敲低Aurora A基因增强替莫唑胺抗人脑胶质瘤U87细胞的作用

目的探讨敲低Aurora A基因对替莫唑胺抗人脑胶质瘤U87细胞的作用。方法以慢病毒介导Aurora A shRNA转染高表达Aurora A基因的U87人脑胶质瘤细胞敲低其表达;转染后荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR、Western blot分别检测Aurora-A mRNA及蛋白表达;证实转染成功后,以不同浓度梯度替莫唑胺作用于未转染组、空载体组和转染组3组细胞,每组5个平行孔,并设空白对照及阴性对照,作用一定时间后用CCK8法测定替莫唑胺对细胞增殖影响;流式细胞仪测替莫唑胺对细胞周期的影响。结果荧光显微镜下可见转染组及空载体组细胞带绿色荧光;未转染组、空载体组和转染组的RT-PCR和Western blot结果灰度值分别为(31023±926)、(30124±1074)、(896±172)和(39556±2306)、(39348±2738)、(574±96)。相对于空载体组和未转染组,转染组的Aurora A mRNA和蛋白表达均降低(P<0.001);未转染组、空载体组和转染组的半数有效抑制浓度(IC50)分别为:(43.38±2.15)μmol/L、(43.76±1.52)μmol/L、(22.20±2.34)μmol/L,转染组替莫唑胺半数有效抑制浓度(IC50)降低(P<0.01);替莫唑胺处理的转染组G2/M期细胞百分数(88.01%±7.35%)高于空载体组(59.28%±6.76%)和未转染组(58.35%±5.98)(P<0.01),与对照的相同细胞株相比G2/M期均延长(P<0.01)。结论敲低Aurora A基因表达可增强替莫唑胺抗人脑胶质瘤U87细胞作用。

三氧化二砷复合物抑制人脑胶质瘤U87细胞生长的机制研究

目的研究三氧化二砷复合物对人脑胶质瘤U87细胞凋亡的影响,并进一步探讨其作用机制。方法采用激光共聚焦技术研究三氧化二砷各复合物进入细胞的方式;采用细胞划痕愈合试验观察其对U87细胞迁移能力的影响;采用血管形成试验观察其对新生血管形成能力的影响;流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞凋亡;免疫蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表达情况。结果三氧化二砷复合物主要通过内吞方式进入细胞,能显著抑制U87细胞的迁移以及新生血管的形成;其可诱导U87细胞周期阻滞于G2/M期,促进细胞发生凋亡;三氧化二砷复合物促进Bax和caspase-3的表达,抑制Bcl-2的表达。结论三氧化二砷复合物对U87细胞的抑制作用机制可能是通过内吞方式进入细胞后,上调Bax的表达,下调Bcl-2的表达,最终诱导细胞发生凋亡。

miR-203负性调控CPEB4基因对人脑胶质瘤U87细胞增殖的影响

目的探讨mi R-203对胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白4(cytoplasmic polyadenylation element binding protein4,CPEB4)基因的靶向作用及对人脑胶质瘤U87细胞增殖的影响。方法采用免疫组化法检测CPEB4在人脑胶质瘤U87细胞中的表达,生物信息学方法预测mi R-203与CPEB4基因的靶向配对关系,并应用Dual-Luciferase誖报告系统鉴定;将mi R-203 mimics及si RNA转染U87细胞,Real-time PCR法检测mi R-203和CPEB4 m RNA水平,Western blot法检测CPEB4蛋白的表达,平板克隆形成试验检测癌细胞的增殖情况。结果光镜下可见U87细胞均匀分布,但细胞形态多样性明显,胞质内有CPEB4蛋白高表达,呈棕褐色;mi R-203与CPEB4基因靶向配对良好,mi R-203能够抑制CPEB4 m RNA水平。过表达mi R-203能够降低CPEB4 m RNA和蛋白的表达,抑制U87细胞的增殖。结论mi R-203通过负性调控人脑胶质瘤U87细胞中CPEB4基因的表达,进而抑制癌细胞的增殖。

人脑胶质母细胞瘤细胞系U87的单克隆细胞构建及异质性研究

目的人胶质母细胞瘤细胞细胞系U87被作为胶质母细胞瘤(GBM)异质性研究的模型,但从基因水平探讨其异质性来源的研究较少。文章旨在构建人胶质母细胞瘤细胞系U87单克隆细胞株,检测不同单克隆细胞株的表型和遗传背景差异,并探讨产生表型差异的分子机制。方法利用小分子荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)作为筛选标记,有限稀释法构建U87单克隆细胞株,并挑选具有典型形态特征的2株单克隆化细胞,经短串联重复序列(STR)鉴定后进行后续研究。采用CCK-8、EdU掺入法增殖实验和和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;肿瘤干细胞成球实验检测细胞成球能力;免疫荧光和CCK-8法黏附实验检测细胞黏附能力;3D侵袭实验检测细胞侵袭能力;Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞对化疗药物的敏感性;转录组测序(RNA-seq)对细胞进行测序及生物信息学分析;qRT-PCR验证富集通路中代表性差异基因mRNA表达量。结果构建了形态较为均一U87单克隆细胞株CF5和G11。其中CF5小而短粗,G11大而细长。CCK-8增殖实验结果显示,CF5细胞增殖能力较U87、G11明显增强,U87较G11明显增强(P<0.001)。EdU掺入法增殖实验结果显示,CF5 EdU阳性细胞比例(0.54±0.05)较G11细胞(0.35±0.03)、U87(0.44±0.03)明显增加,U87较G11明显增强(P<0.01)。肿瘤干细胞成球实验显示,CF5干细胞成球能力较U87、G11明显增强,U87较G11明显增强(P<0.01)。免疫荧光法黏附实验显示,黏附1 h后G11黏附面积较U87、CF5明显增强,U87较CF5明显增强(P<0.001)。3D培养侵袭实验结果显示,G11细胞侵袭能力较U87、CF5明显增强,U87较CF5明显增强(P<0.05)。交互分析发现CF5相对G11和U87均下调的基因159个,均上调的基因303个;G11相对CF5和U87均下调的基因有281个,上调的基因则有116个;通路富集分析显示CF5和G11在细胞外基质相关的通路有最高的富集度,细胞外基质相关通路与肿瘤侵袭、耐药等功能表型密切相关。结论成功构建从形态、功能表型到基因背景具有显著差异的U87单克隆细胞株CF5、G11,为研究GBM异质性和基因功能奠定了基础。

知母皂苷AⅢ抑制人脑胶质瘤增殖生长的机制研究

考察知母皂苷AⅢ抑制人脑胶质瘤U87MG细胞增殖的作用及机制分析。在裸鼠皮下荷瘤模型中,知母皂苷AⅢ组与模型组相比,显著降低瘤重。知母皂苷AⅢ呈剂量依赖性抑制U87MG细胞的体外增殖;呈剂量依赖性降低β-Catenin,Cyclin D1,Bcl-2的蛋白表达,同时升高p21在蛋白和基因水平的表达;降低ERK磷酸化水平,抑制β-Catenin的核转移,同时提高p38和JNK蛋白的磷酸化水平。联用JNK抑制剂SP600125和p38抑制剂SB203580后可逆转知母皂苷AⅢ处理而提高的p21和降低的β-Catenin的蛋白表达。知母皂苷AⅢ部分通过干预MAPK及Wnt/β-Catenin信号通路而抑制脑胶质瘤U87MG的增殖。

落地生根冻干粉对人癌细胞增殖和细胞凋亡的影响

为初步研究落地生根冻干粉(BPFP)对人癌细胞增殖的影响,应用CCK-8实验检测不同质量浓度BPFP对人肝癌HepG2细胞、人脑胶质瘤U87细胞和人前列腺癌DU145细胞增殖的影响;用Hoechst凋亡试剂盒检测不同质量浓度BPFP对细胞凋亡的影响.实验结果显示:BPFP对HepG2、U87和DU145细胞生长均有一定的抑制作用;BPFP作用48 h对HepG2细胞增殖抑制作用明显,抑制率在82%以上,其抑制程度与时间呈依赖性,但与剂量不呈依赖性;质量浓度为150μg/mL以上作用48 h对U87细胞增殖抑制明显,增殖抑制率大于80%;质量浓度为250μg/mL作用48 h对DU145增殖抑制作用最强,达到100%.BPFP作用24 h对HepG2、U87和DU145细胞凋亡均有一定的促进作用.实验结果提示,BPFP对HepG2、U87和DU145细胞的增殖有抑制作用,可能与BPFP能促进细胞凋亡有关.