儿童3型人腺病毒感染64例临床特点分析并文献复习

人腺病毒(HAdV)是儿童呼吸道感染的常见病原体之一,感染率呈逐年上升趋势,在儿童呼吸道感染中占5%~10%[1],2%~10%的细支气管炎、4%~10%的肺炎与人腺病毒感染密切相关[2]。人腺病毒可分为A~G七个亚属,其中B亚属的3型占儿童呼吸道感染的50%左右[3],人群对3型人腺病毒普遍易感。现整理并分析儿童感染3型人腺病毒后的临床特点、治疗与转归情况,旨在为临床诊治提供参考。

一例番鸭3型腺病毒感染的实验室诊断和序列分析

为确诊昆明某番鸭场送检病死番鸭的致病原因,对病死番鸭进行病理剖检、细菌分离培养、PCR检测以及序列分析。结果显示,所检样品无细菌感染,鸭3型腺病毒(DAdV-3)PCR核酸检测结果为阳性,其他病原核酸检测结果均为阴性;阳性PCR产物测序,基因序列比对及进化树分析,发现该样品基因序列与DAdV-3为同一进化树分支,同源性为100%。结合病理剖检特征、PCR检测及临床症状,诊断该番鸭场为鸭3型腺病毒感染。研究结果为DAdV-3感染的防控提供了参考。

一株鸭腺病毒3型的分离、鉴定及致病性分析

从现地分离一株3型鸭腺病毒(duck adenovirus 3,DAdV-3)并命名为DAdV-3 YN株,分析该毒株的基因特征与致病特性,本研究选用LMH细胞进行病毒分离与纯化,并对YN株的hexon、penton base、fiber1和fiber2基因进行测序分析。通过腿部肌肉注射病毒感染7日龄番鸭,观察番鸭精神状态,记录体重变化、脏器剖检特征、组织病理学变化、计算脏器载毒量、泄殖腔拭子排毒量以及血清生化等数据,同时测定法氏囊与脾内凋亡相关基因转录水平以探究YN株对宿主免疫功能的影响。结果显示,番鸭感染YN株后体重增长受到显著抑制(P<0.01;P<0.0001);体内各脏器均出现不同程度病变,攻毒组鸭的肝组织与肾组织脏器系数均大于对照组且在攻毒后第7天差异极显著(P<0.01);攻毒组番鸭血清内丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和尿素氮含量均显著高于对照组(P<0.001,P<0.0001);同时,法氏囊与脾内细胞凋亡相关基因mRNA水平显著上升(P<0.01;P<0.001)。以上结果提示,YN株感染7日龄番鸭后,可以导致肝和肾等脏器损伤,同时可以诱导法氏囊与脾内细胞凋亡从而影响番鸭免疫功能。

犬腺病毒2型E3基因自然缺失毒株的分离鉴定及其致病性

犬腺病毒2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)是重要的犬呼吸道病原,本试验旨在调查CAV-2在川渝部分地区的流行情况及其分离毒株致病性。采用检测CAV-2的特异性PCR方法,对2021—2022年采集自川渝部分地区的121份患呼吸道疾病的犬鼻咽拭子进行检测,分离流行毒株并研究其基因组特征及致病性。结果显示:CAV-2的阳性率为29.8%,值得注意的是,69.4%的阳性样本在E3基因存在9个核苷酸连续缺失(1035—1043 nt),导致4个氨基酸缺失(345—348 aa)。成功分离出1株E3基因自然缺失毒株,噬斑纯化后的细胞半数感染值为10-9.46TCID50·0.1 mL^(-1);该毒株经口鼻感染幼犬后,幼犬出现体温升高、打喷嚏、流鼻涕及咳嗽等典型呼吸道症状。该分离毒株基因组全长31786 bp,与GenBank中CAV-2基因组的核苷酸相似性为98.8%~98.9%。与已知的CAV-2基因组相比,本研究分离毒株除了E3基因的独特突变外,还在Fiber、Hexon和E1A等蛋白有独特的氨基酸突变,使得该毒株在基因组进化树上区别于已知的CAV-2毒株。本试验首次获得了中国CAV-2毒株的基因组序列,发现了E3基因的自然缺失现象,有助于了解CAV-2的流行及遗传进化。

牛腺病毒3型感染状况及其fiber轴区基因检测

本研究旨在通过TB Green Real-time PCR的方法对国内6个省(四川省、山西省、河南省、河北省、江苏省和内蒙古自治区)的9个规模化养牛场140份以流鼻涕、发热、咳嗽、呼吸困难为特征的病牛呼吸道鼻拭子样本开展牛腺病毒3型(bovine adenovirus type 3,BAdV-3)感染状况调查,并对其中的阳性样本进行fiber轴区基因检测。结果显示,140份样品中BAdV-3阳性率为36.4%,除河北省以外,其余各省均有BAdV-3检出,其中,四川及河南省检出率最高,分别达到82.9%(29/35)和83.3%(10/12)。其中,传统型占总阳性比的80.4%,fiber轴区缺失毒株占总阳性样本的19.6%。缺失位置与数量一致,轴区连续缺失237个碱基对(79个氨基酸),且缺失型仅在四川和河南两省检出,检出率分别为24.1%(7/29)和30%(3/10),场群阳性率分别为100%(2/2)和100%(1/1)。结果表明,BAdV-3已在我国牛场中广泛分布,目前流行的主要以传统型毒株为主,fiber轴区缺失毒株在我国具有独特的地域分布,主要在四川和河南省流行。

鸭腺病毒3型Fiber-2蛋白在酵母细胞中的表达及免疫原性研究

[目的]利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)系统高效表达鸭腺病毒3型(DAdV-3)Fiber-2蛋白,用于制备安全、高效、低成本的鸭腺病毒亚单位疫苗。[方法]以食品安全级的马克斯克鲁维酵母为宿主,对DAdV-3 Fiber-2蛋白进行重组表达,建立高密度发酵和纯化工艺,获得目的蛋白并制备成亚单位疫苗,然后进行动物试验。试验分为低剂量组(琼扩效价1∶64,每羽34μg)、高剂量组(1∶128,每羽68μg)、空白组和攻毒对照组,在免疫后第10天和第21天采血检测血清中的抗体水平,攻毒7 d后采肛拭子检测排毒量;通过抗体水平和排毒量评估该亚单位疫苗的保护效果。[结果]通过SDS-PAGE、Western blot和琼脂糖凝胶扩散(AGP)试验验证fiber-2基因在酵母中成功表达。重组菌经高密度发酵,目的蛋白纯化后检测其表达水平,琼扩效价可达1∶128。动物试验结果显示,疫苗免疫组在免疫后第21天所测得血清中的抗体水平显著高于空白组;疫苗免疫组在攻毒7 d后的排毒量显著低于攻毒对照组。[结论]DAdV-3 Fiber-2蛋白能在马克斯克鲁维酵母细胞中进行高效表达,并且用该蛋白制备的亚单位疫苗对鸭3型腺病毒具有一定的保护作用。

人腺病毒3型六邻体基因的克隆与鉴定

目的 克隆人腺病毒 3型 (Ad3)六邻体 - L 1(Hexon- L 1)、六邻体 - L 2 (Hexon- L 2 )区基因 ,构建含有该基因的重组质粒 ,并进行测序鉴定 ,为进一步构建表达载体 ,制备基因工程疫苗打下基础。方法 从 Ad3感染的 He L a细胞中提取 Ad3DNA,用 PCR方法扩增 Hexon- L 1、Hexon- L 2基因 ,将得到的片段定向克隆到克隆载体 p U C19质粒中 ,对克隆片段进行 DNA测序鉴定。结果 构建了重组质粒 p UC19Hexon,测序结果与 Genebank中该序列进行同源性比较证明克隆的片段为 Ad3六邻体序列。结论 成功克隆了 Ad3的 Hexon- L 1、Hexon- L 2区基因。

一株3型牛腺病毒的分离与鉴定

本研究于2009年由患急性呼吸道疾病牛的鼻拭子中分离获得一株病毒,经形态特征、血清学试验及PCR鉴定表明,该病毒与牛腺病毒3型(BAV-3)相似。对其E2A基因进行序列测定,并与GenBank中登录的BAV1型、3型、4型及人、绵羊、鼠等其它种属来源的腺病毒E2A基因序列进行比对及系统进化分析,结果显示该分离株与BAV-3的同源性为95.5%。经MEGA4软件分析,分离株与BAV-3验证值为100,表明其为BAV-3,并命名为BAV-3HLJ0955株。对该分离株热敏感试验表明,BAV-3 HLJ0955在56℃ 30min可被完全灭活,属于BAV第一群。这是国内首次分离获得BAV-3的报道。

鸭腺病毒3型PCR检测方法的建立

鸭3型腺病毒(Duck adenovirus type 3,DAdV-3)为近年来新发的以引起鸭肝脏肿大出血、肾脏大面积出血点为特征的鸭群新发疫病。为建立特异性的检测DAdV-3的PCR方法,研究通过分析鸭群中鸭腺病毒A型(DAdV-A)、鸭源禽腺病毒4型(FAdV-4)、鸭2型腺病毒(DAdV-2)和DAdV-3的Fiber 2基因特征,建立特异性检测DAdV-3的PCR方法。结果显示:优化后的PCR方法最佳退火温度为54℃,对DAdV-3扩增片段大小为548 bp;敏感性强,最低检测限为36.4 pg;特异性好,对DAdV-A、FAdV-4、鸭病毒性肠炎(DEV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭圆环病毒(DuCV)和鹅多瘤病毒(GHPV)均无特异性扩增。表明该方法可有效用于开展新发DAdV-3的流行病学调查。

鸭3型腺病毒的分离鉴定及其fiber基因分析

为确诊引起福建某番鸭场以肝脏肿大出血为特征的病原,采用病毒分离、PCR检测、动物回归试验、电镜观察、组织病理学诊断、fiber基因序列测定与分析等方法进行研究。结果显示:所采样品盲传15代后获得病毒,PCR可以扩增出鸭3型腺病毒(DAdV-3)的特异性片段,分离病毒可引起3日龄番鸭发病死亡,死亡率为28.6%。人工感染死亡鸭的肝脏超薄切片呈现大量晶格状排列的典型禽腺病毒颗粒,肝脏的组织病理学以'包涵体肝炎'病变为特征。其fiber基因与已报道的DAdV-3毒株核苷酸同源性均为100%。以上结果证实分离的病原为DAdV-3。本试验为DAdV-3的诊断提供了科学依据。

猪腺病毒3型Hexon蛋白多克隆抗体制备与免疫活性鉴定

本研究旨在制备猪腺病毒3型(PADV-3)Hexon蛋白多克隆抗体。试验构建重组原核表达载体pET28a-Hexon,IPTG诱导重组蛋白的表达并进行Western blotting鉴定,目的蛋白与佐剂混合、乳化制备免疫原,免疫家兔制备Hexon蛋白多克隆抗体。采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性与抗体滴度。结果显示,Hexon蛋白原核表达以包涵体形式存在,分子质量约为105ku;真核细胞表达的Hexon蛋白均定位于HEK293细胞质内,细胞核内无分布;IPMA测定所制备的多克隆抗体滴度为1∶1 600,该抗体与体外培养的PADV-3及稳定表达Hexon蛋白的细胞均呈特异性反应。结果表明本试验制备的PADV-3型Hexon蛋白多克隆抗体免疫活性和特异性良好。

人3型腺病毒六邻体基因表达质粒的构建及表达

目的 表达人腺病毒 3型六邻体蛋白 ,为制备基因工程疫苗打下基础。方法 BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组克隆质粒pUC19Hexon和载体pQE31,将得到的目的片段定向连接到表达载体pQE31中 ,对目的片段进行DNA测序鉴定 ,IPTG诱导高效表达。结果 构建了表达重组质粒pQE31Hexon ,测序鉴定了克隆序列的准确性。在大肠杆菌中成功地表达了Ad3六邻体蛋白。结论 成功表达了Ad3的六邻体蛋白。

鸭腺病毒3型LAMP快速检测方法的建立

鸭腺病毒3型(DAdV-3)是我国鸭群中出现的一种新型腺病毒,属于腺病毒科禽腺病毒属成员。为建立DAdV-3的快速检测方法,本研究根据DAdV-3的fiber2基因,设计特异性的LAMP检测引物,构建重组质粒标准品pT-DAdV-3,经各反应条件优化,建立了DAdV-3 LAMP快速检测方法。结果显示,建立的LAMP检测方法最佳反应条件为64℃40 min;该方法仅对DAdV-3呈阳性反应,与番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源减蛋综合征病毒等其他常见鸭源传染病病原均无交叉反应,特异性强。该方法对重组质粒标准品的最低检测限为50拷贝/μL;利用本研究建立的LAMP方法、前期建立的PCR方法和基于MGB探针的荧光定量PCR方法对临床收集的66份鸭组织病料样品进行检测,结果显示阳性率分别为13.63%(9/66)、13.63%(9/66)和15.15%(10/66);且LAMP检测的阳性样品经PCR方法检测和荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究首次建立了检测DAdV-3的LAMP方法,该方法快速敏感、特异性强,为该病的流行病学调查提供技术支撑。

病毒唑体外抗腺病毒3型作用

目的了解病毒唑在体外抑制腺病毒3型(ADV3)作用的效果和强度。方法采用细胞病变抑制实验观察病毒唑在人宫颈癌传代(Hela)细胞中对腺病毒3型的抑制作用。结果病毒唑半数中毒浓度(TC50)为2056·13μg/ml;抑制腺病毒3型的半数有效浓度(EC50)为53·03μg/ml,治疗指数(TI)为38·77;病毒唑对腺病毒3型的抑制作用存在量效关系;在感染后10h以内给药,病毒唑能够有效地抑制腺病毒3型的复制。结论病毒唑在Hela细胞中对腺病毒3型有明显的抑制作用。

腺病毒3型引起的儿童咽结膜炎暴发

目的 分析腺病毒3型引起的咽结膜炎暴发的流行病学特征。方法 对幼儿园发生的咽结膜炎暴发病例进行发病经过和传播因素调查,采集眼、咽拭子进行病毒分离和鉴定,并检测双份血清抗体。结果 病例主要发生在幼儿园2个小班,罹患率分别为71.8％和89.7％,流行曲线呈现2个高峰,共持续17天,由幼儿间密切接触经呼吸道传播。患儿龄4～5岁,高热39℃以上占90.0％,持续高热3天以上占87.9％;眼结膜充血占57.6％,伴流涕、咽痛等症状者占69.7％;推测最短潜伏期为1～4天。经Hep-2细胞培养分离到病毒19株,采用中和试验鉴定为Ad3,与PCR检测结果一致。用标准Ad3和自身分离到的毒株对24例患儿双份血清进行检测,抗体滴度呈4倍升高;进一步对毒株进行限制性内切酶分析,符合Ad3a2图谱特征。结论 疫情是由腺病毒3型引起的咽结膜炎暴发。

一起由腺病毒3型引起的儿童咽结合膜热暴发

目的分析腺病毒3型引起的咽结合膜热暴发流行病学特征和流行因素。方法通过描述性流行病学分析方法和病例对照的研究方法,对幼儿园发生的咽结合膜热暴发病例进行发病经过和传播因素的调查,采集患者咽拭子进行病毒分离,核酸鉴定,采集血清进行病毒抗体检测。结果自2004年6月21日～7月19日,幼儿园349名幼儿中共有258人发病,罹患率73.9%。病例分布在不同年级、班别间无差别。流行曲线呈单峰型。在日托幼儿中,参加游泳幼儿的罹患率明显高于未参加游泳的幼儿(X2=28.96,P<0.001),且随游泳次数的增多,罹患率升高。实验室结果,用PCR检测27例病人的咽拭子标本,10份腺病毒基因阳性(37.0%),其中6份进行了基因序列测定,并对获得的基因序列(290bp)进行分析,显示与腺病毒3型同源性达97%,可认为PCR扩增物为3型腺病毒。同时还检出呼吸道合胞病毒、I型副流感病毒等其它病原体。结论此次疫情主要的病原体是腺病毒3型,幼儿主要通过在幼儿园游泳池戏水以及接触传播的途径引起咽结合膜热暴发,同时合并其它多种病原体感染。

犬2型腺病毒E3区缺失性表达载体的构建及外源基因表达

为构建可用于同源重组或体外重组的犬腺病毒 (canim e adenovirus,CAV) E3区缺失性表达载体 ,在克隆的 E3区两末端设计并合成了 2对突变引物 ,在引物中分别引入 1个 Bgl 酶切位点 ,以 p BE3质粒为模板 ,经 2次点突变后 ,得到含有 2个 Bgl 位点的重组质粒 p BE3M。该质粒经 Bgl 酶切后自连得到 E3区缺失的质粒 p BE3Δ。在 p BE3Δ质粒的 Bgl 位点加入接头后 ,产生含多个酶切位点的质粒 p BE3L,经相应的酶切鉴定 ,证明突变、缺失和接头连接正确后 ,利用 p BE3L 分别构建了带有和不带有外源性启动子的绿色荧光蛋白基因的重组表达质粒 ,并分别进行转染以检测其表达。结果显示 ,p BE3L CGFP质粒在转染 DK细胞后 ,于 36 h即可观察到荧光 ,72～ 96 h无明显差别 ,传 3代后仍可见表达荧光的细胞 ;而 p BE3L GFP质粒转染 DK细胞后经检测无表达。结果表明 ,构建的 E3区缺失性载体不能利用 E3区自身的启动子进行目的基因的表达 ,外源性启动子的加入是必要的。

猪腺病毒血清3型PCR检测方法的建立及其初步流行病学调查

为建立一种猪腺病毒3型（PADV-3）的检测方法，本研究根据PADV-3E1B基因保守序列设计一对引物，建立了PcR检测方法。特异性试验结果显示，该方法仅对PADV．3扩增出247bp的目的片段。而对猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪博卡病毒、猪传染性胃肠炎、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、大肠杆菌、猪链球菌均无特异性扩增；敏感性试验结果显示，该方法对PADV-3最低检测量为3．7×10-5拷贝／μL。应用该方法对我国四川省23个规模化猪场进行流行病学调查，结果显示PADV．3阳性率达到14．72％，在腹泻猪群中阳性率为17．34％，并且显著高于非腹泻猪群（6．41％），PADV．3在保育猪群中感染率最高（26．32％），表明PADV．3在我国四川省猪群中广泛流行。本研究建立的PCR检测方法特异性强、灵敏度高，可以应用于猪群中PADV．3的流行性调查。

人3型腺病毒GZ13株的分离鉴定及六邻体蛋白的分子进化研究

目的分离鉴定1株引起儿童急性支气管肺炎的腺病毒及分析其主要中和抗原六邻体蛋白的分子进化趋势。方法采用荧光定量PCR方法,对1例引起严重支气管肺炎的患儿咽拭子进行检测,并从中分离得到1株腺病毒(命名为GZ13)。利用型特异性引物PCR进行初步亚型鉴定;克隆该株腺病毒完整的六邻体蛋白基因,测序和序列比对,确定其型别;同时与GenBank上人3型腺病毒的六邻体蛋白进行同源性比对,分析预测六邻体蛋白的分子进化趋势。结果该临床标本经荧光定量PCR鉴定为腺病毒强阳性,型特异性引物PCR初步鉴定为3型;完整六邻体基因比对最终确定为人3型腺病毒;GZ13株与我们先前分离的GZ01、GZ02株及台湾地区分离株核苷酸及氨基酸的同源性均大于99%。结论引起该例儿童急性支气管肺炎的病原体为人3型腺病毒,目前在广州以及台湾地区流行的3型腺病毒仍属同一流行株,其主要中和性抗原六邻体蛋白未出现明显变异,这对今后开发研究人3型腺病毒疫苗及药物具有重要指导意义。

重组人3型腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人3型腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体并对单抗进行鉴定。方法用纯化的重组六邻体蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得4株分泌抗腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得单抗。使用ELISA、Western blot和中和实验等方法鉴定单抗的敏感性、特异性以及中和活性。结果ELISA和免疫印迹结果表明这4株单抗与腺病毒六邻体蛋白可以特异性结合。而且,4C6株单抗具有中和活性。结论获得了4个单抗为腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体,可用于3型腺病毒的早期诊断和药物治疗的研究。