一株永生化的BRCA1突变型人卵巢表面上皮细胞系的建立及初步分析

背景与目的:BRCA1突变女性患乳腺癌和卵巢癌的风险增加,然而,目前尚不清楚BRCA1的单个等位基因突变如何导致癌症的发生,建立BRCA1突变的永生化细胞系可能为此类肿瘤发生的研究提供一个有用的模型。方法:从无锡市人民医院收治的1例携带BRCA1单等位基因185delAG突变患者的正常卵巢组织中分离和建立了卵巢表面上皮细胞系OSE236;然后利用反转录病毒系统介导的技术,用特异的shRNA稳定沉默p53表达,并导入人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)催化亚基和致癌基因HRAS,构建了系列细胞系并测定了其生长、衰老、细胞周期及致瘤特性。结果:成功建立了永生化细胞系OSE236/p53i/hTERT,但在该永生化细胞中导入致癌基因HRAS所构建的细胞系OSE236/p53i/hTERT/HRAS并未在体外和体内诱导肿瘤的转化。对该系列细胞系进行研究发现,与原代细胞系OSE236相比,永生化细胞系OSE236/p53i/hTERT中的β-半乳糖苷酶活性明显降低,而该BRCA1突变在所有系列细胞系中都存在,细胞周期随永生化明显增强,相关细胞周期调节蛋白(如CDK4、Cyclin B1/Cyclin D1/Cyclin E)上调,该永生化细胞系目前已在体外传代超过100代。结论:尽管未能在体外和体内将该永生化细胞系转化为癌细胞,但该携带BRCA1-185delAG突变的永生化人卵巢表面上皮细胞可能为研究BRCA1突变相关卵巢癌或乳腺癌提供了一个很有价值的细胞模型。

氯胺酮诱导人膀胱SV-HUC-1细胞凋亡的实验研究

目的:研究氯胺酮对人膀胱SV-HUC-1细胞凋亡的影响,初步探讨氯胺酮相关性膀胱功能损伤的发病机制。方法:培养人膀胱SV-HUC-1永生化上皮细胞系,用不同质量浓度的氯胺酮作用于SV-HUC-1细胞,作用不同时间后用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率,用Western印迹法检测Bax,Bcl-2,pro-caspase-3,cleaved caspase-3蛋白表达的含量。结果:与对照组相比,加入氯胺酮后SV-HUC-1细胞凋亡率增加,Bax表达增高,Bcl-2表达减弱,Bax与Bcl-2比值增高,pro-caspase-3表达减少,cleaved caspase-3表达增高(P<0.05),且与氯胺酮质量浓度和作用时间相关(P<0.05)。结论:氯胺酮能够明显促进人膀胱SV-HUC-1细胞的凋亡,并呈浓度依赖性和时间依赖性。

HIF-1α的RNA干涉可引起缺氧条件下人角膜上皮细胞VEGF表达下调和PEDF表达上调

目的探讨shRNA干扰HIF-1α表达对缺氧条件下人角膜上皮细胞(h CEC)血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响。方法针对HIF-1αmRNA序列靶点设计及合成3个小发夹RNA(shRNA),分别在体外转染自发永生化人角膜上皮细胞(S-ihCEC),转染后的S-ihCEC在1 mmol/L Co Cl2中缺氧诱导培养6 h,实时定量PCR检测HIF-1α、VEGF、PEDF的mRNA表达,Western blot法检测HIF-1α、VEGF的蛋白表达,ELISA检测PEDF的水平。结果与缺氧组比较,转染HIF-1αshRNA的S-ihCEC中HIF-1αmRNA表达下调、HIF-1α蛋白表达下调,VEGF mRNA表达下调、VEGF蛋白表达下调,PEDF mRNA表达上调(1. 22±0. 18)倍,PEDF水平升高。结论针对HIF-1α的shRNA能有效干扰S-ihCEC中HIF-1α的表达,并下调VEGF表达、上调PEDF的表达。

食管细胞系和癌组织中分化抑制因子Id-1mRNA的表达

目的:探讨分化抑制因子Id-1基因在食管癌组织和食管癌细胞系中的表达状况。方法:采用RT-PCR方法检测食管癌细胞系(EC109、EC1、EC18)、食管永生化上皮细胞系(NECA6-E6E7和NECA6-E6E7-hTERT)及20例食管癌及其配对癌旁正常组织中Id-1mRNA基因的表达状况。结果:EC109、EC1、EC18、NECA6-E6E7和NECA6-E6E7-hTERT均出现Id-1mRNA的表达。正常食管上皮中未见其表达,癌旁组织中Id-1mRNA阳性表达率为35%(7/20),癌组织中为65%(13/20),有升高趋势,但差异无统计学意义(χ2=3.6,P>0.05)。结论:Id-1基因可能参与了食管癌的癌变过程。

鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

为确定发病鸭场的致病原,掌握该致病原的遗传进化特征,研究从山东省某鸭场采集到1份短喙与矮小综合征(SBDS)疑似病例病料,采用永生化鹅胚上皮细胞系(GEEC)对病料进行病毒分离培养,观察细胞病变,测定分离毒株的血凝性、病毒滴度(TCID_(50))、对鸭胚的致病性,并进行VP1基因序列比对及相似性分析。结果显示:临床病料分离培养的病毒可引起GEEC出现细胞明显皱缩、聚集、折光性增强等典型细胞病变,表明分离到一株鸭源NGPV毒株,命名为SDHZ株,该病毒对1%鸡红细胞无凝集性,TCID_(50)高达10^(-6.25)/mL,鸭胚半数致死量(ELD_(50))为10^(-4.5)/mL,接种鸭胚死亡出现全身及肝脏出血、短喙、发育迟缓等典型症状,VP1基因序列与樱桃谷鸭中分离的新型鹅细小病毒(NGPV)相似性为95.3%~98.0%,与GPV经典毒株的相似性为89.3%~94.6%。表明该鸭场本次疫病病原为NGPV,为进一步研究NGPV致病机制及制定综合防控措施提供参考。

NF-κB在砷诱导人正常膀胱上皮细胞COX-2表达中的作用

目的观察NF-κB核转录因子在砷诱导人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)环氧化酶-2(COX-2)表达中的作用。方法在细胞培养液中加入不同浓度的NaAsO2,24 h后提取细胞总RNA和核蛋白,用RT-PCR和Westernblot方法分别分析COX-2 mRNA表达和NF-κB蛋白水平;选择COX-2高表达的NaAsO2处理组,再用NF-κB抑制剂(PDTC)处理,观察COX-2 mRNA表达水平的变化。结果 4、8μmol/L NaAsO2处理细胞后,COX-2 mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05);4μmol/L NaAsO2处理组细胞NF-κB蛋白水平也显著提高,高于对照组,而10μmol/LNaAsO2处理组细胞NF-κB蛋白水平低于对照组(P<0.05);同时用4μmol/L NaAsO2和PDTC共同处理细胞后,COX-2 mRNA表达水平降低,显著低于单纯用4μoml/L NaAsO2处理细胞的COX-2 mRNA表达水平(P<0.05)。结论低剂量的砷能够诱导人正常膀胱上皮细胞COX-2 mRNA和NF-κB蛋白表达水平的增高,砷诱导的核转录因子NF-κB活化在砷诱导的COX-2表达水平增高中起一定作用。

砷对人正常膀胱上皮细胞信号传导与转录激活因子3mRNA表达的影响

目的研究亚砷酸钠对人正常膀胱上皮(SV-HUC-1)细胞中信号传导与转录激活因子3(STAT3)m RNA表达的影响。方法将处于对数生长期的SV-HUC-1细胞分别进行急性染毒[暴露于含终浓度为0(对照)、1、2、4、8、10μmol/L亚砷酸钠的培养基染毒24 h]和慢性染毒[以含终浓度为0(对照)、0.5μmol/L亚砷酸钠的培养基染毒40代]。采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测细胞STAT3 m RNA表达情况。结果与对照组比较,4、8、10μmol/L亚砷酸钠暴露组SV-HUC-1细胞内STAT3 m RNA的表达水平均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着亚砷酸钠染毒剂量的升高,SV-HUC-1细胞内STAT3 m RNA的表达水平呈先升高后下降的趋势。0.5μmol/L亚砷酸钠慢性暴露组SV-HUC-1细胞内STAT3m RNA的表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论砷可能通过调控STAT3的表达而在砷诱导的SVHUC-1细胞恶性转化中发挥一定作用。

16型人类乳头状瘤病毒对口腔上皮细胞Rb、p16、Cyclin D1表达的影响

目的 探讨 16型人类乳头状瘤病毒 (humanpapillomaviruses ,HPV)对口腔上皮细胞Rb、p16、CyclinD1表达的影响 ,以明确HPV16在口腔上皮细胞癌变过程中的作用机制。方法 Western印迹检测人永生化口腔上皮细胞HIOEC中HPV16E6、E7、Rb、p16、CyclinD1蛋白表达 ,免疫沉淀 Western印迹偶联检测HIOEC中HPV16E7 Rb复合物形成情况。结果 HIOEC表达HPV16E6、E7蛋白 ;HIOEC出现去磷酸化Rb堆积 ,HPV16E7和去磷酸化Rb形成复合物 ;p16、CyclinD1蛋白表达无改变。结论HPV16E7在HPV16诱导的口腔上皮细胞永生化过程中起了重要作用。

乳痈方对4T1乳腺癌小鼠胸腺上皮细胞表型变化的作用及机制研究

目的:探讨乳痈方对4T1乳腺癌小鼠胸腺上皮细胞表型变化的作用及机制。方法:①选用BALB/c小鼠,建立4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型。模型动物随机分为模型组、环磷酰胺(CTX,30 mg/kg)组和乳痈方低、中、高剂量(0.145,0.29,0.58 g/kg)组,每组4只。各组给予相应干预,连续20 d。末次给药后,采集小鼠胸腺、肺、脾、肿瘤、淋巴结组织,计算脏器指数和抑瘤率;观察肺表面结节情况,计算肺转移率。HE染色后光镜下观察胸腺形态学变化,免疫组化检测胸腺组织钙黏附蛋白E(E-cadherin)和波形纤维蛋白(Vimentin)的表达。②体外分离小鼠原代胸腺上皮细胞(TECs),通过转染SV40T基因构建永生化TECs(iTECs)并验证。采用不同浓度(0、25、50、100、200、400μg/ml)乳痈方提取液处理iTECs。细胞培养48 h后,MTT法检测细胞增殖率,结晶紫染色观察细胞增殖情况。将iTECs分为空白组、TGF-β1组(10 ng/ml TGF-β1)、乳痈方低剂量组(10 ng/ml TGF-β1+50μg/ml提取液)、乳痈方中剂量组(10 ng/ml TGF-β1+100μg/ml提取液)、乳痈方高剂量组(10 ng/ml TGF-β1+200μg/ml提取液)。先加入TGF-β1诱导48 h后,再给予相应浓度的乳痈方提取液干预24 h。免疫荧光和PCR检测细胞表型标志物E-cadherin、Vimentin、α-微管蛋白(α-tubulin)及相关转录因子Zeb 1、Snail 1的表达水平。建立Smad转染的iTECs,荧光素酶报告基因检测乳痈方对TGF-β1诱导的转染iTECs细胞Smad通路活化的影响。结果:①与模型组相比,乳痈方低、中、高剂量组的肿瘤指数均显著降低(P<0.05),抑瘤率分别为33.45%、31.43%和6.49%;肺转移总数以及直径>2 mm转移灶数均明显减少(P<0.05,P<0.01),肺转移率分别为75%、75%和100%。HE染色观察显示,模型组小鼠胸腺组织皮质和髄质交界模糊,细胞排列紊乱,皮质萎缩;乳痈方各剂量组小鼠的胸腺组织皮质区和髄质边界较明显,皮质区细胞总数较模型组显著增多(P<0.05,P<0.01),髄质区细胞总数较模型组显著减少(P<0.05,P<0.01)。免疫组化检测显示,乳痈方干预后,模型小鼠胸腺组织上皮细胞标记物E-cadherin阳性表达增多,间质细胞标记物Vimentin阳性表达减少。②成功构建iTECs,iTECs与TECs形态相似,且高表达SV40基因和CK5蛋白。MTT检测和结晶紫染色观察显示,100、200、400μg/ml乳痈方干预可促进iTECs增殖(P<0.01)。③TGF-β1诱导后,iTECs逐渐变为长梭形,E-cadherin表达和mRNA水平降低(P<0.05),Vimentin表达和mRNA水平上调(P<0.05),且相关基因Snail 1和Zeb 1的mRNA水平显著升高(P<0.01)。乳痈方干预可抑制TGF-β1诱导的细胞形态向长梭形变化,上调E-cadherin表达和mRNA水平(P<0.01),下调Vimentin表达和mRNA水平(P<0.05,P<0.01),且显著降低Snail 1和Zeb 1的mRNA水平(P<0.01)。④TGF-β1诱导可引起iTECs细胞Smad mRNA水平明显上调(P<0.01),不同剂量乳痈方作用均可使Smad mRNA水平显著下调(P<0.01),且低剂量组的信号通路活化程度较TGF-β1组明显降低(P<0.05)。结论:乳痈方可有效逆转乳腺癌小鼠胸腺上皮细胞的表型变化,其作用机制与抑制TGF-β1/Smad通路有关。

长期砷暴露诱导人膀胱上皮细胞恶性转化的研究

目的构建低浓度长期亚砷酸钠(NaAsO_2)诱导人膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)恶性转化模型,研究低浓度长期砷暴露对SV-HUC-1恶性转化过程的影响。方法 0和0. 5μmol/L NaAsO_2分别长期处理SV-HUC-1至40周(约80代,10个月),观察暴露组及对照组细胞在培养至10、20、30和40周时形态,四氮唑盐比色(MTT)验证细胞增殖速率;划痕实验、Transwell细胞迁移实验验证细胞迁移能力;软琼脂集落形成实验观察细胞肿瘤形成能力。结果随NaAsO_2处理时间的延长,细胞由连接紧密的扁平多变形状向松散的长梭型转变; 0. 5μmol/L NaAsO_2处理至20周后,细胞活力显著增强,与处理10周时比较差异有统计学意义(P<0. 01);划痕愈合实验显示,砷暴露20周后,划痕愈合面积显著大于10周(P<0. 01); Transwell细胞迁移侵袭能力30周时显著高于10周(P<0. 01);软琼脂集落形成实验显示,砷暴露30周后软琼脂上出现大量明显的锚定生长集落,20、30、40周组集落形成数量分别为10周组的1. 85、9. 79和15. 36倍(P<0. 01),未经砷暴露组各代数有极少集落,且体积小,故忽略不计。结论 0. 5μmol/LNaAsO_2长期处理的SV-HUC-1可逐渐恶转,在砷处理20～30周时已初具恶性表型,40周后细胞恶性转化。