人蛋白C cDNA突变体的设计、克隆与序列分析

目的 通过对人蛋白C cDNA的定点突变,构建人蛋白C突变体cDNA,以期实现从哺乳动物细胞中直接表达出具有生物活性的人蛋白C产物。方法 针对人蛋白C cDNA序列设计引物以引入突变序列,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和重组PCR方法,从人胎肝总RNA中分别钓取人蛋白C的重链和轻链,经重组PCR反应将两者连接,然后将其克隆入pGEM-T载体中,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果 经RT-PCR和重组PCR扩增获得大小为1374 hp的cDNA片段,并成功构建了人蛋白C cDNA突变体的克隆质粒pGEM-T/mhPC,序列分析证实所引入的编码8个氨基酸短肽的核苷酸序列突变位点正确取代了人蛋白C的活性肽,获得人蛋白C突变体cD-NA的克隆。结论 已成功进行了人蛋白C cDNA的突变,获得了人蛋白c cDNA突变体的克隆,为进一步进行人蛋白C突变体cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。

人蛋白CcDNA基因的克隆及序列分析

为实现人蛋白CcDNA在哺乳动物细胞中的表达以及研究其生物学特性 ,针对人蛋白CcDNA序列设计引物 ,运用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)从人胎肝总RNA中钓取人蛋白CcDNA ,将其克隆入 pIRESneo载体中 ,通过酶切和PCR鉴定出重组体并进行测序分析。结果表明 ,获得大小为 1386bp的人蛋白CcDNA基因 ,成功构建人蛋白CcDNA载体 pIRES/hPC ,为进一步进行人蛋白CcDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。

重组人蛋白C在HEK293细胞中的表达与鉴定

目的获得转染人蛋白CcDNA的工程细胞株,实现重组蛋白C的表达。方法将构建好的重组表达载体pIRES-hPC用脂质体介导的方法转染HEK293细胞,经G418加压筛选、细胞有限稀释法等获得克隆细胞株,收集无血清培养上清,浓缩后进行鉴定。结果经G418筛选得到了21株克隆化细胞,SDS-PAGE和Westernblot鉴定表明,表达产物含有人蛋白C,且具有抗凝活性。结论在哺乳动物细胞中已成功表达重组人蛋白C,为进一步深入研究及产业化奠定了基础。

重组人蛋白C的研究进展

人蛋白C具有抗凝、促纤维蛋白溶解和潜在的抗炎作用,本文在简要介绍了人蛋白C的结构、功能的基础上,重点对哺乳动物细胞和转基因动物表达重组人蛋白C的研究进展作了综述。

人蛋白C转基因小鼠的建立及乳腺表达

目的为了获得乳腺定位表达人蛋白C(hPC)的转基因动物。方法采用分步克隆的方法,构建大鼠乳清酸蛋白(WAP)启动子调控的人蛋白C质粒,命名为pWPC。将该质粒系统鉴定后,用PvuⅠ+SmaⅠ双酶切,回收4·6kb的片段(WAP-hPC-PolyA)。通过显微注射技术,将其注入昆明小鼠受精卵雄原核内;共注受精卵810枚,存活640枚,移植给28只假孕母鼠,怀孕的18只母鼠共产仔81只。结果提取鼠尾基因组DNA进行PCR检测,34只阳性,再经Southernblot检测,其中20只整合阳性;将7只整合阳性母鼠传代,产仔7日后收集乳汁,进行ELISA检测,结果均有表达。结论已成功建立了人蛋白C转基因鼠乳腺生物反应器,为hPC乳腺表达研究奠定了基础。

人蛋白C突变体转基因小鼠的建立及乳腺表达

蛋白C（PC）是体内重要的抗凝物质，对静脉血栓扩大、动脉血栓形成、脓毒血症、内毒素血症和弥散性血管内凝血等均具有预防和治疗作用。近年来研究发现蛋白C还具有抗炎作用。血栓疾病及其并发症严重威胁着人类的健康，每年约有1300万人死于血栓疾病及其并发症。脓毒症的死亡率高达30—50％，全球每天有1400人死于严重脓毒症，每年其治疗费用多达76亿美元。所以，进行PC的研究不仅具有重要的医学意义，还具有广阔的市场前景：目前，治疗用PC多为血浆中提取的浓缩剂，人血浆的PC含量较低（3～5mg／L），从血浆中提取PC数量有限，且PC浓缩剂仍存在病毒污染的可能性。因此，利用生物反应器生产重组人蛋白C（rhPC）成为人们关注的热点。

新疆哈萨克族人蛋白C活性测定及临床意义

蛋白C是蛋白C系统的重要组成,是微循环抗血栓形成的主要血液凝固调节蛋白之一,是一种重要的抗凝蛋白.目前认为PC的检测是易栓症诊断必不可少的指标.可作为寻找静脉血栓或动脉血栓的形成病因,诊断高凝状态的存在,肝脏病变和维生素K缺乏对凝血的影响及先天性PC缺乏症分类的重要依据之一.本地区为少数民族地区,哈萨克人口众多,哈萨克族人种及饮食生活习惯与汉族有着明显的不同.我们通过对400例健康哈萨克族人进行PC活性测定,以了解哈萨克族PC的活性水平和先天性PC缺陷状况,且建立本地区哈萨克族PC活性的参考值范围.

重组人蛋白C在CHO/dhfr^+细胞中的表达与分析

目的 :人蛋白C具有重要的抗凝功能 ,与复发性血栓性疾病、蛋白C缺陷症、创伤等有重要关系。血源蛋白C成本高、工艺复杂且存在纯度、稳定性、安全性等问题 ,研制重组人蛋白C具有必要性。目前尚无此类产品上市。本研究拟从人肝细胞中克隆蛋白C的cDNA ,构建人蛋白C的哺乳动物细胞表达载体 ,实现重组人蛋白C在CHO dhfr+ 中的表达。方法 :用RT_PCR从人胎肝细胞mRNA中扩增人蛋白C的全长cDNA片段 ,将之克隆入pGEM_T载体并测序。目的片段插入真核表达载体pIRESneo以构建重组表达质粒。磷酸钙共沉淀法转染CHO dhfr+ 细胞 ,G4 18筛选抗性克隆。Western印迹法检测细胞培养上清。HitrapQ进行色谱纯化。表达产物经蛙蛇蛇毒激活后以APTT法测定抗凝活性。结果 :RT_PCR扩增到长 1386bp的DNA片段 ,序列与已报道的人蛋白C一致。所构建的表达质粒pIREShPC转染CHO dhfr+ 细胞 ,经G4 18加压筛选得到 7株表达细胞。Western印迹法检测发现表达产物能与抗人蛋白C单克隆抗体结合 ,相对分子质量与人蛋白C一致。HitrapQ纯化重组蛋白回收率 >6 0 %。表达产物抗凝活性略低于天然人蛋白C。

全身性感染发病机制及治疗的研究进展

全身性感染是指微生物入侵机体感染后所致的全身性炎症反应综合征。病原微生物的病原相关分子模式(pathogen associatedmolecularpattern ,PAMP)通过与免疫细胞的Toll样受体相互作用,激活跨膜信号转导过程,调控炎症介质基因表达,导致免疫炎症反应失控、促炎/抗炎反应不平衡,进而使全身性感染及其后续症发生、发展。Toll样受体的多态性与全身性感染发生发展相关。活化型重组人蛋白C、早期支持治疗等辅助治疗有助于降低严重感染及其后续症的死亡率,但以PAMP识别受体、炎症介质为靶向将赋予全身性感染的发病机制和治疗新启迪。