沉默线粒体分裂蛋白1基因对氟致人脑神经母细胞瘤细胞株线粒体融合蛋白和膜电位损伤的影响

目的 研究沉默线粒体分裂蛋白1（Fis1）对人脑神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y细胞）Fis1、线粒体融合蛋白1（Mfn1）及线粒体膜电位水平的影响，并进一步探讨线粒体融合分裂在慢性氟中毒发病机制中的作用。方法 体外培养SH-SY5Y细胞，待细胞贴壁生长进入对数增长期时进行实验，采用成组设计将细胞分为未染氟空白对照组、染氟组［2 mmol／L氟化钠（NaF）］、染氟阴性对照组［2 mmol／L NaF ＋ 非特异性小干扰RNA（siRNA）］、沉默组（2 mmol／L NaF ＋ siRNA-Fis1）。蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞中Fis1和Mfn1蛋白表达水平；实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测Fis1和Mfn1 mRNA表达水平；线粒体膜电位检测试剂盒检测细胞线粒体膜电位水平。结果 与空白对照组（1.37 ± 0.18、1.00 ± 0.04，1.57 ± 0.19、1.00 ± 0.04，1.00 ± 0.10）比较，染氟组Fis1蛋白（1.72 ± 0.04）及mRNA表达水平（1.48 ± 0.13）均升高，Mfn1蛋白（0.87 ± 0.02）及mRNA表达水平（0.69 ± 0.07）均降低，线粒体膜电位水平（0.76 ± 0.13）降低（P均 〈 0.05）。与空白对照组比较，沉默组Fis1蛋白（0.79 ± 0.07）及mRNA表达水平（0.06 ± 0.03）均降低，Mfn1蛋白（1.71 ± 0.04）及mRNA表达水平（1.52 ± 0.05）均升高（P均 〈 0.05），线粒体膜电位水平（0.94 ± 0.01）有降低趋势。与染氟组比较，沉默组Fis1蛋白及mRNA表达水平均降低，Mfn1蛋白及mRNA表达水平均升高，线粒体膜电位水平升高（P均 〈 0.05）。结论 人工抑制Fis1基因表达水平可降低氟致SH-SY5Y细胞的线粒体分裂和线粒体膜电位损伤。

氟对人脑神经母细胞瘤细胞株体外培养细胞活性氧水平及线粒体融合的影响

目的分析研究氟对人脑神经母细胞瘤细胞株体外培养细胞活性氧水平及线粒体融合的影响。方法将0.4mmol/L及4.0mmol/L的氟化钠注入人脑神经母细胞瘤细胞株体外培养细胞中,对照组中仅注入双蒸水,作用时间为0.25d、0.5d、1.0d、2.0d,通过细胞内氧化应激活性氧高质荧光测定试剂盒和活体细胞线粒体形态荧光染色试剂盒Mito Tracher RED对氧自由基和线粒体进行染色处理,对比经不同浓度氟化钠处理的人脑神经母细胞瘤细胞株体外培养细胞中活性氧水平及Ⅱ型线粒体形态与对照组的差异和尿氟含量变化情况。结果染氟人脑神经母细胞瘤细胞株体外培养细胞中活性氧荧光出现染色异常,并且随染氟时间的增加,氟离子浓度越高,活性氧水平上升幅度越大,人脑神经母细胞瘤细胞株体外培养细胞活性氧水平和染氟时间及氟离子浓度呈正相关关系,三组活性氧水平对比差异均有统计学意义(P<0.05);对照组人脑神经母细胞瘤细胞株体外培养细胞中线粒体融合分裂功能基本正常;经不同浓度氟化钠处理的人脑神经母细胞瘤细胞株体外培养细胞线粒体均分裂亢进,并且随着处理时间的增加及氟离子浓度的增加,人脑神经母细胞瘤细胞株体外培养细胞线粒体分裂程度不断增强;随着处理时间的增加及氟离子浓度的增加,尿氟含量呈持续上升趋势,三组尿氟含量对比差异有统计学意义(P<0.05),4.0mmol/L氟化钠组尿氟含量与0.4mmol/L氟化钠组对比差异有统计学意义(P<0.05)。结论摄取氟量过高时,会导致人脑神经母细胞瘤细胞株细胞氧自由基水平异常增高,使其线粒体呈分裂状,并且随剂量和时间的增加而加重。

DHRS4基因簇缺失型神经母细胞瘤细胞株的克隆和鉴定

目的单克隆培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y-细胞株,并鉴定其在基因水平缺失DHRS4基因簇,包括DHRS4、DHRS4L2和DHRS4L1的基因序列。方法有限稀释法培养实验室偶得的低表达DHRS4基因的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,相差显微镜观察细胞的生长和增殖,PCR、RT-PCR检测DHRS4、DHRS4L2和DHRS4L1基因的DNA和RNA含量,Westernblotting检测DHRS4蛋白的表达。结果筛选得到单克隆神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,在DNA、RNA和蛋白水平均未检测到DHRS4基因簇的DNA序列及表达产物。结论经过克隆低表达DHRS4基因簇的SH-SY5Y细胞,得到纯系的DHRS4基因簇缺失的SH-SY5Y-细胞株,该细胞对于进一步研究DHRS4基因簇的功能和表达调控都是难得的细胞模型。

儿童大脑神经母细胞瘤MRI诊断分析

目的探讨儿童大脑神经母细胞瘤MRI的影像特点。方法对经手术及病理证实的3例儿童幕上大脑神经母细胞瘤患者的MRI资料进行回顾性分析。本组3例患儿均行颅脑MRI常规平扫加增强扫描。结果 3例患儿肿瘤均位于幕上,包括额叶1例,顶叶2例。病灶呈类圆形或分叶状,边界清楚。T1WI呈不均匀稍低或低信号,T2WI呈稍高或高信号。2例见大囊变合并出血,瘤周见轻度水肿。增强扫描3例均见明显强化。结论儿童大脑神经母细胞瘤MRI表现具有一定的特点,根据肿瘤部位、边界、信号、水肿、增强特点有助于该病的诊断和鉴别诊断。

1-甲基-4-苯基吡啶离子对人神经母细胞瘤细胞株哺乳动物雷帕霉素靶位信号通路的影响

目的研究1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)对人骨髓神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞哺乳动物雷帕霉素靶位(mTOR)信号通路相关蛋白表达的影响。方法体外培养的SH-SY5Y细胞分为正常对照组、MPP+0.25 mmol/L组、0.5 mmol/L组及1 mmol/L组,各MPP+组细胞与含相应浓度的MPP+培养24 h。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞相对存活率;应用免疫印迹法检测各组细胞中mTOR蛋白、核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)、mTOR调控相关蛋白(Raptor)、雷帕霉素不敏感的mTOR伴侣蛋白(Rictor)以及与自噬相关的微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ)、Beclin1蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,各MPP+组细胞相对存活率显著降低(P<0.05～0.001);mTOR、p70S6K、Raptor、Rictor表达明显降低(P<0.05～0.001);LC3Ⅱ和Beclin1表达显著升高(P<0.05～0.001),均呈现出明显的量效关系。结论 MPP+通过抑制细胞中mTOR信号通路,诱导SH-SY5Y细胞自噬性死亡,并且与MPP+的浓度相关;这可能是MPP+导致PD动物模型发病的机制。

苦参碱抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞增殖及MYCN基因mRNA的表达

目的神经母细胞瘤是4岁以下儿童最常见的恶性实体肿瘤,MYCN基因的高表达导致预后更加恶劣。苦参碱作为中药苦参的重要成分对多种肿瘤有治疗作用,该实验拟应用苦参碱作用神经母细胞瘤细胞(LA-N-5),对肿瘤细胞增殖及MYCN基因mRNA表达受抑制情况进行初步研究,希望可以为神经母细胞瘤的治疗开拓新的思路。方法以终浓度为0.25mg/mL,0.50mg/mL,0.75mg/mL,1.00mg/mL苦参碱作用神经母细胞瘤LA-N-5细胞,MTT法检测LA-N-5细胞增殖情况变化,采用SYBR绿色荧光染料Ⅰ的实时荧光定量RT-PCR检测MYCN基因mRNA表达受抑制情况。结果苦参碱对LA-N-5细胞增殖的抑制呈明显的剂量、时间依赖性,随剂量的增加,作用时间的延长,抑制效果逐渐加强。1.00mg/mL作用72h后肿瘤细胞增殖抑制效率达36.3%,单细胞MYCN基因mRNA表达9.7±0.35拷贝,抑制效率达44.6%。结论应用苦参碱在体外环境作用LA-N-5细胞,可以有效抑制该细胞的增殖、原癌基因MYCN mRNA的表达,为临床上神经母细胞瘤的治疗开拓了新的思路。

阻断TrkB-BDNF信号传导通路对神经母细胞瘤细胞生长及凋亡的影响

目的脑源性神经生长因子(BDNF)和其酪氨酸激酶受体B(TrkB)与神经母细胞瘤(NB)细胞的化疗耐药及恶性预后密切相关。该研究探讨阻断TrkB-BDNF信号传导通路后,NB细胞对化疗药物敏感性的变化。方法常规培养SH-SY5Y NB细胞,用nM浓度全反式维甲酸(ATRA)诱导TrkB高表达,加入BDNF、化疗药顺铂(CDDP)和特异性酪氨酸酶抑制剂K252a处理。MTT实验方法检测应用K252a前后细胞的存活率的变化;同时应用Western-blot方法检测应用K252a前后TrkB的磷酸化水平的变化;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率;透射电镜(TEM)观察凋亡细胞的形态与结构。结果ATRA+BDNF+CDDP组细胞的存活率及凋亡率与对照组相比,差异无显著性(P>0.05)。而经K252a处理后,细胞对顺铂的敏感性增加,细胞的存活率明显降低,凋亡率明显升高,差异有显著意义。Western-blot分析显示K252a能够阻断TrkB的磷酸化。结论阻断TrkB-BDNF信号传导通路可提高NB的化疗敏感性,逆转耐药。

Caspase-3和Caspase-8在氟化钠致人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡中的作用

目的探讨半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族中的Caspase-3和Caspase-8对氟化钠(NaF)致人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的影响。方法先用不同浓度NaF(20、40、80μg/ml)对SH-SY5Y细胞进行染毒,24h后检测细胞存活率、凋亡率、Caspase-3活性以及Caspase-3和Caspase-8 mRNA表达水平;再选择适宜的40μg/mlNaF染毒剂量组,观察在Fas受体激动剂CH11或拮抗剂ZB4作用下其细胞凋亡率、Caspase-3活性及Caspase-3和Caspase-8 mRNA表达水平的改变。结果与对照组比较,40、80μg/ml染毒组细胞存活率降低,差异有统计学意义(P<0.01);细胞凋亡率随染毒剂量的升高呈上升趋势,且40、80μg/ml染毒组细胞凋亡率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);40、80μg/ml染毒组Caspase-3活性及Caspase-3和Caspase-8 mRNA表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);激动剂CH11与NaF共培养对细胞凋亡显示出协同效应,拮抗剂ZB4可部分阻断NaF致SH-SY5Y细胞的凋亡。结论NaF可通过上调死亡受体Fas途径的关键酶Caspase-3和Caspase-8的表达,促进SH-SY5Y细胞凋亡。

稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株构建

目的构建稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株,为进一步探讨Drp1基因在帕金森病(PD)发病过程中的作用提供细胞模型。方法于GenBank中检索人Drp1基因的核苷酸序列,设计并筛选最佳动力学参数的干扰序列及阴性对照序列;根据靶序列分别设计并合成干扰RNA(siRNA)的单链DNA寡核苷酸(DNAoligo),与退火缓冲液反应后形成带黏性末端的双链DNAoligo片段。分别用AgeⅠ与EcoRⅠ双酶切双链DNAoligo片段和GV248慢病毒骨架质粒后,加入T4DNA连接酶连接,得到重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi加入到大肠杆菌TOP10感受态细胞中反应后,分别提取质粒DNA并进行DNA测序。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒转染至293T细胞中,培养48h后收集上清液,离心后过滤得到Drp1-RNAi重组慢病毒和阴性对照慢病毒。将人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y分为Drp1-RNAi重组慢病毒组(D组,用Drp1-RNAi重组慢病毒感染)、阴性对照组(N组,用阴性对照慢病毒感染)、正常对照组(C组,正常培养),采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Drp1mRNA,采用Westernblotting法检测各组细胞Drp1蛋白。结果重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi的DNA序列与设计的干扰序列完全一致。D组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为0.47±0.12和0.40±0.04,N组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为1.12±0.33和0.67±0.05,C组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为1.02±0.23和0.72±0.02;D组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量与N组、C组相比,P均<0.05;N组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量与C组相比,P均>0.05。结论成功构建了稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒,并建立、筛选出了稳定干扰Drp1基因的神经母细胞瘤细胞株,进一步探讨Drp1基因在PD发病过程中的作用提供细胞模型。

LAK细胞体外未能杀伤视网膜母细胞瘤细胞株

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)是儿童眼内最常见的恶性肿瘤,起源于多分化潜能的原始视网膜干细胞,可向神经元及光感受器、胶质细胞和视网膜色素上皮细胞分化。本研究用 Rb 瘤细胞株作为靶细胞,体外观察淋巴因子活化性杀伤细胞(Jymphokin activated killer cells,LAK)对 Rb 细胞的杀伤活性,发现 LAK 细胞未能杀伤培养的 Rb瘤细胞株,结果报告如下。

汉防己甲素诱导神经母细胞瘤株TGW凋亡作用的实验研究

目的为评价汉防己甲素（TET）应用于神经母细胞瘤的可能性，应用TET处理人神经母细胞瘤株TGW，观察其作用情况。方法采用MTT比色法观察TET对神经母细胞瘤增生的影响，琼脂凝胶电泳法观察DNA片断化的梯形条带，流式细胞仪观察TET对神经母细胞瘤凋亡水平影响，实时定量PCR法了解Bcl-2家族（Bcl-2，Bcl-XL，Bad，Bax）表达的变化。结果25～0．5μM TET能明显抑制TGW细胞，25μM汉防己甲素作用48h最大抑制率为（95．32±2．46）％；琼脂糖凝胶电泳法观察到25肛MTET处理12、24、36、48h后出现典型的凋亡表现；流式细胞仪Annexin及PI双染发现25pMTET孵育24h肿瘤细胞的凋亡率明显上升；实时定量PCR发现25肛MTET处理24h后Bax基因表达明显增加。结论汉防己甲素能诱导人神经母细胞瘤株TGW凋亡，上调Bax基因的表达。

稳定低表达BAG3的胶质母细胞瘤U87细胞株的构建及鉴定

目的探讨构建稳定低表达BAG3的胶质母细胞瘤U87细胞株的方法。方法利用RNA干扰技术提取pEGFP-BAG3-sh RNA质粒后采用ABI3130基因测序仪进行测序鉴定,将鉴定后的质粒分别转染到胶质母细胞瘤U87细胞株,利用嘌呤霉素筛选转染的U87细胞,通过RT-PCR、免疫印迹分析和免疫荧光染色等技术对转染后的U87细胞进行鉴定。结果 pEGFP-BAG3-shRNA质粒测序结果包含干扰序列,筛选后的干扰组和对照组U87细胞转染效率分别为85%和93%,RT-PCR结果显示sh BAG3质粒干扰组BAG3 mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05);免疫印迹分析及免疫荧光染色结果显示shBAG3质粒干扰组BAG3蛋白表达量显著低于对照组(P<0.05)。结论本研究所构建的胶质母细胞瘤U87细胞株能稳定低表达BAG3,可用于后续BAG3在胶质母细胞瘤中的生物学作用及相关信号通路的研究。

不同能量的培养条件对人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞生长的影响

目的建立热量限制的体外模型,观察不同能量培养条件下对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞生长代谢的影响。方法将人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞分别采用含有低浓度(2 g/L)、正常浓度(3.15g/L)或高浓度(4.5 g/L)葡萄糖的培养基进行常规传代培养,利用MTT代谢率、细胞生长曲线及LDH漏出率等指标观察各组细胞生长情况。结果与正常葡萄糖浓度培养条件下培养的对照组相比,高糖组细胞突起缩短,细胞胞体皱缩,MTT代谢率稍低(0.573±0.001),LDH漏出率高,细胞生长状态差;与对照组相比,低糖组细胞突起伸展,MTT代谢率较低(0.428±0.003),LDH漏出率低,细胞生长速度缓慢,但是形态良好。结论高糖培养对细胞有损伤作用,细胞代谢加速,更容易衰老死亡;而低糖培养起到保护作用,在热量限制允许范围内降低培养液的含糖量,不但不会对细胞造成损伤,反而对细胞的代谢及生长起到保护作用,延长细胞的总体寿命。

N端截短的视网膜母细胞瘤基因对人骨肉瘤细胞株SaOS-2生长的影响

目的 研究N端截短的视网膜母细胞瘤基因(Rb^(66))对骨肉瘤细胞Saos-2生长的影响。方法 构建携带Rb^(66)cDNA片段的真核细胞表达载体pcDNA3-1-Rb,用脂质体LIPOFECTAMIME^(TM)2000将真核表达载体pcDNA3-1-Rb、空载体对照pcDNA3-1转染至SaOS-2细胞中。RT-PCR及免疫细胞化学检测转染后SaOS-2中Rb^(66)mRNA及蛋白的表达;观察细胞形态的改变;测定细胞倍增时间及生长曲线的改变;流式细胞仪检测对细胞周期的影响。结果 成功地将N端截短的Rb^(66)cDNA导入骨肉瘤细胞SaOS-2中,并在mRNA及蛋白水平获得了表达。转染后的SaOS-2细胞胞浆展开,细胞核浆比例变小;Rb^(66)导入后,SaOS-2细胞生长减慢,群体倍增时间延长,细胞周期呈现G_1期阻滞。结论 Rb^(66)可通过阻止细胞G_1→S期进展而抑制骨肉瘤细胞SaOS-2的增殖。

视网膜母细胞瘤Rb50细胞株VEGFR-3表达的研究

目的:研究视网膜母细胞瘤细胞株VEGFR-3的表达,探讨视网膜母细胞瘤自身增殖的机制。方法:选择Rb50细胞株,通过S-P免疫组化法、RT-PCR法及PCR产物琼脂糖凝胶电泳等方法,研究Rb50细胞株VEGFR-3的表达情况。结果:S-P免疫组化法呈阳性结果,表明Rb50细胞株有VEGFR-3的表达,RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳表明Rb50细胞株有较高水平VEGFR-3 mRNA的存在。结论:视网膜母细胞瘤细胞株有VEGFR-3的表达,表明VEGFR信息通路对视网膜母细胞瘤生长、浸润的影响,除了与促进肿瘤血管及淋巴管新生,改善肿瘤组织微环境相关外,还与促进肿瘤细胞自身增殖有关。

α2β1整合素对神经母细胞瘤细胞侵袭迁移的影响

目的近年来研究表明细胞间黏附分子整合素的变化与肿瘤细胞的侵袭迁移之间有着重要的联系,该研究进一步深入探讨α2β1整合素对神经母细胞瘤细胞侵袭和迁移能力的影响,为预防神经母细胞瘤细胞的转移和辅助治疗提供理论依据。方法采用细胞倾斜实验、聚碳酸酯膜侵袭试验观察神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株细胞在整合素α2单克隆抗体(anti-α2)和β1单克隆抗体(anti-β1)作用下,瘤细胞迁移、侵袭能力的变化。迁移或侵袭的细胞通过姬姆萨染色,200倍显微镜下计数,计算不同条件下细胞迁移或侵袭抑制率。结果anti-α2和anti-β1阻断组细胞的迁移能力较对照组98.1±7.4明显降低,分别为50.9±10.5和54.3±9.0(P<0.01),抑制率分别为48.1%和44.5%。anti-α2和anti-β1阻断组细胞的侵袭能力较对照组41.5±4.8明显减弱,分别为25.3±4.4和18.8±3.9(P<0.01),抑制率分别为39.0%和54.7%;结论α2β1整合素在神经母细胞瘤细胞迁移侵袭过程中起着促进作用。

塞卡病毒的NS2B蛋白通过CITED2调控人神经母细胞瘤细胞SK-N-BE的凋亡

目的探讨塞卡病毒(ZIKV)的NS2B蛋白通过CITED2调控对人神经母细胞瘤细胞SK-N-BE凋亡的调控机制。方法在人神经母细胞瘤细胞SK-N-BE中,ZIKV感染后过表达NS2B,通过Annex-V染色检测细胞凋亡情况。通过免疫共沉淀检测NS2B蛋白与CITED2的相互作用、CITED2蛋白与MDM2的相互作用,以及NS2B对P53和MDM2相互作用的影响。通过核蛋白抽取检测NS2B对P53的核定位的影响。结果 ZIKV能够引起人神经母细胞瘤细胞SK-N-BE的凋亡,且NS2B蛋白促进SK-N-BE的凋亡;CITED2蛋白与ZIKV的NS2B蛋白存在相互作用;CITED2蛋白与MDM2蛋白存在相互作用;ZIKV的NS2B蛋白抑制MDM2与P53的相互作用;ZIKV的NS2B蛋白促进P53入核。结论 ZIKV的NS2B蛋白通过与CITED2相互作用,抑制了MDM2对P53在细胞浆中的定位,促进了P53的入核,引起了人神经母细胞瘤细胞SK-N-BE的凋亡。

视网膜母细胞瘤SO-Rb_(70)细胞系的建立及液氮冻存和复苏

目的:建立新的人视网膜母细胞瘤细胞株,对其进行冻存和复苏,为临床、科研提供Rb细胞库。方法:用精确优化的取材,不经离心,直接通过洗涤吹打细胞后接种,并根据慢冻速融的细胞冻存原则,定期收集建株的Rb_(70)细胞作液氮冻存及复苏。结果:成功建立SO-Rb_(70)细胞株,共冻存8批细胞,进行了6次复苏实验,4次获成功。结论:经液氮冻存的人Rb_(70)细胞,复苏后生长良好,保持了细胞原有的生物活性及细胞特征,为Rb的深入研究提供了丰富的实验研究材料。眼科学报1998;14:80—82。

视网膜母细胞瘤中癌基因和抗癌基因研究进展

随分子生物学研究的发展,对视网膜母细胞瘤发生机理的研究也取得了巨大的进步。一些癌基因如N-myc、C-myc、Bcl-2基因,抗癌基因如Rb基因、P53基因及P16基因均已证明与视网膜母细胞瘤的发生密切相关。本文就这些癌基因与抗癌基因在视网膜母细胞瘤中的研究方法及临床意义作一综述。