异甘草素联合替莫唑胺对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖的影响

目的 探讨异甘草素联合替莫唑胺对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖的影响。方法 采用含无血清达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基（DMEM/F12）（含表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、B27）的悬浮细胞培养板培养、纯化胶质瘤干细胞，并通过CD133联合Nestin标记进行免疫荧光鉴定；实验分为对照组／[含二甲基亚砜（DMSO）／]、异甘草素（5~160 μmol/L）组、替莫唑胺（12.5～200 μmol/L）组、异甘草素＋替莫唑胺组（160 μmol/L＋12.5~200 μmol/L），通过细胞增殖毒性检测（CCK-8）法、流式细胞术、免疫荧光染色法分别检测细胞抑制率、细胞周期及干细胞表面相关分化蛋白表达情况。结果异甘草素随着浓度增加细胞抑制作用越强，且160 μmol/L时抑制率达32%，替莫唑胺随着浓度增加抑制作用越强，且200 μmol/L时抑制率达40%；异甘草素联合替莫唑胺组随着浓度增加抑制作用越强，且160 μmol/L＋200 μmol/L时抑制率达72%；随着异甘草素浓度增加G0/G1期细胞比例增加，细胞周期阻滞于G0/G1期；随着异甘草素浓度增加干细胞分化越多，且分化细胞的死亡越多。结论异甘草素能诱导SHG44人脑胶质瘤干细胞向星形胶质细胞和神经元细胞分化，且能抑制增殖，同时增强替莫唑胺化疗敏感性。

^(60)Coγ射线照射联合三氧化二砷对人脑胶质瘤SHG44细胞DNA损伤的研究

目的研究60Coγ射线照射联合As2O3对SHG44细胞的生长抑制作用。方法以SHG44细胞为实验对象,3H-TdR掺入法研究As2O3和照射对SHG44细胞DNA合成率的影响;用单细胞凝胶电泳法,以DNA彗星尾长及尾部DNA百分含量来比较As2O3、照射分别单独作用及它们联合作用对细胞DNA的损伤。结果联合组SHG44细胞存活率低于As2O3(P<0.01);3组均诱导DNA损伤,联合作用组对细胞DNA的损伤程度明显高于照射及As2O3单独作用组。结论电离辐射和As2O3联合应用对SHG44细胞的杀灭作用均强于电离辐射和As2O3单独作用。

芳香化酶在胶质母细胞瘤细胞系SHG-44细胞中的表达及调控

目的 研究芳香化酶细胞色素P45 0 (AROM)及雌激素受体 (ER α)在胶质母细胞瘤细胞系SHG 4 4细胞中的基因表达。 方法 细胞培养、免疫细胞化学染色、原位杂交染色及RT PCR技术。 结果 在SHG 4 4细胞中分别检测到AROM及ER α的表达 ,进一步发现SHG 4 4细胞中AROM的表达是由多个组织特异性启动子驱动基因的转录。 结论 可能为中枢神经系统肿瘤发生的激素调节提供新的资料。

电离辐射和三氧化二砷联合对人脑胶质瘤SHG44细胞的杀灭作用

目的 研究电离辐射联合三氧化二砷(As2O3)对人脑胶质瘤SHG44细胞的杀灭作用。方法 以SHG44细胞为实验对象,用四氮唑盐(MTT)比色法观察不同剂量的电离辐射、单独As2O3及不同剂量的电离辐射和As2O3联合对SHG44细胞的杀灭作用;用激光共聚焦显微镜观察细胞的形态学变化。结果 (1)照射与As2O3联合组SHG44细胞存活率低于单独相应剂量照射组(P<0.01)和单独As2O3组(P<0.01);(2)2Gy剂量照射+4μmol／L As2O3组对SHG44细胞杀灭作用强于6Gy剂量单独照射组(P<0.01),相当于8Gy单独照射组(P>0.05);(3)激光共聚焦显微镜下观察到As2O3处理组细胞出现明显的凋亡形态学变化。结论 电离辐射和As2O3联合对SHG44细胞的杀灭作用分别强于电离辐射和As2O3单独作用;

pEgr-hPTEN体外稳定转染对人脑胶质瘤SHG-44细胞周期及增殖的影响

目的 探讨外源野生型PTEN基因对人脑胶质瘤SHG 4 4细胞周期及增殖的影响 ,阐明PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的机制。方法 脂质体包裹重组质粒pEgr hPTEN体外转染内源性PTEN基因突变的SHG 4 4胶质瘤细胞 ;G4 18筛选稳定表达细胞株并扩增培养 ;采用细胞计数法检测肿瘤细胞增殖速度 ;流式细胞术检测肿瘤细胞周期的变化。结果 经 10到 2 0dG4 18筛选得到稳定表达细胞株 ;重组质粒pEgr hPTEN稳定转染可明显抑制SHG 4 4细胞的体外增殖 ,细胞周期明显改变 ,细胞从G1期到S期发生阻滞。结论 提示转染外源野生型PTEN基因可使SHG 4 4细胞周期阻滞于G1期 ,并可抑制肿瘤细胞增殖。

DAPT对人胶质瘤细胞系SHG-44增殖的抑制作用及机制

目的探讨γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对人脑胶质瘤细胞系SHG-44细胞体外增殖的抑制作用及机制。方法应用不同浓度的DAPT作用SHG-44细胞,采用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期及CD133+的肿瘤干细胞(TSC)数量的变化;应用RT-PCR及Western印迹法检测Notch通路关键分子(Notch-1,Delta-l,Hes-1)基因及蛋白水平的表达。结果 DAPT作用SHG-44细胞后,明显抑制了细胞增殖(P<0.05),且抑制作用呈剂量依赖性。细胞周期结果显示S期细胞比例减少,G0/G1期细胞比例显著增加;CD133+的TSC数量明显减少。随着DAPT浓度的增加,Notch-1,Delta-l,Hes-1 mRNA及蛋白表达水平逐渐下降。结论 DAPT可以下调Notch通路中Notch-l、Delta-1、Hes-1的表达,减少TSC数量,抑制SHG-44细胞增殖。

参麦注射液诱导人脑胶质瘤SHG-44细胞凋亡的影响

目的观察参麦注射液体内外对人脑胶质瘤SHG-44细胞生长的抑制及诱导凋亡的作用。方法常规培养细胞,分别加入10,20,40,80,160,320μg·m L-1参麦注射液,分别于培养48,72,96 h后采用噻唑蓝(MTT)法检测参麦注射液对SHG-44细胞增殖的抑制作用;Annexin V-FITC/PI法检测对细胞凋亡的影响;建立SHG-44细胞裸鼠异种移植瘤模型,随机分为模型对照组、顺铂组及参麦注射液(20,40,80 mg·kg-1)3个剂量组,每日腹腔注射给药,观察荷瘤裸鼠的一般活动状况以及进食量;12 d后处死裸鼠,剥瘤称定质量并计算抑瘤率;取组织瘤块,免疫组织化学法检测基因蛋白Caspase-9、Caspase-12、Fas、Survivin含量。结果参麦注射液6个剂量组对SHG-44细胞的增殖均具有明显抑制作用,该抑制率具有时间和剂量依赖性;3个剂量的参麦注射液均能明显诱导SHG-44细胞凋亡;参麦注射液腹腔注射给药可明显抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生长;促进Caspase-9、Caspase-12、Fas表达,抑制Survivin的表达。结论参麦注射液体内外均可抑制人脑胶质瘤SHG-44细胞的生长,并诱导其凋亡,其诱导凋亡的机制可能与上调Caspase-9、Caspase-12、Fas水平,下调Survivin有关。

人脑胶质母细胞瘤细胞系U87的单克隆细胞构建及异质性研究

目的人胶质母细胞瘤细胞细胞系U87被作为胶质母细胞瘤(GBM)异质性研究的模型,但从基因水平探讨其异质性来源的研究较少。文章旨在构建人胶质母细胞瘤细胞系U87单克隆细胞株,检测不同单克隆细胞株的表型和遗传背景差异,并探讨产生表型差异的分子机制。方法利用小分子荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)作为筛选标记,有限稀释法构建U87单克隆细胞株,并挑选具有典型形态特征的2株单克隆化细胞,经短串联重复序列(STR)鉴定后进行后续研究。采用CCK-8、EdU掺入法增殖实验和和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;肿瘤干细胞成球实验检测细胞成球能力;免疫荧光和CCK-8法黏附实验检测细胞黏附能力;3D侵袭实验检测细胞侵袭能力;Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞对化疗药物的敏感性;转录组测序(RNA-seq)对细胞进行测序及生物信息学分析;qRT-PCR验证富集通路中代表性差异基因mRNA表达量。结果构建了形态较为均一U87单克隆细胞株CF5和G11。其中CF5小而短粗,G11大而细长。CCK-8增殖实验结果显示,CF5细胞增殖能力较U87、G11明显增强,U87较G11明显增强(P<0.001)。EdU掺入法增殖实验结果显示,CF5 EdU阳性细胞比例(0.54±0.05)较G11细胞(0.35±0.03)、U87(0.44±0.03)明显增加,U87较G11明显增强(P<0.01)。肿瘤干细胞成球实验显示,CF5干细胞成球能力较U87、G11明显增强,U87较G11明显增强(P<0.01)。免疫荧光法黏附实验显示,黏附1 h后G11黏附面积较U87、CF5明显增强,U87较CF5明显增强(P<0.001)。3D培养侵袭实验结果显示,G11细胞侵袭能力较U87、CF5明显增强,U87较CF5明显增强(P<0.05)。交互分析发现CF5相对G11和U87均下调的基因159个,均上调的基因303个;G11相对CF5和U87均下调的基因有281个,上调的基因则有116个;通路富集分析显示CF5和G11在细胞外基质相关的通路有最高的富集度,细胞外基质相关通路与肿瘤侵袭、耐药等功能表型密切相关。结论成功构建从形态、功能表型到基因背景具有显著差异的U87单克隆细胞株CF5、G11,为研究GBM异质性和基因功能奠定了基础。

两种级别胶质瘤细胞系代谢基因的差异表达

目的基因的异常表达和功能调节在胶质瘤的进展过程中扮演着重要的作用。然而,导致胶质瘤由低级向高级进展的基因通路远未阐明。本实验拟从不同级别的胶质瘤细胞系筛选代谢相关的差异表达基因,为进一步研究胶质瘤进展的机制提供实验基础。方法以两株不同级别的胶质瘤细胞系(CHG-5,WHOⅡ级;SHG-44,WHOⅣ级)和全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)为实验模型,运用cDNA微阵列技术进行研究。通过芯片杂交,分别检测CHG-5以及全反式维甲酸诱导前后SHG-44的基因表达谱,筛选差异表达基因;随机选择数个差异基因进行Northern杂交实验,以验证cDNA微阵列的结果。结果本实验发现13个与胶质瘤进展密切相关的代谢基因存在差异表达,它们涉及细胞的糖类和核苷酸代谢。其中,TPI1,BPGM,ALDOA,AKR1B1,LDHA,ADSL,RRM1和NP表达上调,而UGT2B7,ACAT1,IMPDH2,PRPS1和PKM2表达下调。此外,有5个基因(TPI1,BPGM,ALDOA,LDHA和RRM1)在全反式维甲酸诱导的SHG-44细胞中也出现差异表达,提示这些基因不仅存在于不同级别的胶质瘤细胞系之间、而且存在于分化诱导处理的胶质瘤细胞之间。部分差异表达基因为Northern杂交实验所验证。结论利用cDNA微阵列技术首次发现有13个差异表达基因与胶质瘤细胞的代谢密切相关,它们可能在胶质瘤的恶性转化和进展中扮演着重要的作用。

CD44v6、Syndecan-1在人脑胶质瘤中的表达

目的通过研究黏附分子CD44v6、syndecan-1在胶质瘤中的表达,探讨其与胶质瘤浸润发展的关系。方法用免疫组织化学SP法,CD44v6选用石蜡切片,syndecan1采用冰冻切片进行分析研究。结果CD44v6在正常脑组织的阳性表达率50%(4/8),而在胶质瘤中基本不表达8.2%(5/61);syndecan1在胶质瘤中表达为22%(9/41),明显低于对照组阳性表达率75%(6/8)(P<0.05)。但两者的表达在胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级组与Ⅲ～Ⅳ级组中相比均无统计学差异(P>0.05)。结论CD44v6的表达缺失可能是胶质瘤不发生颅外转移的原因之一,syndecan-1与胶质瘤的浸润发展有一定的相关性。

人脑星形细胞系肿瘤中HSP70的表达水平及其意义

目的 :检测热休克蛋白 70 (HSP70 )在人脑星形细胞瘤中的表达水平 ,探讨其在胶质瘤诊断中的意义。方法 :采用免疫组织化学方法对 4 1例星形细胞瘤标本及 13例脑组织进行染色 ,比较肿瘤与正常脑组织HSP70表达水平的差异。结果 :星形细胞瘤标本的HSP70水平明显升高 ,与正常脑组织比较有明显差异 (P <0 .0 1) ,而且随着肿瘤恶性程度的增高 ,HSP70的表达水平也相应增加 (P <0 .0 1)。结论 :HSP70可以作为反映肿瘤增殖情况的参考依据 。

LRIG1基因对胶质瘤SHG44的放疗增敏作用

目的研究亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)对人脑胶质瘤细胞系44细胞(SHG44)的放疗增敏作用。方法采用分子克隆技术,将构建的重组质粒p EGFP-C1-LRIG1转染SHG44,并稳定表达后在荧光显微镜下观察;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术研究放射照射后SHG44中目的基因LRIG1和表皮生长因子受体(EGFR)的信使核糖核酸(mRNA)表达情况;免疫组织化学法分析照射后SHG44中LRIG1和EGFR的蛋白表达差异;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分析干预后SHG44的细胞增殖能力;细胞侵袭实验(Transwell)分析干预后SHG44的肿瘤侵袭能力。结果重组质粒p EGFP-C1-LRIG1转染SHG44细胞可稳定表达LRIG1;SHG44+p EGFP-C1-LRIG1细胞相对于SHG44、SHG44+p EGFP-C1细胞,LRIG1与EGFR基因的mRNA和蛋白的表达水平有显著差异(P<0.01);且SHG44+p EGFP-C1-LRIG1细胞的细胞活性及侵袭能力较SHG44、SHG44+p EGFP-C1细胞明显下降(P<0.01)。结论在胶质瘤SHG44细胞中过表达LRIG1基因可通过下调EGFR表达,抑制SHG44细胞的恶性生物学行为,增加放疗敏感性。

诱导分化剂联合化疗药治疗可移植性人脑胶质瘤的实验研究

背景与目的:丙戊酸钠(valproate,VPA)不仅是经典的临床抗癫痫药物,近年来还发现其对多种肿瘤细胞都有一定的诱导分化作用,但单独应用或与化疗药联合应用对脑胶质瘤体内疗效如何尚不确定。本研究旨在探讨两者抗胶质瘤的联合效应。方法:将低分化人脑胶质瘤体外细胞系SHG-44移植于裸小鼠制作成可移植性实体瘤模型后,单用VPA以及联合应用盐酸尼莫司汀(nimustine,ACNU)进行治疗,观察移植瘤体积、病理学形态、细胞增殖周期、分化抗原表达等指标的变化。结果:VPA和ACNU联合用药组的疗效明显优于任何一种单独给药组,表现为肿瘤生长抑制,细胞异型性降低,G0/G1期细胞比例增加,胶原纤维酸性蛋白表达上调。结论: VPA联合应用化疗药能够明显增强VPA抑制人脑胶质瘤生长和诱导其向良性分化的作用。

Cyclin D_1在颅脑胶质瘤中表达及细胞周期表达模式的研究

目的研究颅脑胶质瘤中cyclin D1的表达和细胞周期表达模式,探讨其与胶质瘤恶性程度的关系,并从生物学功能上探讨Cy-clinD1在胶质瘤细胞周期演进中的作用。方法采用免疫组化法检测52例胶质瘤标本中cyclin D1的表达,观察其与胶质瘤恶性程度之间的关系;利用流式细胞仪双参数法和细胞同步化,确定CyclinD1在胶质瘤细胞系SHG-44和BT-325中的细胞周期表达分布模式。结果Cyclin D1的表达随病理等级的递增而增高,高恶性度组阳性率和标记指数明显高于低恶性度组(P<0.05)。在胶质瘤细胞系SHG-44和BT-325中,CyclinD1的表达呈细胞周期依赖性。结论cyclin D1在人脑胶质瘤细胞中过度表达,同肿瘤的发生、发展有密切联系;在SHG-44和BT-325胶质瘤细胞中CyclinD1的表达呈细胞周期依赖性。

榄香烯对人源性脑胶质细胞瘤SHG-44细胞系放射增敏实验研究

脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，在所有原发性脑肿瘤中约43％-50％为胶质细胞瘤^[1]，放疗是有效的辅助治疗手段之一，但疗效不理想。研究旨在探讨榄香烯对脑胶质细胞瘤SHG-44细胞系是否有放射增敏作用及初步探讨放射增敏作用机制。

人脑胶质瘤细胞系MGR2和T98G的生物学特性比较

研究显示人脑胶质瘤的放射敏感性差异较大，原因未明。笔者研究人脑胶质瘤细胞系MGR2和T98G的放射敏感性、细胞周期及细胞周期相关蛋白表达差异，并探索他们之间的关系。

小分子干扰RNA(siRNA)沉默CD147基因对脑胶质瘤细胞系SHG-44生长及凋亡的影响研究

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)沉默CD147基因对脑胶质瘤细胞系SHG-44生长及凋亡的影响。方法根据CD147 cDNA序列设计具有短发夹结构的两条DNA序列,与载体pSilencer4.1-CMV neo构建重组表达载体,鉴定后转染至SHG-44细胞,western blotting检测抑制效果,MTT检测细胞增殖情况,流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况。结构成功构建了针对CD147基因表达的干扰质粒,有效抑制了SHG-44细胞增殖,促进了SHG-44细胞凋亡。结论 CD147靶向RNA干扰重组表达载体为肝癌的基因治疗提供了可能。

反义microRNA-221与反义microRNA-222抑制人脑胶质瘤细胞的体外与体内生长

目的探讨敲低microRNA（miR）-221和miR-222表达以抑制人脑胶质瘤U251细胞生长的作用及其机制。方法脂质体介导转染反义寡聚核苷酸（AS—miR-221和AS．miR-222）于人脑胶质瘤细胞13251。采用Northern blot鉴定转染后U251细胞的miR-221和miR-222表达水平；四甲基偶氮唑蓝（Myr）法评价AS—miR-221和AS—miR-222抑制U251细胞生长的作用；Transwell实验检测细胞侵袭能力；流式细胞术检测细胞周期的分布和凋亡；Western blot检测转染后U251细胞相关蛋白表达的变化，并用AS—miR-221和AS—miR-222治疗裸鼠皮下移植瘤，观察其在活体内对肿瘤生长的抑制作用。结果Northern blot检测结果显示，AS-miR-221和AS—miR-222共转染后，肿瘤细胞miR-221和miR-222表达明显下降，细胞生长速度降低，细胞穿过率为14．5％，细胞周期出现G0／G1期阻滞，凋亡率（13．7％）增高，并可见connexin43、p27、PUMA、caspase-3、PTEN、TIMP3和Bax等相关蛋白表达增高，而bcl-2表达降低，p53无明显变化。经AS—miR-221和AS—miR-222治疗后，裸鼠皮下移植瘤生长明显受抑。结论AS-miR-221和AS—miR-222共转染可抑制U251细胞的增殖与侵袭，miR-221和miR-222可以作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点。

c—myc内含子结合蛋白1基因转染人脑胶质瘤细胞的研究

c—myc内含子结合蛋白1（M1BPI）基因是c—myc的上游调控基因之一，在前期的工作中我们检测了该基因在人脑胶质瘤中的表达，并完成了全长基因测序，Genebank注册：DQ231041，并构建了完整的MIBP1基因的真核表达载体pLX—SN—MIBP1。我们将此基因转染到胶质瘤细胞株SHG-44中，观察对人脑胶质瘤细胞的作用。

WORT对血清饥饿及辐射诱导血清饥饿的SHG44增殖抑制作用的影响

目的研究磷脂酰肌醇-3-激酶的相对特异性抑制剂WORT(Wortmannin,渥漫青霉素)对血清饥饿的SHG44细胞及辐射诱导血清饥饿的SHG44增殖抑制作用的影响。方法用甲基噻唑基四氮唑盐(Methyl thiazolyltetrazolium,MTT)比色法测定不同浓度的WORT处理的血清饥饿及血清饥饿后5 Gy照射的SHG44细胞的存活率。结果血清饥饿后,1.00×10-8mol/L^5.00×10-7mol/L的WORT使细胞存活率随WORT浓度的升高而降低(P<0.05),5.00×10-7mol/L^5.00×10-6mol/L的WORT使细胞存活率的降低出现平台期,1.50×10-5~3.00×10-5mol/L范围内细胞存活率再一次出现下降(P<0.05)。实验结果表明WORT可使血清饥饿后再接受5 Gy照射的细胞存活率进一步降低(P<0.05)。结论血清饥饿后,渥漫青霉素可抑制SHG44细胞的增殖,并提高辐射诱导血清饥饿细胞的增殖抑制作用,其机制可能与抑制PI3K通路以及PI3K家族其他成员相关。