葛花总黄酮通过TLR4/MyD88/NF-κB通路减轻糖氧剥夺对人脑血管内皮细胞损伤的机制

目的 探讨葛花总黄酮(TFG)通过Toll样受体(TLR)4/髓样分化的初级应答(MyD)88/核因子(NF)-κB通路减轻糖氧剥夺(OGD)对人脑血管内皮细胞损伤的机制。方法 通过培养人脑微血管内皮细胞(HBMEC),建立OGD模型细胞模型,将细胞分为对照组(Control)组、OGD模型(OGD)组、OGD模型+TFG低、高剂量(OGD+TFG-L、OGD+TFG-H)组、OGD模型+TFG+pcDNA(OGD+TFG+pcDNA)组和OGD+TFG+TLR4(OGD+TFG+TLR4)组。采用噻唑蓝(MTT)检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;Western印迹检测B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)、裂解的胱天蛋白酶(Cleaved cas)3和TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白的表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、白细胞介素(IL)-6、IL-10和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达。结果 OGD组细胞活力、SOD、GSH-Px活性明显低于Control组,细胞凋亡率、IL-6、IL-10、TNF-α水平、Bax、Cleaved cas3、TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白表达明显高于Control组(P<0.05)。OGD+TFG-L组、OGD+TFG-H组细胞活力、SOD、GSH-Px活性明显高于OGD组,细胞凋亡率、IL-6、IL-10、TNF-α水平、Bax、Cleaved cas3、TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白表达明显低于OGD组(P<0.05)。OGD+TFG+TLR4组细胞活力、SOD、GSH-Px活性明显低于OGD+TFG+pcDNA组,细胞凋亡率、IL-6、IL-10、TNF-α水平、TLR4、Bax、Cleaved cas3蛋白表达明显高于OGD+TFG+pcDNA组(P<0.05)。结论 TFG能够减缓糖氧剥夺诱导的HBMEC凋亡、氧化应激和炎症反应,促进细胞增殖,其作用机制与TLR4/MyD88/NF-κB通路有关。

Nf1基因沉默促进人脑血管内皮细胞的增殖

目的抑制1型神经纤维瘤病(NF1)发病基因Nf1在人脑血管内皮细胞(HBMECs)中的表达并检测HBMECs增殖改变情况,以研究NF1相关脑血管病发病机制。方法设计并合成3对Nf1基因小干扰RNA(siRNA)及其阴性对照;使用脂质体转染法将siRNA转染进HBMECs,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)及Western blot法分别检测Nf1基因mRNA和蛋白质表达情况。将筛选出的具有最佳Nf1基因沉默效应的siRNA转染进HBMECs,并设置阴性对照,使用细胞计数试剂盒8(CCK8)法与细胞计数法检测细胞增殖情况。结果3对siRNA均具有一定的Nf1基因沉默效应,其中siRNA C基因沉默效应最佳,Nf1基因mRNA相对转录水平是对照组的(58.65±0.62)%,神经纤维瘤蛋白(neurofibromin)的相对表达量为对照组的(29.447.10)%,差异均有统计学意义(P<0.01)。CCK8法与细胞计数法结果均显示Nf1基因沉默后HBMECs 5d中有4d实验组相对细胞数多于对照组(P<0.05)。结论干扰HBMECs Nf1基因后,其增殖活性增强,这可能是NF1相关脑血管病的发病机制之一。

circZNF652靶向调控miR-17-5p对糖氧剥夺诱导的人脑血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨circZNF652对糖氧剥夺(OGD)诱导的人脑血管内皮细胞(HBVEC)损伤的影响及其对miR-17-5p的调控作用。方法OGD诱导HBVEC建立细胞损伤模型,HBVEC中分别转染si-NC、si-circZNF652、miR-NC、miR-17-5p mim-ics后进行OGD处理,共转染si-circZNF652与anti-miR-NC、si-circZNF652与anti-miR-17-5p后进行OGD处理;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测circZNF652与miR-17-5p表达量;根据试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;CCK-8实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因实验检测circZNF652与miR-17-5p的靶向关系;Western印迹检测蛋白水解酶(CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-12蛋白表达量。结果OGD诱导的HBVEC中circZNF652表达水平与LDH、MDA水平明显升高,凋亡率与CHOP、Caspase-12蛋白水平明显升高,miR-17-5p表达水平与SOD活性明显降低,细胞存活率明显降低(P<0.05);转染si-circZNF652或转染miR-17-5p mimics后OGD诱导的HBVEC中miR-17-5p表达水平与SOD活性明显升高,细胞存活率明显升高,LDH、MDA水平明显降低,凋亡率与CHOP、Caspase-12蛋白水平明显降低(P<0.05);circZNF652可靶向调控miR-17-5p;共转染si-circZNF652与anti-miR-17-5p可明显逆转转染si-circZNF652对细胞增殖、氧化应激及凋亡的作用。结论干扰circZNF652表达可靶向调控miR-17-5p促进细胞增殖,缓解氧化应激,并通过抑制内质网应激介导的细胞凋亡途径进而减轻OGD诱导的HBVEC损伤。

Hcdc14A在体外糖尿病环境下人脑血管内皮细胞损伤中的作用

目的 观察体外糖尿病环境如高糖、高游离脂肪酸（FFA）和低氧刺激对人脑血管内皮细胞（HBVEC）人类细胞分裂周期蛋白14A（Hcdc14A）和相关周期蛋白表达及细胞增殖、凋亡的影响,进而探讨糖尿病诱发脑血管内皮细胞损伤的新机制.方法 分别采用不同条件的高糖、FFA和低氧刺激HBVEC,RT-PCR检测Hcdc14A的mRNA表达,Western印迹法检测Hcdc14A及相关周期蛋白周期素B、周期素D、周期素E和p53的蛋白表达,XXT法检测细胞增殖率,流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果 不同浓度葡萄糖（10、15和25 mmol/L）和FFA（50、100及200 μmol/L）分别孵育HBVEC 72 h,或以25 mmol/L葡萄糖、200μmol/L FFA分别刺激24、48和72 h,均呈剂量和时间依赖性地降低Hcdcl4A的mRNA和蛋白表达（均P＜0.05）,同时下调周期素B、周期素D和周期素E的蛋白表达（均P＜0.05）,上调p53蛋白表达（均p＜0.05）,低氧刺激也显示相似结果.联合刺激（葡萄糖25 mmdl/L＋FA 200 μmol/L）48 h后,再进行低氧刺激24 h后,与正常对照组、高糖组、高FFA组及低氧组相比,高糖＋高FFA＋低氧联合刺激组显著下调HBVEC的Hcdc14A mRNA和蛋白表达（均P＜0.05）,同时下凋周期素B、周期素D和周期素E的蛋白水平（均P＜0.05）,并上调p53蛋白水平（均P＜0.05）.与正常对照组、高糖组、高FFA组及低氧组相比,高糖＋高FFA＋低氧联合刺激组抑制HBVEC增殖的作用最为明显（40.7％±12.1％对100.0％±10.2％、67.5％±12.1％ 、55.3％±11.2％和64.4％ ±11.3％,均P＜0.05）,并使细胞凋亡率明显增加（22.5％±1.77％对5.7％±0.83％、9.3％±0.95％、16.3％±1.69％和16.3％ ＋1.15％,均P＜0.05）.结论 细胞周期调控蛋白Hcdc14A可能在糖尿病诱发脑血管内皮细胞损伤中起重要作用,可能是参与细胞损伤的主要信号通路.

阪崎杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞对细胞骨架的影响

目的观察阪崎杆菌侵袭人脑血管内皮细胞后,细胞骨架中微丝和微管的变化。方法用荧光染色技术观察阪崎杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞后,细胞骨架中的微丝和微管的变化,观察微丝和微管的抑制剂对阪崎杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞的影响。结果阪崎杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞后,细胞骨架结构发生明显的改变,微丝和微管部分断裂,模糊,散在分布,微丝抑制剂(细胞松弛素D)和微管抑制剂(秋水仙素)可以抑制阪崎杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞。结论阪崎杆菌侵袭人脑血管内皮细胞破坏细胞骨架结构,微丝和微管抑制剂抑制阪崎杆菌侵袭。

鼠李糖乳杆菌培养上清液通过抑制NF-κB通路预防大肠杆菌性脑膜炎

目的体外探讨鼠李糖乳杆菌上清液(LGG-CM)能否通过抑制NF-κB通路来阻断大肠杆菌K1(E.coli K1)株引起的细菌性脑膜炎。方法用人脑微血管内皮细胞(HBMEC)构建体外血脑屏障模型;采用免疫印迹研究LGG-CM能否抑制E.coli K1激活NF-κB通路;通过侵袭实验和中性粒细胞迁移实验,研究LGG-CM能否抑制细菌侵袭和中性粒细胞迁移;通过免疫印迹研究黏附分子CD44和紧密连接蛋白ZO-1的表达;免疫荧光检测ZO-1蛋白的细胞内分布;用Transwell建立体外血脑屏障模型,通过跨细胞内皮电阻(TEER)值和细菌迁移实验评价LGG-CM对细胞屏障完整性的保护作用。结果免疫印迹结果表明LGGCM能抑制E.coli K1激活NF-κB通路,藉此抑制E.coli K1的侵袭和中性粒细胞迁移。同时,LGG-CM可抑制E.coli K1上调CD44蛋白和下调紧密连接蛋白ZO-1。此外,LGG-CM能够明显减缓TEER值的降低和抑制E.coli K1穿越体外血脑屏障。结论体外实验表明,LGG-CM能够通过抑制NF-κB通路激活、阻断E.coli K1侵袭和中性粒细胞迁移及维护血脑屏障完整性来预防E.coli K1引起的细菌性脑炎。