重组腺相关病毒载体介导的人色素上皮衍生因子对糖尿病大鼠血-视网膜屏障的影响

目的以重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体介导的人色素上皮衍生因子(human pigmentepithelium-derived factor,hPEDF)转染糖尿病大鼠视网膜,观察其对血-视网膜屏障的影响。方法雄性Wistar大鼠75只应用链脲佐菌素诱导形成糖尿病模型后,随机分为1个月组、3个月组和6个月组,每组各25只。所有大鼠右眼玻璃体内注射rAAV2-CMV-hPEDF作为治疗组,左眼注射rAAV2-CMV-GFP做自身对照。正常大鼠20只右眼假注射,左眼不注射。应用Evans-Blue测定血-视网膜屏障的渗漏变化,应用Western-blotting测定ICAM-1和Occludin蛋白的表达情况。结果随着糖尿病病程进展,视网膜渗漏不断增强,视网膜中Evans-Blue含量不断增加,一直持续到6个月达到高峰。各治疗眼组与自身对照眼组相比视网膜渗漏减轻,其中1个月治疗眼组Evans-Blue含量(68.673±24.083)ng.mg-1低于自身对照眼组(93.850±24.969)ng.mg-1,二者比较,差异无统计学意义(P>0.05);3个月Evans-Blue含量(46.021±16.091)ng.mg-1及6个月(55.198±25.060)ng.mg-1治疗眼组均显著低于自身对照眼组Evans-Blue含量(102.528±39.421)ng.mg-1、(128.225±34.603)ng.mg-1(P<0.05)。但各治疗眼组与正常眼注射组相比Evans-Blue含量仍显著增加(均为P<0.05)。随糖尿病病程进展,视网膜中ICAM-1蛋白含量不断增加,Occludin蛋白含量不断降低。治疗眼组与自身对照眼组相比,ICAM-1蛋白含量均显著下降(均为P<0.01)。3个月及6个月治疗眼组与自身对照眼组相比,Occludin蛋白含量均显著升高(均为P<0.01)。糖尿病大鼠视网膜ICAM-1与Occludin蛋白表达呈显著负相关(r=-0.754,P<0.01)。结论 rAAV2-CMV-hPEDF玻璃体内注射可增加糖尿病大鼠视网膜Occludin的表达,抑制ICAM-1表达,从而减轻糖尿病大鼠视网膜血管的渗漏。

人色素上皮衍生因子(PEDF)基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

实验主要是应用基因重组技术从人胎盘中克隆人的 PEDF基因 ,构建了 p BV/PEDF重组质粒 ,并使之在大肠杆菌中诱导该因子表达成功 ,这为 PEDF蛋白的获取和进一步研究奠定了基础。

重组人色素上皮细胞衍生因子融合蛋白的制备及其抑制新生血管活性的研究

目的:人色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)是一种有效的新生血管形成抑制因子和神经营养因子。通过原核细胞表达人PEDF蛋白,鉴定其抑制新生血管的生物学活性。方法:采用PCR法扩增人PEDFcDNA,将其克隆到pET32a载体中,在大肠杆菌BL21中表达人PEDF蛋白。经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,镍柱亲和层析法变性条件下纯化重组融合蛋白。Bradford法测蛋白浓度,采用鸡胚脲囊膜法测其对新生血管形成的影响。结果:成功构建了pET32a-PEDF表达载体。重组人PEDF蛋白在BL21宿主菌中获得了稳定高效表达,鸡胚脲囊膜实验结果显示在重组蛋白浓度为0.4、0.04 ng/ml时均有对新生血管的显著抑制作用(P<0.01),而在4 ng/ml时无抑制作用。结论:成功高效表达及纯化了重组人PEDF蛋白,鉴定其抑制新生血管的生物学活性,并且证实该活性在一定范围内有效,为进一步研究其功能及推广应用奠定了基础。

血清外泌体中色素上皮衍生因子作为正己烷早期神经毒效应标志的研究

目的初步探讨人色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)作为正己烷早期神经毒效应标志物的可行性。方法选取28名职业性慢性正己烷中毒病例作为病例组;按年龄、性别匹配,选取接触正己烷未出现周围神经中毒症状的作业工人56名作为接触组,不接触正己烷等有机溶剂且无周围神经损害症状的作业工人56名作为对照组。采集所有研究对象肘静脉血并检测血清外泌体中PEDF水平。对病例组进行神经肌电图检查。采用方差分析比较病例组、接触组以及对照组PEDF水平的差异,采用Pearson相关分析探讨病例组PEDF与神经肌电图相关指标的相关性。结果病例组与接触组、对照组间血清外泌体PEDF水平差异具有统计学意义(P<0.05),且病例组血清外泌体PEDF水平高于接触组(P<0.05)、而接触组血清外泌体PEDF水平高于对照组(P<0.05)。此外,对病例组血清外泌体PEDF水平与其神经肌电图4项指标进行相关性分析发现,PEDF水平与腓总神经的下肢远端运动潜伏期为正相关(r=0.62,P<0.001),与腓总神经的运动神经传导速度(r=-0.70,P<0.001)、下肢感觉神经动作电位波幅(r=-0.61,P=0.001)及感觉神经传导速度(r=-0.61,P=0.001)均为负相关,与正中神经的感觉神经传导速度为负相关(r=-0.53,P=0.004)。结论血清外泌体PEDF可能作为正己烷神经毒效应标志。

rhPEDF体外活性及抑制大鼠角膜新生血管的作用

目的:探讨重组人色素上皮细胞衍生因子(recombinant human pigmentepithelium-derived factor,rhPEDF)的体外生物学活性及其抑制大鼠角膜新生血管的作用及机制。方法:建立鸡胚脲囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)模型,光镜下观察rhPEDF对正常鸡胚脲囊膜微血管形态及数目的影响。照体外实验,给大鼠角膜碱烧伤模型10mol/L rhPEDF后,进行裂隙灯显微镜观察,并定量分析角膜新生血管面积;采用组织病理学检查,比较对照组与用药组的变化。结果:光镜下可见,0.4μg/L rhPEDF对新生血管有显著抑制作用(P<0.01),鸡胚脲囊膜微血管数减少,并且管径变细。大鼠实验组角膜新生血管较对照组3,7,14d没有显著变化。结论:rhPEDF具有抑制新生血管的生物学活性。由于角膜新生血管形成机制的复杂性,应用于角膜新生血管的治疗还需要进一步深入研究。