咖啡因通过FAK/AKT/ROCK通路调控人脑胶质瘤U-373MG细胞的恶性生物学行为

目的:探讨咖啡因通过调节FAK/AKT/ROCK信号通路来影响人脑胶质瘤U-373MG细胞的增殖、迁移和侵袭能力。方法:常规培养U-373MG细胞,将其分为对照组、咖啡因低剂量(1 mmol/L)组、咖啡因高剂量(2 mmol/L)组、PF573228组(FAK抑制剂,1μmol/L)、咖啡因高剂量+SC79组(AKT激活剂,8mg/L)。用CCK-8法、Transwell小室实验、流式细胞术和WB法分别检测各组U-373MG细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡,以及U-373MG细胞中p-FAK、p-AKT、p-ROCK、Ki67、MMP-9蛋白表达水平。建立U-373MG细胞裸鼠移植瘤模型,观察咖啡因对移植瘤生长的影响,WB法检测移植瘤组织中相关蛋白的表达。结果:咖啡因、PF573228可显著抑制U-373MG细胞的增殖、迁移、侵袭能力,促进U-373MG细胞凋亡,抑制p-FAK、p-AKT、p-ROCK、Ki67、MMP-9蛋白的表达(均P<0.05),SC79则可部分逆转咖啡因对U-373MG细胞的作用(均P<0.05)。咖啡因可显著抑制移植瘤的生长及移植瘤组织中上述相关蛋白的表达(均P<0.05)。结论:咖啡因可通过抑制FAK/AKT/ROCK信号通路抑制U-373MG细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促进其凋亡。

表达VASH1基因的人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物敏感性的变化

目的探讨表达人血管生成抑制因子1(VASH1)的人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物的敏感性变化。方法构建针对VASH1的慢病毒载体p GCL-GFP-VASH1,经测序鉴定后转染293T细胞,筛选出适合浓度的慢病毒转染人脑胶质瘤U-87MG细胞,荧光显微镜下检测转染效率;通过RT-PCR和Western blot分析U-87MG细胞VASH1 m RNA和蛋白表达水平;用CCK-8法检测U-87MG细胞在化疗药物顺铂和替莫唑胺作用下的存活率。流式细胞仪检测U-87MG细胞凋亡。结果成功构建p GCL-GFP-VASH1慢病毒载体,并成功转染U-87MG细胞,转染率达70%以上;RT-PCR和Western blot结果证实转染VASH1慢病毒载体的U-87MG细胞表达VASH1 m RNA和蛋白。在顺铂或替莫唑胺作用下,表达VASH1的U-87MG细胞存活率均较未表达VASH1的U-87MG细胞明显降低(P<0.01),而且U-87MG细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论 VASH1慢病毒载体转染U-87MG细胞可使其稳定表达VASH1,并提高人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物敏感性、增加细胞凋亡率。

siRNA干扰ClC-2表达对人胶质瘤U-87细胞增殖的抑制作用

背景与目的:利用小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)抑制哺乳动物基因表达已成为研究基因功能的一种有效方法。本研究采用siRNA抑制人神经胶质瘤细胞系U-87细胞上容积调控氯通道ClC-2基因的表达,观察其受抑制后对细胞增殖能力的影响。方法:设计和构建两个针对人ClC-2基因的siRNA真核表达载体,并给予酶切鉴定和DNA序列分析鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000介导转染,将空载体质粒pSUPER.puro-shRNA和两个重组质粒pSUPER.puro-shRNA-ClC-21、pSUPER.puro-shRNA-ClC-22分别转染入U-87细胞(依次为PP0组、PP1组和PP2组);采用RT-PCR检测ClC-2mRNA表达变化;MTT分析检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期;平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果:目的片段成功地连接到真核细胞表达载体pSUPER.puro上。PP1组、PP2组与对照组、PP0组相比较,ClC-2基因的mRNA水平明显降低,细胞生长速度明显减慢,细胞周期进程被阻滞在G1期:细胞的G1期百分含量分别增加了约30.24%、18.04%(P<0.05)。平板克隆形成试验发现,克隆形成率PP1组[(11.0±1.0)%]、PP2组[(20±3.1)%]明显低于对照组[(46.5±1.6)%]和PP0组[(47.5±2.8)%](P<0.01)。结论:干扰人神经胶质瘤细胞系U-87细胞的ClC-2基因表达可以抑制细胞的增殖,提示ClC-2基因可能成为控制人恶性胶质瘤生长的新靶点。

Leptin促进人脑胶质瘤U87MG细胞的迁移和侵袭

目的:探讨瘦素(leptin)对人脑胶质瘤U87MG细胞迁移及侵袭能力的影响及其机制。方法:Leptin处理U87MG细胞,采用细胞划痕实验检测U87MG细胞的迁移能力,Transwell实验检测U87MG细胞的侵袭能力,RT-PCR及Western blot-ting法检测U87MG细胞中MMP-2及MMP-9 mRNA和蛋白的表达。结果:Leptin明显促进U87MG细胞迁移能力[(152.42±3.29)vs(83.24±2.61)μm,P<0.05]和侵袭能力[(31.78±5.04)vs(17.03±2.41)个细胞,P<0.05],leptin能显著上调U87MG细胞中MMP-2、MMP-9 mRNA[(0.76±0.04)vs(0.35±0.02),(0.84±0.02)vs(0.41±0.06);均P<0.05]及蛋白[(0.79±0.03)vs(0.23±0.01),(0.81±0.05)vs(0.39±0.03);均P<0.05]的表达。MMP抑制剂GM6001(10μmol/ml)可以逆转leptin对U87MG细胞迁移[(82.05±2.98)vs(81.76±3.25)μm,P>0.05]和侵袭能力[(19.23±2.46)vs(18.02±1.98)个细胞,P>0.05]的影响。结论:Leptin可以促进人脑胶质瘤U87MG细胞的侵袭及迁移,其机制可能与上调MMP-2、MMP-9的表达有关。

恶性脑胶质瘤U87细胞系肿瘤干细胞放疗敏感性的体外实验研究

目的探讨脑胶质瘤细胞系U87细胞及其肿瘤干细胞(CSCs)对体外放疗的敏感性。方法应用神经干细胞(NSCs)培养基分离培养形成细胞球克隆,检测细胞球细胞的NSCs特性。采用不同剂量放射线照射U87细胞及其CSCs,应用集落形成实验和生存曲线检测其生存情况。结果 U87细胞在NSCs培养基中形成悬浮的细胞球克隆,具有自我更新和多向分化能力,表达CD133、Nestin;两种细胞的存活率均随照射剂量增加而下降,且CSCs的存活率明显高于U87细胞(P<0.01)。结论在体外条件下,CSCs的放射敏感性明显低于U87细胞,其可能是恶性脑胶质瘤放疗抵抗的主要原因。

腺病毒介导IL-24基因诱导人脑胶质瘤U87MG细胞的凋亡

目的:研究腺病毒介导IL-24基因表达载体(Ad-IL-24)对人脑胶质瘤U87MG细胞的抑制作用,初步探讨其作用机制。方法:将本科室构建的Ad-IL-24感染U87MG细胞,RT-PCR法检测IL-24基因的表达,MTT法和流式细胞术检测U87MG细胞的生长和凋亡,激光共聚焦显微镜观察U87MG细胞凋亡的形态学变化,RT-PCR法检测Bax、Bcl-2基因mRNA的表达,Western blotting检测caspase-3的活化。结果:Ad-IL-24感染U87MG细胞后,IL-24在U87MG细胞中有明显表达,并抑制U87MG细胞生长、诱导其凋亡、出现典型的凋亡细胞核形态学改变。Ad-IL-24可上调U87MG细胞中Bax基因、下调Bcl-2基因的表达,并诱导caspase-3蛋白的活化。结论:Ad-IL-24可诱导U87MG细胞凋亡,其机制可能与上调Bax基因、下调Bcl-2基因表达,并活化caspase-3有关。

TIMP-2基因对人脑胶质瘤U87细胞周期与增殖的影响

目的 探讨金属蛋白酶组织抑制因子 (TIMP 2 )对人脑胶质瘤细胞的抑制作用 ,主要是对细胞周期与细胞增殖的作用。方法 用含TIMP 2基因的重组腺病毒载体 ,体外转染人胶质瘤细胞系U87,用Westernblot检测目的蛋白的表达。通过细胞生长实验 ,流式细胞仪分析技术检测U87转染前后细胞增殖、周期与凋亡的变化。结果 转染AdTIMP 2病毒后的U87细胞TIMP 2蛋白表达上调 ,转染后对U87细胞的生长有抑制作用 ,并出现明显的G0 G1期阻滞 ,但无明显的细胞凋亡峰出现。结论 重组腺病毒载体介导的TIMP 2基因在体外对人脑胶质瘤细胞系U87的生长有抑制作用 。

HCMV感染对恶性胶质瘤U87细胞迁移及侵袭能力的影响

研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对恶性神经胶质瘤U87细胞迁移及侵袭能力的影响。采用HCMV(MOI=5)感染神经胶质瘤U87细胞,Transwell体外迁移实验、Transwell体外侵袭实验检测HCMV感染对U87细胞迁移侵袭能力的影响;Western-blot检测肿瘤迁移、侵袭的标志性蛋白局部粘着斑激酶(FAK)及pTyr397FAK的表达变化。Transwell结果显示,HCMV感染U87细胞后迁移侵袭到小室膜下的细胞数量明显高于未感染组(P<0.05);Western-blot结果显示,HCMV感染组及对照组均出现FAK、pTyr397FAK蛋白的表达;HCMV感染组pTyr397FAK蛋白相对表达量高于对照组(P<0.05)。HCMV感染U87细胞通过促进FAK,Tyr397的磷酸化而促进胶质瘤U87细胞的迁移及侵袭。因此,抑制HCMV感染细胞后的FAK蛋白的磷酸化可以成为恶性胶质瘤预防及治疗的新靶点。

恶性胶质瘤U87细胞中miR-147启动子区甲基化程度对miR-147表达及细胞增殖的影响

目的探究恶性胶质瘤U87细胞中微小RNA-147(miR-147)启动子区甲基化程度与miR-147表达量及细胞增殖的关系。方法使用0μmol/L(空白组)、4μmol/L以及16μmol/L的5′aza-dC培养基培养U87细胞,通过亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP法)检测每组细胞中miR-147启动子区甲基化情况;使用QPCR法检测各组miR-147表达量,并对细胞进行计数,计算U87细胞受抑制程度。结果空白组甲基化率为14.6%,miR-147相对表达量为0.29±0.02;4μmol/L组甲基化率为8.9%,miR-147相对表达量为0.66±0.03,有19.4%的细胞受抑制;16μmol/L组甲基化率为3.4%,miR-147相对表达量为1.09±0.05,有51.6%的细胞受抑制。各组miR-147相对表达量比较,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论U87细胞中miR-147启动子区的甲基化程度改变可能是影响U87细胞中miR-147表达的因素之一,并且甲基化程度越低,U87细胞增殖受抑制越明显。

槐定碱抑制人胶质瘤U87MG细胞株增殖及其作用机制研究

目的探讨槐定碱抑制人胶质瘤U87恶性胶质瘤(U87MG)细胞株增殖作用及其相关机制。方法将各个浓度的槐定碱加入到人胶质瘤U87MG细胞株中,应用四唑氮盐比色法测定槐定碱对肿瘤细胞生长的抑制作用,流式细胞仪测定槐定碱对U87MG细胞凋亡和细胞周期的变化,生化检验测定肿瘤细胞内活性氧簇(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量,实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹法分别检测肿瘤相关基因mRNA表达和蛋白表达的变化,荧光素酶报告基因法检测肿瘤细胞中泛素-蛋白酶体、叉头盒蛋白M1(FoxM1)、核转录因子kappa B(NF-kb)、激活子蛋白-1(AP-1)的活性的变化。结果槐定碱能够显著抑制细胞增殖,阻滞细胞周期在G2/M期;诱导细胞凋亡,引起ROS产生和GSH含量减少;促使p27、周期蛋白依赖性激酶2、Survivin、Livin、B淋巴细胞瘤-2、E2启动子结合细胞因子1等基因表达下调,同时上调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/8、p53、线粒体来源的第2个半胱氨酸蛋白酶激活剂、c-Jun氨基末端激酶和p38-丝裂原活化蛋白激酶等基因的表达;显著抑制泛素-蛋白酶体活性和FoxM1、NF-kb、AP-1的转录活性。结论槐定碱可能通过诱导细胞凋亡和ROS积聚,激活线粒体信号通路来发挥抗肿瘤活性。槐定碱能够作为一种新的药物来治疗胶质瘤。

人脑胶质母细胞瘤细胞系U87的单克隆细胞构建及异质性研究

目的人胶质母细胞瘤细胞细胞系U87被作为胶质母细胞瘤(GBM)异质性研究的模型,但从基因水平探讨其异质性来源的研究较少。文章旨在构建人胶质母细胞瘤细胞系U87单克隆细胞株,检测不同单克隆细胞株的表型和遗传背景差异,并探讨产生表型差异的分子机制。方法利用小分子荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)作为筛选标记,有限稀释法构建U87单克隆细胞株,并挑选具有典型形态特征的2株单克隆化细胞,经短串联重复序列(STR)鉴定后进行后续研究。采用CCK-8、EdU掺入法增殖实验和和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;肿瘤干细胞成球实验检测细胞成球能力;免疫荧光和CCK-8法黏附实验检测细胞黏附能力;3D侵袭实验检测细胞侵袭能力;Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞对化疗药物的敏感性;转录组测序(RNA-seq)对细胞进行测序及生物信息学分析;qRT-PCR验证富集通路中代表性差异基因mRNA表达量。结果构建了形态较为均一U87单克隆细胞株CF5和G11。其中CF5小而短粗,G11大而细长。CCK-8增殖实验结果显示,CF5细胞增殖能力较U87、G11明显增强,U87较G11明显增强(P<0.001)。EdU掺入法增殖实验结果显示,CF5 EdU阳性细胞比例(0.54±0.05)较G11细胞(0.35±0.03)、U87(0.44±0.03)明显增加,U87较G11明显增强(P<0.01)。肿瘤干细胞成球实验显示,CF5干细胞成球能力较U87、G11明显增强,U87较G11明显增强(P<0.01)。免疫荧光法黏附实验显示,黏附1 h后G11黏附面积较U87、CF5明显增强,U87较CF5明显增强(P<0.001)。3D培养侵袭实验结果显示,G11细胞侵袭能力较U87、CF5明显增强,U87较CF5明显增强(P<0.05)。交互分析发现CF5相对G11和U87均下调的基因159个,均上调的基因303个;G11相对CF5和U87均下调的基因有281个,上调的基因则有116个;通路富集分析显示CF5和G11在细胞外基质相关的通路有最高的富集度,细胞外基质相关通路与肿瘤侵袭、耐药等功能表型密切相关。结论成功构建从形态、功能表型到基因背景具有显著差异的U87单克隆细胞株CF5、G11,为研究GBM异质性和基因功能奠定了基础。

替莫唑胺治疗难治性恶性人脑胶质瘤:11例体会

背景和目的:胶质细胞瘤是神经系统最常见的原发性肿瘤。目前,以手术、放疗和化疗相结合的综合治疗是处理恶性胶质瘤的主要手段。化疗的重要性日益明显,正逐渐成为提高患者生存期和改善生存质量的重要手段,而开发更有效的化疗新药则是实现这一目标的重要突破口之一。本文总结了我们用替莫唑胺治疗11例恶性顽固性胶质瘤患者的体会。方法:我科自2002年1月至2004年8月用替莫唑胺治疗了11例恶性难治性胶质瘤患者。每一疗程替莫唑胺的总剂量等分成5天服用,每4周重复。本组患者第一疗程总剂量为750 mg/m2,如在随后的22天内,患者未出现明显骨髓抑制等严重不良反应,可由第二疗程起,总剂量提高为1000mg/m2。所有患者至少接受两个疗程化疗。结果:化疗后进行脑MRI复查,比较MRI结果判断疗效:肿瘤体积明显缩小者2 例,部分缓解率为18.2%;肿瘤无进展时间超过12周者4例,疾病稳定率为36.4%;总显效率为54.5%。症状缓解 5例,症状缓解率为45.5%。替莫唑胺主要不良反应为:恶心、呕吐、脱发、疲倦和骨髓抑制等,程度较轻,未见重要脏器损害。结论:替莫唑胺对恶性难治性胶质瘤具有较好的临床效果,不良反应较少,是理想的化疗用药。

12-bpCpG ODN通过NO途径增强人脑胶质唐细胞U87放射增敏作用的研究

目的：探讨含12-bp的CpG寡脱氧核苷酸（CpGODN107，CpG107）（对脑胶质瘤细胞U87（WHOgradeIV）的放射增敏作用，并探讨其放射增敏机制。方法：本研究通过MTT法检测CpG107对U87细胞的放射增敏作用；

转铁蛋白结合镱跨膜转运及镱对U-87 MG细胞增殖的影响

目的 :研究转铁蛋白 /转铁蛋白受体转运系统对转铁蛋白结合镱 (Yb2 Tf)跨膜转运进入神经胶质瘤U- 87MG细胞 ,以及转铁蛋白结合镱和非转铁蛋白结合镱对U - 87MG细胞增殖的影响。方法 :细胞培养及ICP -MS镱测定法。结果 :随Yb2 Tf浓度增加 ,细胞镱摄入量增加。当浓度达 2 μmol/L时 ,细胞摄取镱基本达到饱和状态。细胞摄入镱量也随镱 :apoTf摩尔比增大而增加 ,当摩尔比达到 1.5时 ,摄入量达到最高水平。 0 .4 μmol/LYb2 Tf可显著抑制U - 87MG细胞增殖 ,而Yb3 +浓度高达 10 μmol对细胞增殖仅有轻微影响。 结论 :转铁蛋白 /转铁蛋白受体介导的膜转运可能是镱跨越U - 87MG细胞的机制之一。转铁蛋白结合Yb3 +可以有效地抑制U - 87MG细胞的增殖。

MMPs与EMMPRIN在人脑胶质瘤侵袭性生长中研究的进展

胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤,约占颅内肿瘤的40% ～50%左右,治愈率低,预后较差.虽然基因治疗,靶向免疫治疗以及肿瘤干细胞等先进技术在临床取了较大进展,但远期疗效仍未取得突破[1].

下调ATF5基因表达对神经胶质瘤细胞增殖及巨细胞病毒复制的影响

采用慢病毒介导的小RNA干扰技术,靶向干扰神经胶质瘤U87细胞中ATF5基因的表达,构建ATF5基因下调稳定表达的细胞株,并用Real-time PCR检测ATF5基因的下调表达效率。CCK8实验检测下调ATF5基因表达后对U87细胞增殖的影响;Semi-quantitative RT-PCR及Western-blot分别在mRNA、蛋白水平上检测下调ATF5的表达后对感染的HCMV复制的影响。研究结果显示,下调ATF5基因的表达可以抑制U87细胞的增殖,并且可以分别在mRNA、蛋白水平上抑制HCMV的复制。抑制U87细胞的增殖可以减慢神经胶质瘤的增长速度,抑制HCMV的复制可以减慢或者阻止神经胶质瘤恶性转化过程。由此可以推断出,下调ATF5基因的表达不仅可以直接抑制神经胶质瘤细胞的生长,还可以间接的抑制神经胶质瘤的发生发展。因此,下调ATF5的表达可能成为治疗神经胶质瘤的新的方法。

胶质瘤促血管生成素2基因表达的临床意义(附52例分析)

目的 探讨胶质瘤促血管生成素2 (Ang2) 基因在脑胶质瘤的表达及其临床意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT PCR) 和链酶亲和素过氧化物酶复合物SABC法检测52例人脑胶质瘤和8例正常脑组织中Ang2基因表达。结果 50 例脑胶质瘤和8 例正常脑组织均可表达Ang2 mRNA片段。高恶度胶质瘤Ang2 mRNA及蛋白表达显著高于低恶度胶质瘤(P<0 01); 低恶度胶质瘤Ang2 mRNA及蛋白表达显著高于正常脑组织(P<0 05)。免疫组化染色显示, Ang2蛋白主要分布在高恶度胶质瘤组织的瘤细胞和内皮细胞, 低恶度胶质瘤呈低水平表达, 正常脑组织不表达。结论 Ang2的表达与胶质瘤的分级密切相关, 可能对胶质瘤的恶性演进起促进作用。

siRNA干扰半乳凝集素-3对恶性胶质瘤细胞株U87MG细胞凋亡及增殖的影响

目的研究抑制半乳凝集素-3(Gal3)的表达对恶性胶质瘤细胞株U87MG细胞凋亡及增殖的影响。方法构建Gal3siRNA表达载体,转染U87MG细胞,并筛选出单克隆细胞株U87MG/Gal3 RNAi;用RT-PCR方法检测该稳定细胞株中Gal3的mRNA表达,用Western blot检测其蛋白表达;通过流式细胞技术和MTT法检测Gal3对肿瘤细胞凋亡及增殖的影响。结果 U87MG野生型细胞株、U87MG/空载体稳定细胞株和U87MG/Gal3 RNAi稳定细胞株的Gal3 mRNA表达值分别为1.28±0.0431,1.31±0.0278和0.38±0.0506;Gal3蛋白表达值分别为0.56±0.0479,0.54±0.0351和0.12±0.0418,U87MG/Gal3 RNAi稳定细胞株的Gal3 mRNA及蛋白表达显著低于对照组细胞(P<0.05);三种细胞株对凋亡诱导剂CDDP所诱导的细胞凋亡率分别为(30.83±0.13)%、(30.82±0.159)%和(54.56±0.12)%,U87MG/Gal3 RNAi稳定细胞株凋亡率显著高于对照组细胞(P<0.05);U87MG/Gal3 RNAi稳定细胞株细胞增殖率在不同时间点均显著低于对照组细胞(P<0.05)。结论抑制Gal3基因的表达能够促进该肿瘤细胞的凋亡,并抑制细胞的增殖。Gal3可以成为治疗恶性胶质瘤的有效的靶基因。