人血栓调节蛋白基因真核表达质粒的构建

目的 构建人血栓调节蛋白 (humanthrombomodulin ,hTM )基因的真核表达质粒 ,为研究hTM在抗血栓、抗炎症、抗血管增生等方面的作用及其临床应用奠定基础。方法 用PCR法扩增出hTMcDNA表达片段。把载体质粒 pcDNA3.1 (+) /neo和hTM片段用EcoRI +HindⅢ双酶切 ,T4DNA连接酶进行连接。结果 重组质粒在大肠杆菌菌株DH5α内扩增。提取、纯化后用HindⅢ、EcoRI酶切鉴定及测序鉴定证明hTMcDNA表达片段已被完整、正确的插入到pcDNA3.1 (+) /neo质粒中。 结论 成功构建了hTM基因的真核表达质粒pcDNA hTM。

稳定高效表达人血栓调节蛋白的CHO细胞株的建立

目的:构建稳定高效表达人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的CHO细胞株,以便于大量生产纯化hTM蛋白。方法:利用脂质体li-pofectamine 2000将包含hTM基因全长序列的重组表达质粒pThr402转染CHO细胞。转染后用G418的选择性培养液筛选、挑取抗性克隆。采用流式细胞术和Western blotting检测hTM在CHO细胞膜表面的表达情况,筛选建立稳定高效表达hTM的CHO细胞株并对其稳定性进行观察。结果:重组表达质粒pThr402转染CHO细胞后,流式细胞术证实hTM稳定高效表达于随机挑选的5个抗性克隆细胞株的细胞膜表面,但表达量有差异。Western blotting分析检测显示hTM表达量较高的CHO-TM1、CHO-TM4与CHO-TM5细胞株的细胞裂解液出现了与预期值相符的约105000的特异性条带。CHO-TM5已经经过冻存复苏前后各20次传代,且无论有无G418选择压力存在,hTM表达水平无明显差异。结论:成功构建了稳定高效表达hTM的CHO细胞株,可望获得大量蛋白,为进一步研究hTM的生物学功能以及制备和筛选抗hTM的单抗开辟新的途径。

人血栓调节蛋白基因转染兔内皮祖细胞的体外实验研究

目的探讨人血栓调节蛋白(hTM)基因转染兔内皮祖细胞(EPCs)的可行性及效率,为hTM修饰的EPCs活体移植预防经皮腔内血管成形术术后血管内再狭窄提供实验依据。方法采用基因工程方法构建重组质粒pcDNA3.1-hTM。梯度离心法分离兔外周血单个核细胞(MNCs),贴壁筛选出EPCs,通过免疫组化检测其CD34、vWF、KDR等内皮系抗原,通过Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1荧光染料双吞实验进一步表征EPCs pcDNA3.1-hTM转染EPCs,转染48 h后行细胞免疫荧光染色,72 h后行Western印迹检测比较重组质粒转染组、空载质粒转染组和对照组hTM表达水平。转染后分别于第3、4、5天采用四氮噻唑蓝法(MTT)比较各组细胞增殖活性。结果双酶切及基因测序鉴定均证实pcDNA3.1-hTM重组质粒构建成功;细胞表面抗原及免疫荧光双标实验表明所培养细胞为EPCs。转染后的直接免疫荧光实验及Western印迹检测证实hTM在重组质粒转染组的表达高于对照组;MTT比色实验示重组质粒转染组、空载质粒组、空白对照组在第3、4、5天吸光度值差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建pcDNA3.1-hTM重组质粒,转染兔外周血EPCs后可使EPCs成功表达TM,且对EPCs的活力、增殖等生物学性质无明显影响。

人血栓调节蛋白基因的表达及转基因小鼠的建立

用 PCR方法从人的基因组 DNA中扩增了人血栓调节蛋白 (h TM)基因 ,将其克隆到带有人 EF- 1α启动子的p EF- neo哺乳动物表达载体上 ,得到表达质粒 p EF- TM。在转染 p EF- TM的 COS- 1细胞中 ,h TM得到了瞬时表达 ,并且正确地定位到细胞膜上。用 p EF- TM转染猪内皮细胞 (PEC) ,经 G4 18筛选得到稳定转染的克隆。凝血活性测定结果显示 ,表达 h TM的 PEC凝血时间明显延长 ,表明其抗凝血能力增强。通过显微注射方法 ,得到了 1只 F0代 h TM转基因小鼠。 Southern杂交结果表明 ,该转基因小鼠整合了 9个拷贝的 p EF- TM DNA,并能将外源 DNA遗传给后代。