人脑胶质母细胞瘤细胞系U87的单克隆细胞构建及异质性研究

目的人胶质母细胞瘤细胞细胞系U87被作为胶质母细胞瘤(GBM)异质性研究的模型,但从基因水平探讨其异质性来源的研究较少。文章旨在构建人胶质母细胞瘤细胞系U87单克隆细胞株,检测不同单克隆细胞株的表型和遗传背景差异,并探讨产生表型差异的分子机制。方法利用小分子荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)作为筛选标记,有限稀释法构建U87单克隆细胞株,并挑选具有典型形态特征的2株单克隆化细胞,经短串联重复序列(STR)鉴定后进行后续研究。采用CCK-8、EdU掺入法增殖实验和和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;肿瘤干细胞成球实验检测细胞成球能力;免疫荧光和CCK-8法黏附实验检测细胞黏附能力;3D侵袭实验检测细胞侵袭能力;Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞对化疗药物的敏感性;转录组测序(RNA-seq)对细胞进行测序及生物信息学分析;qRT-PCR验证富集通路中代表性差异基因mRNA表达量。结果构建了形态较为均一U87单克隆细胞株CF5和G11。其中CF5小而短粗,G11大而细长。CCK-8增殖实验结果显示,CF5细胞增殖能力较U87、G11明显增强,U87较G11明显增强(P<0.001)。EdU掺入法增殖实验结果显示,CF5 EdU阳性细胞比例(0.54±0.05)较G11细胞(0.35±0.03)、U87(0.44±0.03)明显增加,U87较G11明显增强(P<0.01)。肿瘤干细胞成球实验显示,CF5干细胞成球能力较U87、G11明显增强,U87较G11明显增强(P<0.01)。免疫荧光法黏附实验显示,黏附1 h后G11黏附面积较U87、CF5明显增强,U87较CF5明显增强(P<0.001)。3D培养侵袭实验结果显示,G11细胞侵袭能力较U87、CF5明显增强,U87较CF5明显增强(P<0.05)。交互分析发现CF5相对G11和U87均下调的基因159个,均上调的基因303个;G11相对CF5和U87均下调的基因有281个,上调的基因则有116个;通路富集分析显示CF5和G11在细胞外基质相关的通路有最高的富集度,细胞外基质相关通路与肿瘤侵袭、耐药等功能表型密切相关。结论成功构建从形态、功能表型到基因背景具有显著差异的U87单克隆细胞株CF5、G11,为研究GBM异质性和基因功能奠定了基础。

LRIG1基因对胶质瘤SHG44的放疗增敏作用

目的研究亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)对人脑胶质瘤细胞系44细胞(SHG44)的放疗增敏作用。方法采用分子克隆技术,将构建的重组质粒p EGFP-C1-LRIG1转染SHG44,并稳定表达后在荧光显微镜下观察;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术研究放射照射后SHG44中目的基因LRIG1和表皮生长因子受体(EGFR)的信使核糖核酸(mRNA)表达情况;免疫组织化学法分析照射后SHG44中LRIG1和EGFR的蛋白表达差异;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分析干预后SHG44的细胞增殖能力;细胞侵袭实验(Transwell)分析干预后SHG44的肿瘤侵袭能力。结果重组质粒p EGFP-C1-LRIG1转染SHG44细胞可稳定表达LRIG1;SHG44+p EGFP-C1-LRIG1细胞相对于SHG44、SHG44+p EGFP-C1细胞,LRIG1与EGFR基因的mRNA和蛋白的表达水平有显著差异(P<0.01);且SHG44+p EGFP-C1-LRIG1细胞的细胞活性及侵袭能力较SHG44、SHG44+p EGFP-C1细胞明显下降(P<0.01)。结论在胶质瘤SHG44细胞中过表达LRIG1基因可通过下调EGFR表达,抑制SHG44细胞的恶性生物学行为,增加放疗敏感性。

反义microRNA-221与反义microRNA-222抑制人脑胶质瘤细胞的体外与体内生长

目的探讨敲低microRNA（miR）-221和miR-222表达以抑制人脑胶质瘤U251细胞生长的作用及其机制。方法脂质体介导转染反义寡聚核苷酸（AS—miR-221和AS．miR-222）于人脑胶质瘤细胞13251。采用Northern blot鉴定转染后U251细胞的miR-221和miR-222表达水平；四甲基偶氮唑蓝（Myr）法评价AS—miR-221和AS—miR-222抑制U251细胞生长的作用；Transwell实验检测细胞侵袭能力；流式细胞术检测细胞周期的分布和凋亡；Western blot检测转染后U251细胞相关蛋白表达的变化，并用AS—miR-221和AS—miR-222治疗裸鼠皮下移植瘤，观察其在活体内对肿瘤生长的抑制作用。结果Northern blot检测结果显示，AS-miR-221和AS—miR-222共转染后，肿瘤细胞miR-221和miR-222表达明显下降，细胞生长速度降低，细胞穿过率为14．5％，细胞周期出现G0／G1期阻滞，凋亡率（13．7％）增高，并可见connexin43、p27、PUMA、caspase-3、PTEN、TIMP3和Bax等相关蛋白表达增高，而bcl-2表达降低，p53无明显变化。经AS—miR-221和AS—miR-222治疗后，裸鼠皮下移植瘤生长明显受抑。结论AS-miR-221和AS—miR-222共转染可抑制U251细胞的增殖与侵袭，miR-221和miR-222可以作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点。

冬凌草甲素诱导人脑胶质瘤U251细胞的凋亡及其机制

目的研究冬凌草甲素对人脑胶质瘤U251细胞体外生长抑制及诱导凋亡的作用及其机制。方法 MTT法检测冬凌草甲素对U251细胞的生长抑制作用;倒置显微镜法和荧光显微镜Annexin V-FITC/PI双染色法观察细胞的形态学变化;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率;Realtime PCR法检测冬凌草甲素作用U251细胞后的bcl-2、bax及caspase-3基因表达水平的变化。结果冬凌草甲素对U251细胞有明显的生长抑制作用(P<0.05),呈明显的时间和浓度效应关系。冬凌草甲素作用U251细胞24h后出现明显的细胞凋亡形态学改变。随着冬凌草甲素作用浓度增加,凋亡和坏死细胞数均增加,浓度越高,诱导细胞凋亡的作用越明显(P均<0.05)。随着冬凌草甲素作用时间延长,U251细胞的bax和caspase-3基因的表达逐渐增强,bcl-2基因的表达逐渐减弱(P均<0.05)。结论冬凌草甲素能诱导人脑胶质瘤U251细胞凋亡,其凋亡机理可能与bax和caspase-3基因表达的上调,bcl-2基因表达的下调相关。