人血清白蛋白融合技术研究进展

人血清白蛋白是血液中含量最丰富的蛋白,它半衰期长,且具有运输药物的功能,这使其成为理想的药物载体.作为延长药物半衰期的新技术,白蛋白融合技术是近年来发展迅速、应用广泛的蛋白质工程技术.通过共价偶联、非共价偶联、纳米包裹和融合蛋白的方式可实现白蛋白与药物分子的偶联,使药物分子的药代动力学得到明显改善.系统介绍了白蛋白融合技术的主要方式、进展以及发展方向.随着白蛋白和相关受体蛋白作用机制的研究不断深入,基于结构的白蛋白融合技术将进一步提高白蛋白融合技术在长效药物开发中的应用.

人血清白蛋白融合技术研究进展

结合笔者所在课题组的实验研究成果,综述人血清白蛋白融合技术研究进展。人血清白蛋白融合技术是近些年来应用较多的用于改造小分子蛋白和多肽药物的手段。但是众多的研究结果发现将小分子蛋白/多肽和人血清白蛋白融合后会出现一些共性的问题,例如目标蛋白产率低、易降解等。这些共性问题可以通过融合蛋白的优化设计、蛋白酶缺陷宿主的构建、融合基因多拷贝以及与分子伴侣共表达得以解决。

荧光增白剂与人血清白蛋白相互作用的多种光谱法及分子对接技术研究

通过多种光谱方法与分子对接技术,从分子水平上对两种荧光增白剂(C.I.135、C.I.185)与人血清白蛋白(HSA)的相互作用机制进行研究。稳态荧光光谱及紫外-可见光谱实验结果表明,C.I.135、C.I.185与HSA均形成了基态复合物(HSA-C.I.135、HSA-C.I.185),猝灭机理为静态猝灭机理,热力学参数表明氢键与范德华力是结合作用的主要作用力,并且结合过程都是自发进行。三维荧光光谱结果表明C.I.135、C.I.185可以改变HSA的氨基酸残基微环境和构象,C.I.185对HSA产生的影响是最大的。分子模拟实验进一步验证上述实验结果。

人血清白蛋白融合技术在药物长效化改造中的应用

人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)融合技术是蛋白质药物长效化改造的一种通用技术,也是目前国内外生物制药研究的热点。在HSA融合技术的研究中,不同融合方式的融合蛋白活性的差异,提高HSA融合蛋白的表达产量以及HSA融合蛋白在表达过程中所出现的降解问题成为制约该技术发展的关键。现就人血清白蛋白融合技术在药物长效化改造应用中所涉及的融合方式以及融合蛋白的高效表达和降解问题进行了综述,希望为HSA融合技术的广泛应用提供一定的技术参考。

人血清白蛋白和人干扰素α2b的融合蛋白在毕赤酵母中的表达

为了延长IFNα2b在血浆中的半衰期,构建了编码HSA和hIFNα2b的融合基因并在毕赤酵母中获得高效表达,工程菌经5L发酵罐培养后获得的含融合蛋白的培养液经超滤浓缩、蓝色葡聚糖凝胶层析、疏水柱层析以及阴离子柱层析,融合蛋白的纯度达到95%以上。该融合蛋白能与干扰素抗体和人血清白蛋白抗体结合,并表现出与重组干扰素α2b相似的抗病毒活性。以猕猴为动物模型,分别从静脉和皮下单剂量给药,给药浓度为90μg/kg时,在336h后血浆中仍可检测到融合蛋白。其静脉注射的血浆半衰期为101h,皮下注射的半衰期为68.2h。皮下注射的生物利用度为67.9%。IFNα2b与HSA融合后,明显的延长了血浆半衰期,显现了其良好的临床应用前景。

重组人血清白蛋白-干扰素α-2b 融合蛋白体外抗乙型肝炎病毒活性评价

目的检测重组人血清白蛋白-干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFNα-2b)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性。方法构建含1.6倍HBV基因组及绿色荧光蛋白的重组腺病毒(AdGFP-HBV),感染人肝细胞系HepG2细胞,构建HBV复制细胞模型;ELISA法检测HBV乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)表达;MTT法检测HSA-IFNα-2b对HepG2细胞的毒性作用;定量PCR法检测细胞内HBV RNA的相对表达以及细胞上清中HBV DNA绝对表达水平;双报告基因法检测HSA-IFNα-2b对HBV增强子Ⅰ活性的影响。结果 AdGFP-HBV感染HepG2细胞后可以复制表达HBV。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1加入AdGFP-HBV感染的HepG2细胞,使HBsAg表达降低51.32%(P<0.01),HBeAg降低50.26%(P<0.01),而相同浓度的HSA-IFNα-2b并不抑制细胞的增殖。随HSA-IFNα-2b浓度增加,其对HBsAg表达的抑制作用逐渐升高,HSA-IFNα-2b对HBsAg表达的抑制率(Y)与其浓度(X)的回归方程是Y=21.11 lgX+11.91(r2=0.954),IC50为63.76 kU·L-1。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使细胞中HBV RNA下降52.83%(P<0.01),培养上清中HBV DNA降低53.07%(P<0.01)。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使HBV增强子Ⅰ活性下降40.04%(P<0.01)。结论构建了可用于药物评价的HBV复制细胞模型,HSA-IFNα-2b体外具有抗HBV活性。

表面等离子共振技术测定药物与人血清白蛋白的相互作用

目的应用表面等离子共振技术（SPR）建立一种新的测定白蛋白与化合物相互作用的方法。方法将人血清白蛋白（HSA）固定在CM5芯片表面。不同化合物的溶液流经固定于芯片表面的HSA，SPR显示在芯片表面的折射系数变化。分析软件处理数据，用HSA流通池得到的数据减去参比池得到的数据进行拟合，确定结合常数。结果所有测试药物与固定的HSA可逆结合。紫草素1的平衡结合常数巧为3000L·mol^-1。SPR样品需要量最小而且能够自动分析，还可以直接检测小分子（Mr308—585）结合，使之适用于评价药物与HSA相互作用。结论HSA主要的药物键合位点没有因为被固定到芯片表面而破坏。验证了SPR可以准确简易测定化合物的结合解离。

重组融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达

构建编码人血清白蛋白-人白介素-2 C125A的重组表达质粒,在Pichia pastorisGS115中表达,获得具有较高IL-2活性的融合蛋白。设计并合成符合P.pastoris密码子偏好,且含有C125A突变的IL-2编码基因IL-2m,通过酶切连接方法将其与人血清白蛋白(HSA)的编码基因连接为融合蛋白HSA-IL2m的编码基因。克隆到表达质粒pPIC9K中,电击转化P.pastorisGS115感受态细胞,获得重组P.pastorisGS115/pPHIm基因工程菌。摇瓶发酵获得分泌表达产物。结果:Western blot鉴定结果显示该融合蛋白与IL-2、HSA的抗体都能发生免疫反应。经脱盐、冻干制备的粗蛋白的IL-2生物学活性为1.51×106IU/mg。结论:在P.pastorisGS115中成功表达了具有人白介素-2生物学活性的HSA-IL2m融合蛋白。

人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白的纯化及活性鉴定

采用课题组已构建的携带人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白(rhIL-2-HSA)基因的重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115进行rhIL-2-HSA的分离纯化研究。发酵上清液经超滤浓缩、Blue Sepharose亲和层析、Octyl Sepharose疏水层析和DEAE Sepharose离子交换层析纯化获得较高纯度的目的产物,SDS-PAGE检测为单一条带。Western Blot分析结果显示,目的产物同时具有HSA和IL-2的抗原性,为HSA和IL-2的融合分子。经CTLL-2/MTT细胞增殖法测定,纯化的融合蛋白的生物学活性为1.147×107 IU/mg。

人白介素-2／人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的:构建编码人白介素-2/人血清白蛋白的重组表达质粒pPIH,在毕赤酵母(Pichiapastria)中进行表达,获得具有白介素-2(IL-2)活性的融合蛋白。方法:通过逆转录方法从人外周血单核细胞得到人IL-2的cDNA,再通过重叠PCR方法,将编码人IL-2的cDNA和编码人白蛋白的cDNA拼接起来,克隆至T载体获得含有融合基因IH的质粒pMD19/IH。用EcoRI和NotI双酶切pMD19/IH和pPIC9K两种质粒,通过琼脂糖凝胶电泳分离,试剂盒纯化,将IH片段和pPIC9K连接获得表达型pPIH的重组质粒,利用电转化方法转化毕赤酵母KM71获得重组表达质粒pPIH;CTLL-2/MTT法测定融合蛋白中人IL-2活性。结果:成功构建了人白介素-2/人血清白蛋白的重组表达质粒pPIH,融合蛋白得到了较理想的表达;重组菌经甲醇诱导表达后含有融合蛋白IL-2-HSA发酵上清液表现100U/mL的生物学活性。结论:成功获得具有人IL-2生物活性的重组人白介素-2/血清白蛋白融合蛋白,该研究结果未见文献报道。

人血清白蛋白和干扰素α2b融合蛋白在毕赤酵母中表达及质量控制

筛选获得毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K/hsa-ifnα2b,胞外分泌表达rHSA-IFNα2b药物蛋白。经摇瓶及5 L发酵罐条件优化,确定最佳发酵条件。经50 L发酵罐工艺放大,发酵产量稳定,可达到350 mg/L。离心获得发酵上清液,超滤浓缩10倍,再依次通过Blue Sepharose 6FF亲和层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析及Q Sepharose 6FF离子柱纯化。纯化产品进行SDS-PAGE纯度检测、SEC-HPLC检测、相对分子质量测定、N端测序、内毒素检测和生物活性检测。筛选获得一株高产菌,优化获得最佳的发酵条件。纯化产品检测(SEC-HPLC)纯度大于95%,相对分子质量为85 821,氨基酸的N端测序为DAHKSEVAHRFKDLG,与预期的相符。内毒素含量小于5EU/mg,符合国家药典的要求。体外生物细胞活性高达1.6×106IU/mg。具有良好的工业应用价值。

重组胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白的纯化及活性研究

利用构建的重组菌株Pichia pastoris GS115/GLP-1/HSA,在10L发酵罐中表达了胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白(GLP-1/HSA),表达量为63.6mg/L。发酵液经中空纤维柱浓缩、疏水层析、阴离子交换层析和凝胶过滤分离纯化,获得了较高纯度的GLP-1/HSA,经HPLC分析纯度达95.8%。进一步的体内活性分析结果表明,GLP-1/HSA不仅具有天然GLP-1的生物活性,而且在给药后4h仍能发挥显著性降血糖作用。以上结果表明,利用Pichia pastoris分泌型表达系统和建立的分离纯化方法,能获得大量较高纯度的GLP-1/HSA,为进一步研究和开发能够用于糖尿病临床治疗的长效GLP-1类似物奠定了基础。

人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

目的:在毕赤酵母中高效分泌表达人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白。方法:利用PCR技术获得HSA和PTH(1-34)基因,以柔性连接肽相连插入到表达载体pPIC9,重组质粒线性化后,用化学法转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷型培养板和PCR鉴定筛选得到转化子。在启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白HSA-PTH(1-34)。PCR法和电泳鉴定表达验证阳性转化子,并观测不同时间点的表达量。Western blot验证其免疫活性,在兔肾皮质细胞膜中测定腺苷酸环化酶的激活产生cAMP的量来检测融合蛋白的生物学活性。结果:PCR鉴定重组转化子验证了融合基因的成功整合,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到高效表达,HSA-PTH(1-34)同时具有HSA和PTH(1-34)的抗原性,且能激活兔肾皮质细胞中的腺苷酸环化酶产生cAMP,但活性低于PTH(1-34)。结论:在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白。

重组人骨保护素片段OPG^(179)与人血清白蛋白在毕赤酵母中的融合表达

目的:在毕赤酵母中融合表达人骨保护素(OPG)片段OPG179与人血清白蛋白(HSA)。方法:通过RT-PCR扩增获得OPG179基因,构建表达质粒pHILD2-rhOPG179-HSA,转化至毕赤酵母菌中进行表达、纯化,对分泌表达产物进行SDS-PAGE及Western印迹检测。结果:酶切鉴定与测序结果显示重组表达质粒pHILD2-rhOPG179-HSA正确;经Western印迹检测,融合蛋白rhOPG179-HSA的相对分子质量约为97×103,符合预期值;rhHSA-OPG179在毕赤酵母中的表达量约为80 mg/L。结论:表达并纯化制备了重组骨保护素片段与人血清白蛋白的融合蛋白,为后续的生物学活性研究奠定了一定的基础。

^99Tc^m-半乳糖基化人血清白蛋白融合干扰素α2b的制备和生物分布

用氯化亚锡(SnCl2)还原法制备99Tcm-半乳糖基化人血清白蛋白融合干扰素α2b(GHSA-IFNα2b),研究了SnCl2和GHSA-IFNα2b的用量以及溶液pH对99Tcm-GHSA-IFNα2b标记率的影响;ICR小鼠尾静脉注射99Tcm-GHSA-IFNα2b(0.286MBq/只,n=6),于5、10、15、30、60、120min取脏器和血,称重、计数,计算%ID(organ)-1和%ID·g-1;并对99Tcm-GHSA-IFNα2b的SD大鼠显像进行了研究。结果表明,在pH=3.0~4.5、GHSA-IFNα2b的用量≥0.3mg、SnCl2的用量为3~60μg时,37℃反应30min,可得标记率>90%的99Tcm-GHSA-IFNα2b,并在6h内保持基本稳定;肝脏组织中的99Tcm-GHSA-IFNα2b在注射后10min高达52.51%ID(organ)-1,能够被肝脏特异性摄取,主要通过胆道、肠道排泄;大鼠静脉注射15~30min时,即可获得清晰的肝显像。

人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的:在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)突变体(2Gly-hGLP-1)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。方法:为将GLP-1氨基酸序列第2位的丙氨酸(Ala)定点突变为甘氨酸(Gly),根据毕赤酵母偏爱密码子合成编码2Gly-hGLP-1的基因;采用重叠PCR法拼接2Gly-hGLP-1和HSA的基因,使得2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽接头连接;将该融合基因插入表达载体pPIC9构建为重组载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA,电击转化至毕赤酵母GS115细胞,通过表型筛选和诱导表达实验获得高效表达菌株;工程菌在5L发酵罐中培养后,对发酵产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果:融合蛋白在5L发酵罐中的表达量约为200mg/L,经纯化后纯度可达95%以上;小鼠糖耐量实验表明该融合蛋白具有明显的控血糖活性。结论:在毕赤酵母中分泌表达的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有降血糖活性。

重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在PichiaPink系统中的表达

目的:比较PichiaPink表达系统和巴斯德毕赤酵母GS115在表达外源蛋白方面的差异,对PichiaPink表达系统的潜在优点进行评价。方法:以重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(HSA-IFN-α2b)为报告蛋白,构建相关载体,分别转化PichiaPink系统菌株和巴斯德毕赤酵母GS115菌株,诱导HSA-IFN-α2b表达并测定表达水平;通过SDS-PAGE检测HSA-IFN-α2b在PichiaPink系统中的降解程度。结果:PichiaPink系统几乎所有的转化子都可以表达HSA-IFN-α2b,而GS115菌株只有60%的转化子能表达HSA-IFN-α2b;同一种Pink菌株中,整合有高拷贝数表达载体pPink-HC的菌株表达量高于整合有低拷贝数表达载体pPink-LC的菌株;Pink蛋白酶缺陷菌株在复杂培养基(YPD,BMMY)中HSA-IFN-α2b基本没有降解,而在合成培养基(BSM)中降解现象明显。结论:PichiaPink表达系统产生的转化子较GS115菌株产生的转化子易于筛选;PichiaPink系统蛋白酶缺陷菌株可明显减少外源蛋白降解。这些结果为利用PichiaPink表达系统高水平和大规模制备外源蛋白提供了实验依据。

犬血清白蛋白-白细胞介素融合蛋白的表达研究

白细胞介素是动物体中重要的免疫细胞因子之一，其抗病毒、抗肿瘤、调节其他相关免疫程序等作用受到重视，并不断进行改进、开发和利用。目前，人医临床上各种改良的白细胞介素药剂已经陆续投入研发和使用，其中针对白细胞介素可能诱发的不良反应及其半衰期偏短等缺点的研究，是努力改进的主要方向之一。试验拟用常见动物犬血清白蛋白（CSA）与犬白细胞介素-2（IL-2）构建融合蛋白，延长犬白细胞介素的半衰期，进而探讨动物临床长效重组白细胞介素的可行性。

抗人乙酰胆碱受体单链抗体融合人血清白蛋白基因的构建

[目的 ]提高抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体 (ScFv)的稳定性 ,构建单链抗体 人血清白蛋白 (HSA)融合基因 .[方法 ]应用聚合酶链反应扩增人血清白蛋白基因 ,并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体单链抗体 (ScFv6 37)的载体pHEN 2 (pHEN 2 ScFv6 37)上 .将重组质粒 pHEN 2 ScFv6 37 HSA转化至大肠杆菌 (E .coliDH 5α)中 ,分离提纯重组质粒后再经酶切、琼脂糖凝胶电泳检查以确认融合基因的正确性 .[结果 ]电泳检查发现了大小分别为 1770bp和 70 5 4bp的人血清白蛋白基因和融合基因 ,且发现位置正确 .[结论 ]成功地构建了单链抗体ScFv6 37与人血清白蛋白融合基因 .

应用活体冷冻技术动态观察各种血流动力学改变时血清白蛋白在小鼠近端肾小管的分布变化

目的应用活体冷冻技术结合免疫组织化学的方法形象化表现各种血流动力学条件下小鼠血清白蛋白经肾小球毛细血管袢滤过后,在近曲小管再吸收的病理生理过程。方法分别在正常血流、急性高血压和心脏骤停等血流动力学条件下,对模型小鼠的左肾进行活体冷冻及冷冻置换。连续的石蜡切片后,分别进行苏木精-伊红染色和抗小鼠白蛋白抗体免疫组织化学染色。结果正常血压和心脏骤停情况下,血清白蛋白在血管内清晰定位,少量出现在近端小管顶端的细胞质部分,但在急性高血压情况下,血清白蛋白明显地免疫定位于所有近端小管。结论活体冷冻技术结合冷冻置换方法可以原位捕获瞬间被活体功能状态的近端肾小管上皮细胞再吸收的血清白蛋白,可视化活体组织细胞的功能形态学特征。