CpG ODN107增强人脑胶质瘤细胞放射敏感性的研究

目的探讨CpG ODN107增加人脑胶质瘤细胞(CHG-5)放射敏感性的作用及可能机制。方法用不同浓度CpG ODN107处理CHG-5细胞,然后经放射线照射,MTT法检测细胞的增殖情况,体外培养集落形成率与细胞划痕法观察细胞的集落形成和迁移能力,ELISA法检测细胞TNF-α的分泌水平。结果CpG ODN107抑制CHG-5细胞的增殖,并呈量效关系。CpG ODN107(10μg/mL)联合放射线照射,抑制CHG-5细胞的增殖作用最强(0.52±0.76)。CpG ODN107(10μg/mL)同样能抑制CHG-5细胞增殖和迁移,并且增加了TNF-α的分泌,在联合照射后作用更加显著(193±0.58)pg/mL。结论CpG ODN107对CHG-5有明显的放射增敏作用,其机制可能与CpG ODN107增强肿瘤细胞TNF-α的分泌有关。

共刺激分子4-1BBL和B7-1在人脑胶质瘤细胞中的表达

背景与目的:4-1BBL和B7-1为诱导和维持T细胞活化提供了重要的共刺激信号,目前被认为是提高抗肿瘤免疫的治疗靶点。本研究探讨4-BBL和B7-1在7株胶质瘤细胞系表面的表达情况。方法:用流式细胞仪检测7株胶质瘤细胞株表面的共刺激分子4-1BBL和B7-1的表达,同时用MTT法分析胶质瘤细胞系对抗癌药物长春新碱(VCR)敏感性,并分析4-1BBL的表达与耐药性的相关性。结果:发现在所检测的胶质瘤细胞表面有不同程度的表达4-1BBL,但均不表达B7-1。其中T98G和MGR1细胞表面的4-1BBL表达>30%,对VCR不敏感,UW28、SKMG1、MGR2、SF767、SKMG4细胞表面的4-1BBL表达<10%,对VCR敏感。结论:本研究所检测的胶质瘤细胞均不表达共刺激分子B7-1,但有不同程度的表达4-1BBL,并且4-1BBL高表达的胶质瘤细胞对长春新碱敏感性差。

亲细胞非均质分子脂质对人脑胶质瘤细胞系的抑制作用

目的 :研究不同浓度亲细胞非均质分子脂质 (CHML)对人脑胶质瘤细胞的抑制作用。方法 :将指数生长期的SHG 4 4胶质瘤细胞分 6组 ,在 1～ 5组分别加入浓度为 5 0 0、2 0 0、10 0、5 0、2 0 μg/ml的CHML 6 .0和CHML 6 1复合液 ,第 6组加培养液作对照。于 2 4、48、72小时进行MTT检测 ,测定A值。结果 :各药物组与对照组的A值之间差别均有极显著的意义 ,其中两两比较检验表明 5 0 0 μg/ml、2 0 0 μg/ml组的A值与其他组比较差异有显著性。结论 :CHML对人脑胶质瘤细胞有显著抑制作用 ,并有一定剂量 效应关系 ,尤其是 5 0 0 μg/ml、2 0 0 μg/ml的药物组作用更为突出。

CRISPR/Cas9敲除pyk2基因对人脑胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

为了探讨富含脯氨酸的酪氨酸激酶(proline rich tyrosine kinase2,Pyk2)对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响,设计了2对以pyk2为靶基因的sgRNA片段,以px335质粒为载体,构建CRISPR/Cas9重组质粒,转染至人脑胶质瘤U251细胞中,同时设置野生型U251细胞作为对照组。通过酶切鉴定及Western blot分析筛选阳性单克隆细胞,并测序揭示突变位点。筛选出的阳性单克隆细胞作为实验组,经RTCA法比较后,发现实验组细胞的增殖能力较对照组明显下降,且具有统计学意义(P<0.05);Transwell小室法及划痕实验的结果均证实,较对照组,实验组细胞的体外侵袭及迁移能力受到明显的抑制,差异显著(P<0.05)。作为验证侵袭能力的代表,基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP9)在Western blot实验中表达量较对照组也明显下降。通过上述方法成功得到目的基因敲除的稳定细胞株,并证实敲除pyk2基因能明显的抑制人脑胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力。

不同浓度七氟醚对人脑胶质瘤细胞U251替莫唑胺抵抗的影响及机制初探

目的探究不同浓度七氟醚对人脑胶质瘤细胞U251替莫唑胺(TMZ)抵抗的影响,并探讨其可能的作用机制。方法培养对数生长期的人脑胶质瘤细胞U251,传代后将细胞分为3组:对照组、低七氟醚组及高七氟醚组。对照组在5%CO_2气体条件下培养,低七氟醚组在5%CO_2+1%七氟醚气体条件下培养,高七氟醚组在5%CO_2+2.5%七氟醚气体条件下培养,总气流量为2 L/min。MTT法检测3组细胞TMZ半抑制浓度(IC_(50))的变化,荧光定量链式聚合酶反应(qPCR)检测细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA表达水平的变化,蛋白免疫印迹(Western blotting)检测HIF-1α蛋白表达水平的变化。结果 MTT结果显示对照组细胞TMZ IC_(50)值显著高于高七氟醚组IC_(50)值(P<0.05),而与低七氟醚组IC_(50)值差异无统计学意义(P>0.05)。qPCR结果显示对照组HIF-1αmRNA相对表达水平显著高于低七氟醚组及高七氟醚组(P<0.05),且低七氟醚组HIF-1αmRNA相对表达水平显著高于高七氟醚组(P<0.05),Western blotting结果显示对照组HIF-1α蛋白表达水平明显高于低七氟醚组及高七氟醚组,且低七氟醚组HIF-1α蛋白表达水平明显高于高七氟醚组。结论七氟醚促进人脑胶质瘤细胞U251对TMZ的敏感性,可能与下调HIF-1α有关。

替莫唑胺对人脑胶质瘤细胞U251增殖、凋亡的影响及其机制探讨

目的观察替莫唑胺对人脑胶质瘤细胞U251增殖、凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法取对数生长期U251细胞,分别加入0.02、0.06、0.1 g/L替莫唑胺,空白对照组不加替莫唑胺,分别培养24、48、72 h,MTT实验观察细胞增殖情况;取对数生长期U251细胞,加入0.06 g/L替莫唑胺(0.06 g/L替莫唑胺组),细胞培养48 h后,用流式细胞技术测算细胞凋亡率,RT-PCR法、Western blotting法检测存活素(Survivin)mRNA、蛋白。结果随着替莫唑胺浓度增加及作用时间延长,U251细胞增殖抑制率越高。0.06 g/L替莫唑胺组细胞凋亡率为22.6%±2.3%,对照组为3.3%±1.1%,两组比较,P<0.05;0.06 g/L替莫唑胺组Survivin mRNA相对表达量为0.65±0.11,对照组为0.96±0.15,两组比较,P<0.05;0.06 g/L替莫唑胺组Survivin蛋白相对表达量为0.25±0.03,对照组为0.49±0.04,两组比较,P<0.05。结论替莫唑胺能有效抑制U251细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制Survivin表达有关。

替莫唑胺联合分子靶向药物抗人脑胶质瘤细胞的体外试验研究

现今化疗药物种类繁多，但有效率均不理想，本实验应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）法比较替莫唑胺（TMZ）联合分子靶向药物西妥昔单抗（C225）对人脑胶质瘤细胞的抑制作用，旨在探索一种有效、新型的化疗方案。

芹菜素对人脑胶质瘤细胞凋亡作用的研究

本文主要研究芹菜素对人脑胶质瘤细胞U87凋亡的影响及机制。方法:应用CCK8法检测细胞增殖抑制率。流式细胞术检测细胞周期。Western-blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达。结果:(1)芹菜素能抑制胶质瘤细胞U87的增殖。(2)不同浓度的芹菜素作用24h,G2期细胞所占比例呈下降趋势。(3)芹菜素处理组的细胞,Bcl-2蛋白的表达量随着芹菜素浓度的增加而降低,Bax蛋白的表达量则随芹菜素浓度的增加而升高。

蛋白酶体抑制剂MG-132通过JNK信号通路对人脑胶质瘤细胞SHG-44内质网应激相关机制的探讨

目的探讨MG-132通过内质网应激途径在诱导人脑胶质瘤细胞SHG-44凋亡中的作用。选择内质网应激凋亡信号转导通路JNK,使用JNK特异阻断剂SP600125,观察MG-132通过JNK信号通路诱导胶质瘤细胞凋亡过程中凋亡指标的变化。方法传代法培养人脑胶质瘤细胞。选择浓度为5、10、15、50μmol/L的MG-132,分别作用于实验组,用噻唑噻(MTT)法筛选半数有效浓度后进行实验。实验分为5组:正常对照组、二硫苏糖醇(DTT)组、MG-132组、SP600125组、MG-132+SP600125组。试剂干预终止后,应用流式细胞仪和DNALadder评估肿瘤细胞凋亡,以聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法检测内质网应激指标GRP78、JNK。结果5μmol/L为筛选的最佳抑制浓度,SHG-44细胞活力下降达39%(P<0.05)。MG-132干预后,与对照组比较,DNA电泳呈凋亡特征(梯状条带),细胞凋亡率显著增加(P<0.05),GRP78m RNA表达明显增加(P<0.05)。但给予DTT后,与MG-132组表现一致,差异无统计学意义(P>0.05)。SP600125+MG-132较DTT和MG-132组有所减低,但不如单独SP600125组降低明显(P<0.05)。蛋白印迹法结果显示,与对照组比较,MG-132组和DTT组内质网应激指标GRP78、JNK表达明显增加(P<0.05),SP600125+MG-132组表达有所减低,但不如单独给予SP600125组明显(P<0.05)。结论内质网应激是MG-132诱导胶质瘤细胞凋亡的主要途径之一,JNK通路抑制剂SP600125可以部分阻断内质网应激,即JNK信号通路为MG-132发挥凋亡作用的途径之一。

转染XRCC3基因的人脑胶质瘤细胞增加烷化剂类抗癌药耐药性

我们既往的研究表明,在人上皮肿瘤细胞中,XRCC3基因的表达水平同肿瘤细胞对美法仑和顺铂的耐药密切相关,提示XRCC3基因在其中起关键作用。为进一步研究XRCC3基因在脑胶质瘤细胞耐药中的作用,我们选用低水平表达XRCC3基因的人脑胶质瘤细胞SKI-1,将其过度表达XRCC3,研究其耐药性的变化。方法:采用脂质体方法将已插入XRCC3基因的pcDNA3.0表达载体转染人脑胶质瘤细胞SKI-1,G418筛选,得到稳定高表达XRCC3的细胞克隆,转染pcDNA3.1空载体作为对照,用Westem blot方法证实。采用改良的sulforhodamine B(SRB)Colorimetric抗癌药筛选法,对稳定表达XRCC3基因和空载体的SKI-1细胞进行细胞毒试验。结果:XRCC3细胞能稳定地高表达XRCC3蛋白,较MOCK细胞高4倍。XRCC3细胞对顺铂和美法仑的耐药性明显较MOCK细胞增强,分别增加了1.8和2.3倍;对BCNU的耐药性无明显增加。结论:XR-CC3基因在人脑胶质瘤细胞对DNA交链剂耐药中起重要作用。

DCX和SPARC基因共表达增强X射线对人脑胶质瘤细胞U-87MG凋亡的影响

用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达、流式细胞仪检测GFP表达比例确定重组腺病毒对U-87MG细胞的最佳感染剂量;RT-PCR和Western blot法检测DCX和SPARC在U-87MG细胞mRNA和蛋白水平的表达;流式细胞仪检测Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC和Ad-DCX-SPARC对X射线诱导U-87MG细胞凋亡的影响。实验结果表明:重组腺病毒对U-87MG细胞的最佳感染剂量为50 MOI;目的基因DCX和SPARC可在mRNA和蛋白水平成功表达;Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC和Ad-DCX-SPARC单纯基因组的凋亡率分别为(1.05±0.42)%、(1.11±0.29)%、(1.18±0.37)%和(1.12±0.40)%;8 Gy剂量辐照后,凋亡率分别为(7.54±0.47)%、(23.23±2.72)%、(16.43±1.13)%和(33.01±2.67)%。提示Ad-DCX-SPARC可以增强X射线诱导的U-87MG细胞的凋亡,从而增强放射敏感性。

人脑胶质瘤细胞来源外泌体的提取鉴定及微环境中的摄取

目的探讨提取、鉴定及观察细胞对外泌体在微环境中的摄取,为后续开展胶质瘤外泌体相关的研究建立稳定的提取方法,以及更清楚地观察到外泌体奠定基础,为今后研究提供一定的参考。方法运用超速离心法从人脑胶质瘤细胞培养上清液中分离外泌体以及观察在肿瘤细胞微环境中肿瘤细胞对外泌体的摄取,通过透射电子显微镜观察外泌体的大小、形态特点,通过马尔文粒径分析确定外泌体粒径的大小,应用Western blotting法进行外泌体特异性抗原分子CD63、TSG101的鉴定,采用荧光共聚焦显微镜观察胶质瘤细胞摄取外泌体。结果通过透射电子显微镜观察到从人脑胶质瘤U251细胞的培养上清液中分离出来的呈圆形杯盘样结构的囊泡样物质,其外形呈典型的杯状和双凹圆盘的扁平球囊体且具备完整的膜结构,粒径大小为30~150 nm,Western blotting结果显示其表达外泌体特异性蛋白CD63、TSG101;外泌体通过细胞内吞噬作用形成、分泌和释放,通过荧光共聚焦显微镜可以证实其有效摄取外泌体,主要集中于细胞质。结论人脑胶质瘤U251细胞中提取分离得到具有双层膜结构茶托样囊泡物质,鉴定其为外泌体,并能观察细胞摄取外泌体集中分布于细胞质。

人脑胶质瘤细胞两种分离方法的对比研究

目的对比人脑胶质瘤细胞的分离纯化方法,并观察其形态学特征。方法取术后人脑胶质瘤新鲜组织,采用冷胰酶消化法和机械分离法分离后结合速差贴壁法纯化处理进行原代培养。采用吉姆萨染色对培养细胞进行形态学观察。结果在细胞产量方面冷胰酶消化法优于机械分离法。结论采用冷胰酶消化法,可以显著降低胰酶对人脑胶质瘤细胞的损害,是可靠的人脑胶质瘤细胞的分离纯化方法。

过表达缝隙连接蛋白Cx43与人脑胶质瘤细胞U251侵袭性的研究

目的通过上调脑胶质瘤细胞U251的Cx43表达水平,检测其对U251侵袭能力的影响,为抑制肿瘤的恶性浸润提供新的治疗途径。方法通过构建缝隙连接蛋白Cx43真核表达重组质粒,并转染U251细胞,过表达U251细胞缝隙连接蛋白Cx43,RT-PCR及Weston-blot检测Cx43 mRNA及蛋白表达水平变化。用Traswell细胞培养板结合MTT法测定U251细胞侵袭能力的改变。结果 (1)成功构建pCMV-Cx43 cDNA重组质粒。(2)成功转染U251细胞并筛选稳定转染过表达Cx43细胞株。(3)Traswell细胞培养板结合MTT法,检测到过表达Cx43后U251细胞侵袭能力较正常组下降。结论过表达缝隙连接蛋白Cx43能抑制人脑胶质瘤细胞U251侵袭能力。

低氧条件下原代培养人脑胶质瘤细胞中COX-2表达与放射敏感性的关系研究

目的探讨低氧条件下体外培养原代人脑胶质瘤细胞中环氧合酶-2(COX-2)表达与放射敏感性的关系。方法取新鲜人脑胶质瘤组织进行原代细胞培养,待细胞稳定传代后,移入低氧环境中继续培养24 h,然后将实验细胞分为3组,未转染组常规培养,转染空载体组采用含空载体培养液培养,转染COX-2-siRNA组利用基因干扰技术,沉默人脑胶质瘤细胞内COX-2基因的表达,制备COX-2靶向siRNA转染至人脑胶质瘤细胞。转染COX-2-siRNA组确定转染成功后,3组人脑胶质瘤细胞在低氧条件下培养24 h后,均给予5 Gy的^(60)Co γ射线照射。照射后换新培养基低氧条件下继续培养24 h后,Western blot法检测各组人脑胶质瘤细胞COX-2蛋白表达情况,RT-PCR法检测各组人脑胶质瘤细胞COX-2mRNA表达情况,流式细胞仪(FCM)检测各组人脑胶质瘤细胞凋亡率。结果未转染组人脑胶质瘤细胞中COX-2蛋白及mRNA表达情况与转染空载体组比较差异均无统计学意义(P>0.05),转染COX-2-siRNA组人脑胶质瘤细胞COX-2蛋白及mRNA表达水平均明显低于未转染组(P均<0.05),细胞凋亡率明显高于未转染组(P<0.05)。结论低氧条件下,COX-2蛋白及mRNA表达增强是引起人脑胶质瘤细胞产生放疗抵抗的一个独立因素。

西妥昔单抗对不同级别人脑胶质瘤细胞体外药敏实验的研究

胶质瘤的治疗仍以手术切除为主，辅以放疗、化疗等综合治疗，但总体疗效仍不满意。目前，西妥昔单抗（cetuximab）应用于脑胶质瘤的报道较少。本实验通过胶质瘤原代细胞培养建立胶质瘤体外细胞模型，西妥昔单抗直接作用于胶质瘤细胞．更直观地显示了西妥昔单抗对不同级别胶质瘤细胞的作用效果，为西妥昔单抗在临床上的进一步应用提供了实验室依据。

c-Met在胶质中的表达及其基因沉默对人脑胶质瘤细胞生物学行为的影响

目的：探讨c-Met基因在胶质中的表达及沉默c-Met对脑胶质瘤细胞生物学行为的影响。方法选择良好生长的U87胶质瘤细胞，在培养70%左右密度时进行传代。在转染中，对照组转染空载体PGC，实验组转染PGC-c-Met shRNA载体，然后进行细胞增殖、细胞周期与细胞凋亡的检测。结果两组均得到稳定转染的U87胶质瘤细胞，实验组的细胞生长计数明显少于对照组（P〈0.05）。经过流式细胞仪检测，相对于对照组，实验组大部分细胞处于G0期，S期细胞明显减少，差异均有统计学意义（P〈0.05）。同时实验组的U87细胞凋亡明显增加（P〈0.05）。结论 HGF及c-Met在脑胶质瘤中表达广泛，沉默c-Met能阻止U87胶质瘤细胞的生长，其作用的发挥与调控胶质瘤细胞的细胞周期与细胞凋亡有关。

色素上皮衍生因子对人脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响

目的探究分析色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)对人脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响。方法培养人胶质母细胞瘤细胞株U87MG,分别添加0 nmol/L、80 nmol/L、160 nmol/L、320 nmol/L PEDF蛋白,记为空白对照组、实验A组、实验B组、实验C组,采用CCK8实验和细胞单克隆实验检测PEDF在U87MG增殖中的作用;采用流式细胞凋亡实验检测PEDF在U87MG凋亡中的作用;采用流式细胞周期实验检测PEDF在U87MG细胞周期中的作用。结果与空白对照组比较,同一时点各实验组细胞增殖率和细胞单克隆能力明显降低(P<0.05),实验C组细胞增殖率与细胞单克隆量明显低于实验A组和实验B组(P<0.05),实验B组的细胞增殖率与单克隆形成量明显低于实验A组(P<0.05);与空白对照组比较,各实验组细胞凋亡率明显增加(P<0.05),细胞G1期、S期进程明显减缓(P<0.05),实验C组细胞凋亡率明显高于实验A、B组(P<0.05),C组S期细胞数明显少于实验A、B组(P<0.05),实验B组细胞凋亡率明显高于实验A组(P<0.05),B组S期细胞数则明显少于实验A组(P<0.05)。结论PEDF能抑制人胶质母细胞瘤细胞U87MG增殖和单克隆形成,并可通过影响细胞周期进程促进U87MG凋亡,其作用与PEDF浓度有关。

复方藤梨汤含药血清对人脑胶质瘤U251细胞增殖、凋亡及上皮间质转化的影响

目的探究复方藤梨汤含药血清对人脑胶质瘤U251细胞增殖、凋亡及上皮间质转化的影响。方法将24只雄性SD大鼠分为对照组和低、中、高剂量组[复方藤梨汤6、12、24g/(kg·d)],每组6只,制备含药血清处理人脑胶质瘤U251细胞。采用CCK-8法检测细胞活力,集落形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞周期分布与细胞凋亡,定量聚合酶链反应检测原癌基因C-myc、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)基因表达,Western blot法检测细胞凋亡蛋白[B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8]以及β-连环蛋白(β-catenin)、上皮性黏附蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)表达。结果选取体积分数10%的含药血清为最终剂量。与对照组比较,低、中、高剂量组细胞活力、克隆形成数、C-myc mRNA、CyclinD1 mRNA、Vimentin表达水平降低,处于S期细胞比例、Bax/Bcl-2比值、Caspase-3表达水平升高(P<0.05);低、高剂量组G1期细胞比例降低(P<0.05);中、高剂量组G2期细胞比例、β-catenin表达水平降低,Caspase-8和E-cadherin表达水平升高(P<0.05);高剂量组细胞凋亡率升高(P<0.05)。结论复方藤梨汤含药血清可促使人脑胶质瘤U251细胞阻滞于S期,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,通过调节β-catenin、E-cadherin和Vimentin表达抑制上皮间质转化。

靶向表皮生长因子受体的小分子干扰RNA抑制TJ905人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的实验研究

目的 比较靶向表皮生长因子受体 (EGFR)的小分子干扰RNA与反义RNA构建体对TJ90 5人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用。方法 选择人EGFR的二个siRNA靶序列构建靶向EGFR的siRNA表达质粒 ,并以反义EGFRRNA为对照进行脂质体介导的TJ90 5人脑恶性胶质瘤细胞系表达。应用免疫荧光和蛋白印迹检查EGFR的表达水平 ;应用TUNEL法分析细胞凋亡 ,流式细胞术分析细胞周期变化 ,MTT法分析细胞增殖 ;蛋白印迹检测基质金属蛋白酶 9的表达 ,明胶酶谱分析MMP9酶活性 ,Transwell法分析侵袭能力。结果 与TJ90 5细胞和转染空载体的TJ90 5细胞比较 ,转染反义EGFRRNA使EGFR表达下调 82 % ,转染siRNA表达质粒组EGFR表达下调 90 %和 92 %。TJ90 5组和空载转染组几乎没有凋亡细胞 ,反义EGFR转染组与siRNA表达质粒组的凋亡率明显增加 ( χ2 =31 5 4 9,P <0 0 0 1) ;siRNA表达载体转染后S期指数较对照和反义RNA转染组细胞明显减少 ,与TJ90 5组和空载转染组比较 ,转染组细胞自第 1天起存活率均明显下降 (P <0 0 0 1) ,且反义组与siRNA表达载体转染组之间存活率差异有显著意义 (P <0 0 1) ;同时蛋白印迹发现转染siRNA表达载体后MMP 9的表达明显下调 ,明胶酶谱分析发现在反义组与siRNA表达载体转染组MMP 9酶活性明显下降 。