肠道腺病毒41型(F亚群)单克隆抗体制备及其鉴定

为了建立一种简便快速的检测肠道腺病毒41型（Ad41）ELISA方法，利用纯化Ad41抗原免疫BALB／c小鼠．将该小鼠脾细胞和SP2／0细胞融合，通过对阳性克隆株进行筛选、检测和克隆化等，成功地合成了4株Ad41杂交瘤，并对该杂交瘤进行了一系列鉴定。在特异性方面，该杂交瘤株产生的抗体与Ad41发生阳性反应，与Ad40发生部分交叉反应，与对照组的轮状病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒3、7、21型等病毒无反应。

腺病毒41型致缺乏腺病毒E_1区的A_(549)细胞产生病变的实验研究

首次报道了腺病毒41型TaK株致缺乏腺病毒E1基因功能的A(549)细胞产生细胞病变。该病变与病毒感染的稀释度存在量一效关系。核酸杂交示1:10与1:20稀释度组病毒核酸含量相近，但明显高于1:50组。免疫荧光技术分析显示各稀释度组病毒蛋白表达起始时相均在病毒感染后的2～3d。

鸡DDX 41基因克隆表达、细胞定位及其在禽腺病毒4型感染调控天然免疫中的作用

为获得鸡DDX41(chDDX41)的原核表达蛋白,探讨chDDX41的细胞定位及其在禽腺病毒4型(FAdV-4)感染引起的天然免疫中的作用。根据GenBank中chDDX41基因序列,设计特异性引物,以LMH细胞cDNA为模板扩增,将扩增序列连接至pET-32a、pCAGGS-HA、pCMV-3×Flag和pmCherry-C1空载体,构建重组质粒。将pET-32a-chDDX 41转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达。利用激光共聚焦显微镜观察chDDX41在鸡肝癌细胞(LMH)和鸡巨噬细胞(HD11)中的亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测在LMH细胞中过表达chDDX 41对IFN-β等细胞因子表达量的影响。结果表明,克隆得到1854 bp的chDDX 41基因,共编码617个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白pET-32a-chDDX41主要以可溶性蛋白的方式在上清液中表达,经Western Blot鉴定,在90 ku左右有特异性条带,与预期结果一致;chDDX41在LMH和HD11细胞中主要定位在细胞核;FAdV-4感染过表达chDDX 41基因后的LMH细胞,发现IFN-β、IL-6、IL-1β和IL-8等细胞因子在mRNA水平上的表达量上调,表明chDDX41参与了FAdV-4引起的天然免疫应答。研究结果可为进一步研究DDX 41基因功能及其在天然免疫中的分子机制提供参考。

人腺病毒41型(HAdV-41)在293TE细胞中的形态发生研究

为研究人腺病毒41型(Human adenovirus type 41,HAdV-41)的形态发生过程,将其接种于293TE细胞,收获细胞制作超薄切片并染色,通过透射电子显微镜进行观察。结果显示HAdV-41可以通过非网格蛋白陷窝、网格蛋白陷窝及直接穿入的方式进入细胞;细胞微绒毛可参与HAdV-41进入细胞的过程;进入细胞的HAdV-41包裹于囊泡内、溶酶体内或游离于细胞浆内;HAdV-41最终以游离状态靠近细胞核核孔,并释放核糖核蛋白(Ribonucleoprotein,RNP)进入细胞核;子代HAdV-41最先出现在细胞核内;在HAdV-41复制过程中出现纤维丝状包涵体、致密包涵体及条索状致密包涵体,包涵体结构与HAdV-41的形态发生过程有关;最终,HAdV-41以裂解细胞方式释放。本研究揭示了HAdV-41形态发生的部分过程,进一步丰富了HAdV-41的生物学信息。

2010⁃2019年北京地区腹泻患儿中人腺病毒41型Fiber基因分子特征和进化分析

人腺病毒41型(Human adenovirus 41,HAdV-41)是引起儿童腹泻的重要病原之一。为了解北京地区腹泻儿童中HAdV-41 Fiber基因的分子变异和遗传进化特征,选取2010-2019年首都儿科研究所附属儿童医院门诊腹泻患儿HAdV-41阳性的粪便标本,扩增Fiber全基因,使用多种生物信息学软件进行系统发生、遗传进化、种群演变和选择压力等分析。结果显示HAdV-41本地毒株存在1644碱基(547氨基酸)和1689碱基(562氨基酸)两种长度的Fiber基因,截短的15个氨基酸位于Fiber蛋白纤维轴区。Mann-Whitney U秩和检验提示检测到感染短Fiber基因的HAdV-41的患儿年龄更小(P=0.036)。同源性分析结果显示Fiber基因的核苷酸和氨基酸序列同源性均大于97%,主要分为四个进化分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),其中Ⅰ和Ⅲ是主要的流行分支,分支Ⅰ主要在国内流行,而分支Ⅲ全球均有流行。HAdV-41共祖起源可追溯到1856年,平均进化速率每年为6.81×10^(-5)碱基替换/位点,10年间理论有效种群一直比较平稳呈缓慢下降趋势。压力选择分析表明,一个正向和三个负向选择位点均位于Fiber蛋白的纤维轴区。上述结果表明2010-2019年间不同进化分支的HAdV-41在北京地区流行,进化速率稳定。Fiber蛋白轴区存在两种不同类型的氨基酸缺失。

腺病毒41型感染致儿童腹泻一例临床表现及病毒基因组学特征分析

目的针对消化道疑似感染病例,采用高通量测序技术筛查病原体,并测定其全基因组序列,阐明其基因组及进化特征。方法通过对原因不明腹泻患儿的粪便进行病原体高通量基因测序,然后拼接其全基因组序列,采用最大似然法(选择bootstrap为1000)绘制主要抗原蛋白六邻体(hexon)、五邻体(penton)和纤维突蛋白(fiber)的进化树,分析进化特征;运用Recombination Detection Program version 4(RDP4)软件进行序列重组分析;使用软件CLC Genomics Workbench 9.0分析突变位点。结果患儿临床表现主要为发热、呕吐、腹泻伴抽搐,通过对腹泻患儿的粪便样品高通量测序,使用本实验室高通量测序数据分析程序检出41型腺病毒(HAdV-41)。进一步测序和拼接获得该病毒全基因组序列,其基因组全长34 138bp。序列比对显示该病毒核苷酸序列与已报道序列的最高同源性为99%(Human adenovirus 41isolate NIVD103),属于腺病毒F亚属。对该病毒六邻体、五邻体和纤维突蛋白进行进化分析,其六邻体与HAdV-41isolate NIVD103,HAdV-41isolate SH/2015/D16亲缘关系较近,五邻体与HAdV-41isolate NIVD103,HAdV-41isolate SH/2015/D16,HAdV41isolate SH/2015/D240,HAdV-41isolate SH/2015/D381亲缘关系较近,纤维突蛋白与五邻体相似;对全基因组序列进行重组分析,未发现明显的重组迹象,但突变分析显示引起此例腹泻的病毒株基因组有多处突变。结论从一例腹泻患儿粪便中检出的病原体为新的41型腺病毒,该病毒基因组与以往发现的41型腺病毒有较大差异,其流行态势、致病性及免疫原性值得关注。

人腺病毒41型纤维丝状包涵体免疫电镜研究

为明确人腺病毒41型(Adenovirus type 41,Ad41)形态发生过程中形成的纤维丝状包涵体(Fibrillous inclusion body,FIB)是否含有Ad41的长纤维(Long fiber,LF)蛋白与短纤维(Short fiber,SF)蛋白。我们分别原核表达和纯化Ad41LF、SF的球部(Knob)蛋白,分别命名为LFK与SFK。以LFK和SFK分别免疫BALB/c小鼠,分别获得LFK抗血清和SFK抗血清。Western blot、间接免疫荧光和免疫负染结果表明,LFK抗血清和SFK抗血清分别与LF和SF结合,LFK抗血清和SFK抗血清之间无交叉反应,可以应用于免疫电镜标记。通过Ad41抗血清、腺病毒纤维单克隆抗体4D2、LFK抗血清与SFK抗血清分别对FIB进行免疫电镜胶体金标记,表明Ad41抗血清、腺病毒纤维单克隆抗体4D2、LFK抗血清与SFK抗血清均能标记FIB,说明FIB中含有Ad41长纤维蛋白和短纤维蛋白。

利用293细胞拯救和扩增重组人41型腺病毒

人41型腺病毒(Human adenovirus type 41,HAdV-41)为难养腺病毒,E1区缺失的HAdV-41无法在293细胞中拯救并扩增,本研究试图通过反向遗传学操作获得能够在293细胞中拯救并扩增的重组HAdV-41。首先,对原有的骨架质粒pAdbone41进行改造:通过重叠延伸PCR方法将HAdV-41的E3区基因替换为HAdV-5E4orf6编码区;将HAdV-5E1A增强子克隆至HAdV-41E4区启动子上游,获得新的骨架质粒pAdbone41E4EE。该骨架质粒与线性化的穿梭质粒pSh41-GFP在E.coli BJ5183菌株同源重组得到腺病毒质粒pAd41E4EE-GFP。pAd41E4EE-GFP经Pme I酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组病毒HAdV-41-E4EE-GFP。经过7轮扩增,超速离心纯化后获得1.0ml浓度为8.0×10^(10) vp/mL的重组腺病毒,其感染滴度为1.7×10~9 IU/mL,电子显微镜下观察可见形态完整的病毒颗粒,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定结果均表明携带HAdV-5E4orf6基因与E1A增强子基因的重组腺病毒载体构建正确。本研究利用反向遗传学技术对病毒载体进行改造,实现了在293细胞中培养E1区缺失的HAdV-41的目的。

南通地区腺病毒41型遗传变异及进化特征分析

F亚属的人类腺病毒(Human adenovirus,HAdV)与急性胃肠炎相关,是儿童急性胃肠炎住院的常见病因。本研究收集了712份<5岁儿童急性胃肠炎腹泻监测粪便标本,检出HAdV-F阳性52例,阳性检出率为7.30%。对Ct值<30的样本进行文库构建及测序,经Blast比对,得到的21条全基因组序列均为HAdV-41。与HAdV-41原型株相比较,Long fiber和Short fiber的核苷酸一致性低于全基因组核苷酸一致性。对HAdV-41全基因组的遗传进化分析显示,其分子进化速率为7.882×10^(-5)替换/位点/年(95%HPD,3.885×10^(-5)~1.234×10^(-4))。本课题研究对南通地区流行的HAdV-41进行了流行病学特征及基因进化特征分析,为南通地区HAdV-41所致疾病防控及病原溯源奠定了基础。