人血管抑制因子的原核表达、纯化及活性研究

目的 :利用大肠杆菌表达系统表达人血管抑制因子 ,并利用镍金属螯合层析法进行纯化 ,探讨其抑制血管内皮细胞增殖的活性。方法 :采用RT PCR技术从人肝脏组织中获取人血管抑制因子的cDNA ,将其克隆至原核表达载体pQE30中进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS PAGE分析 ,并利用镍金属螯合层析法进行纯化。3H TdR法检测纯化的血管抑制因子对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果 :利用pQE30表达载体表达的含 6个组氨酸尾的vasostatin蛋白 ,在SDS PAGE上表现出一条约 2 1kD的阳性条带 ,经镍金属螯合层析纯化后的蛋白经肽指纹图谱分析鉴定为目的蛋白 ,在体外可抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖。结论 :人血管抑制因子可在大肠杆菌中以包涵体形式高水平表达 ,并具有抑制血管内皮细胞增殖的活性。

重组人血管内皮生长因子抑制剂中异天门冬氨酸含量检测

目的：建立对重组人血管内皮生长因子抑制剂进行异天门冬氨酸（Isoasp）含量检测的方法。方法：利用ISOQUANT异天门冬氨酸检测试剂盒并结合HPLC的方法检测重组人血管内皮生长因子抑制剂原液和成品中的Isoasp含量,并对该方法进行加标回收率试验、精密度和准确性的验证。结果：40、25、6.25 pmol·L-1的3种浓度对照品的加标回收率均在80%~120%的范围内。对1批原液和1批成品的各3个样品分别进行测定,原液和成品中每摩尔蛋白的Isoasp含量平均值分别为（0.066±0.010）、（0.093±0.008）mol,RSD分别为15.2%和8.6%,原液和成品中各1个样品的25 pmol·L-1对照品的加标回收率分别为90.2%和108.1%。结论：经方法学验证,本文所建立的方法可作为该产品的Isoasp含量的常规检测方法,也为融合蛋白及单抗类制品的Isoasp含量检测提供借鉴。