测定荧光强度和细胞周期。结果:共培养的HUASMC由长梭状变肥大,处于静止期状态;单独培养的HUASMC仍保持长梭形。共培养的和单独培养的HUASMC处于细胞周期G2+S期和G0/G1期的百分率为:(85±4)%和(69±3)%;(11±2)%和(20±3)%。两者均有CyclinD的表达,但后者的表达显著高于前者。结论:单独培养的HUASMC无血清干预48h后仍保持长梭形,而共培养的HUASMC逐渐变肥大,进入静止期形态。此外,前者的增殖活性也显著高于后者。

体表海绵状静脉畸形中内皮细胞及平滑肌细胞分布与表型对血管塑形的影响

目的:研究内皮细胞、平滑肌细胞在体表海绵状静脉畸形中的分布与表型,并分析其发病机制和研究结果对疾病治疗和功能康复的意义。方法:实验于1996-06/2000-08在第二军医大学整形外科实验室完成。畸形组织25根,正常中小静脉各12根。苏木精-伊红染色观察比较畸形血窦壁和中小静脉壁中内皮细胞、平滑肌细胞的分布并计数分析。Envision法免疫组化染色,观察CD31,α平滑肌肌动蛋白在畸形和中小静脉中的分布。结果:畸形血窦壁中平滑肌细胞数量少,排列紊乱,平滑肌细胞与内皮细胞的比例显著低于微小静脉壁。畸形中CD31表达与中小静脉相似,但α平滑肌肌动蛋白的表达明显低于中小静脉,排列紊乱。结论:海绵状静脉畸形血窦壁中内皮细胞和平滑肌细胞发育不均衡,平滑肌细胞表型异常,导致血窦壁薄弱而在血窦内血液的压力下不断扩张,引起血管塑形障碍,这可能是病变发生和进展的原因。闭塞病理性血窦、阻断病变进展过程从而尽可能保留功能是临床治疗的重点。

尾加压素Ⅱ诱导人脐血管平滑肌细胞肥大及其机制探讨

用植块法培养人脐动脉血管平滑肌细胞,并加入尾加压素(U)进行培养;细胞图像分析系统测量细胞体积,考马斯亮蓝法测定细胞蛋白含量,[3H]-Leucine摄入法测定蛋白合成速率,免疫沉淀法并ERK1/2试剂盒测ERK1/2活性,Western-Blot测ERK蛋白(p-ERK)1/2表达。与对照组相比,加入U培养的平滑肌细胞体积、蛋白含量、蛋白合成速率明显提高,p-ERK活性和表达增强;ERK1/2阻断剂U0126可减弱U的上述作用。表明U可以诱导人脐动脉血管平滑肌细胞肥大,其机制与激活ERK1/2通路有关。

恒磁场对血管紧张素Ⅱ预处理的人脐动脉血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察恒磁场对离体人脐动脉血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的影响。方法 血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )刺激人VSMC建立细胞增殖模型 ,置于 1mT和 5mT的恒磁场中培养 48h ,用四唑盐比色法和3H TdR参入法检测两组VSMC的增殖数量 ,流式细胞仪分析细胞周期。结果 恒磁场能逆转AngⅡ所致的人VSMC增殖数量增多 ,阻止VSMC由静止期 (G0 G1 期 )进入DNA合成期 (S期 )和有丝分裂期 (G2 M期 )。结论 平均磁感应强度为 1、5mT的恒磁场抑制VSMC增殖。

组织块贴壁法原代培养人脐血管平滑肌细胞的改良

目的提高人脐血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)体外培养的成功率。方法以传统的平滑肌细胞贴壁培养法为基础,选择人脐血管为材料,对培养基配置,组织块的大小和接种间距,培养液的pH等多个重要环节进行改进;采用倒置相差显微镜和α-actin免疫组化染色,对VSMCs进行鉴定。结果光镜下见培养细胞呈典型的"峰、谷"样结构特征;α-actin免疫组化染色显示98%的细胞含有肌动蛋白,证实为VSMCs。结论此培养方法能提高人脐血管平滑肌细胞体外培养的成功率,为心血管疾病发病机制的体外研究,提供了一种实用而充足的细胞材料。