人血小板因子4在大肠杆菌中的高效表达及活性研究

为了提高人血小板因子 4(humanplateletfactor 4,hPF4)的表达 ,在PT7 7 hPF4表达质粒的基础上 ,采用PCR定位突变技术 ,改造人血小板因子 4(hPF4)cDNA基因片段 ,去除cDNA 3′端非翻译区AT富含序列 ,改用大肠杆菌强串联终止密码子TAATAA ,成功构建了高效表达质粒pBV2 2 0 hPF4。摇瓶发酵重组人血小板因子 4的产量达 1 60mg L较原表达质粒PT7 7 hPF4表达量提高了近 80倍。经包涵体的洗涤、变性、复性后 ,采用鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验测定复性后rhPF4的生物学活性 ,结果显示 :rhPF4具有抑制血管生成活性。

一种合成人血小板因子4基因的简便有效方法(英文)

目的:用一种简便有效的方法合成hPF4基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达。方法:根据hPF4基因的序列,用touch-down PCR的方法合成hPF4基因,将合成的基因片断克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建了重组质粒pGEX-4T-1-hPF4,并将之转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达由谷胱甘肽转移酶和hPF4组成的融合蛋白。结果:用touch-down PCR的方法成功合成了hPF4基因。融合蛋白形成包含体,表达量约为全菌体蛋白的30%。结论:Touch-down PCR方法可作为合成其它目的基因的简便有效方法。BL21(DE3)/pGEX-4T-1表达系统能高效表达合成的hPF4基因,为下一步hPF4的纯化与生物学活性研究打下了基础。

利用基因工程技术构建重组人血小板因子4真核表达载体

目的:构建携带绿色荧光蛋白标签的重组人血小板因子4基因(plateletfactor4,PF4)的真核表达载体,并在真核细胞中表达,为研究其生物学功能奠定基础。方法:人工合成PF4基因模板,通过PCR方法扩增PF4-cDNA,然后克隆至pUC19克隆载体,经序列测定后重组入pIRES2-EGFP真核表达载体并进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒用脂质体转染法瞬式转染至COS7细胞中。结果:获得了PF4-cDNA基因,序列分析表明,该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明,PF4基因已与pIRES2-EGFP真核表达载体正确连接。荧光显微镜示,此载体成功转染至COS7细胞中,并获得有效表达。结论:利用基因工程技术,成功的构建了携带绿色荧光蛋白标签的PF4的真核表达载体,并在真核细胞中获得有效表达,为下一步研究其在真核细胞中的生物学功能奠定基础。

人血小板因子4基因cDNA的克隆与序列测定

为研究人血小板因子 4(hPF4)的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性 ,运用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)从人红白血病细胞系HEL细胞总RNA中扩增出hPF4基因cDNA序列 ,将其克隆至pUC18载体中。序列分析证实克隆片段与文献报道的hPF4基因cDNA序列完全一致 。

血小板因子4基因转染对肺癌细胞中血管生成因子基因表达的影响

目的 :进一步探讨人血小板因子 4(hPF4)抑制血管生成的作用机制。方法 :构建含全长hPF4cDNA重组真核表达载体pcDNA3 hPF4,将其转染到人肺巨细胞癌细胞系PLA80 1D细胞内 ,应用RT PCR及免疫组化法观察肿瘤细胞自分泌的血管内皮生长因子 (VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、白细胞介素 8(IL 8)等的mRNA和蛋白表达水平的变化。结果 :导入pcDNA3 hPF4,PLA80 1D细胞能稳定表达hPF4mRNA ,其VEGF、bFGF、IL 8的mRNA和蛋白表达水平均明显降低 ,表明hPF4可直接调控VEGF、bFGF、IL 8等基因转录 ,影响其蛋白质生物合成。结论 :提示hPF4可直接下调肿瘤细胞自分泌的VEGF、bFGF及IL 8等血管生成因子基因转录 ,抑制肿瘤细胞释放肿瘤血管生成因子 。