人粘液表皮样癌细胞系MEC-1的建立及其生物学特性

粘液表皮样癌为口腔颌面部常见肿瘤之一,因其生物学行为具有特点而为口腔医学及肿瘤医学学者所重视。建立本类肿瘤的细胞系,将有助于对之深入研究。我科自1987年10月至今建立的一株粘液表皮样癌细胞系,现已培养745d、125代,生长稳定。现报道于下。

PTEN抑癌基因转染粘液表皮样癌细胞系M_3SP_2的建立和鉴定

目的 :为了研究外源性基因PTEN对粘液表皮样癌细胞生物学行为的影响 ,建立稳定表达PTEN的粘液表皮样癌细胞系。方法 :应用脂质体介导方法将野生型PTEN基因导入高转移性粘液表皮样癌细胞系M3 SP2 ,嘌呤霉素筛选阳性克隆 ,用免疫印迹法和ABC免疫酶染色法检测转染细胞中PTEN蛋白的表达。结果 :野生型PTEN基因成功地导入细胞M3 SP2 ,转染细胞稳定表达PTEN蛋白 ,PTEN蛋白分布于细胞质。结论 :M3 SP2 细胞能稳定表达外源性基因PTEN。

人涎腺粘液表皮样癌细胞系的EGFR表达及其异质性的研究

目的 :探讨人涎腺粘液表皮样癌细胞系 (MEC 1)的表皮生长因子受体 (EGFR)的表达及其异质性。方法 :采用鼠抗人EGFR1单克隆抗体免疫荧光染色及流式细胞仪 (FCM ) ,对MEC 1的EGFR的表达阳性率及其是否存在异质性进行研究。结果 :经EGFRl单克隆抗体染色的MEC 1的细胞均为阳性 ,阳性率为10 0 %。相对荧光强度以平均峰值道数表示 ,为 8.0 0 6± 4.410。从FCM单参数直方图上可以观察到在MEC l细胞系中出现双峰 ,表明有EGFR表达的异质性细胞群存在。结论 :该细胞系是用FCM研究EGFR表达的良好实验模型。异质性表达的细胞是否为那些EGFR数量较多。

人涎腺黏液表皮样癌多药耐药细胞系的建立及其生物学特性

目的:建立一种耐药性稳定的人涎腺黏液表皮样癌细胞株(MEC/5-FU),为研究其耐药机制和逆转药物的筛选奠定实验基础。方法:采用浓度递增法联合大剂量冲击诱导方法,建立稳定的MEC/5-FU。应用MTT法、RT-PCR、罗丹明123蓄积试验等方法检测该细胞株的耐药性能及其生物学特性。结果:MEC/5-FU耐药性能稳定,对5-FU的耐药倍数达到36.11,并且对其他几种化疗药物表现不同程度的交叉耐药性。RT-PCR显示耐药相关基因ABCA2、ABCB1、ABCB11、ABCC1、ABCC4等ABC家族基因在MEC/5-FU细胞中明显高表达。罗丹明123在MEC/5-FU细胞中的蓄积量远低于MEC细胞。结论:MEC/5-FU具有多药耐药特性,为人涎腺黏液表皮样癌耐药机制和耐药逆转研究提供了理想的实验模型。

新藤黄酸对人表皮癌细胞A431增殖和凋亡的影响

目的 观察新藤黄酸（gambogenic acid,GNA）对人表皮癌细胞A431增殖和凋亡的影响.方法 以体外培养的人表皮癌A431细胞株为研究对象,采用甲基噻唑基四唑检测GNA对A431细胞增殖活性的影响;倒置显微镜下观察GNA对A431细胞株细胞形态的影响;荧光显微镜下观察GNA对Hoechst 33342染色的A431细胞凋亡的影响;采用流式细胞仪检测膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙碇双染的A431细胞的凋亡率.结果 随着GNA剂量的增大,GNA对A431细胞增殖活性的抑制作用增强.倒置显微镜和荧光显微镜下观察显示,GNA作用的A431细胞形态发生明显的变化并出现显著的凋亡特征.流式细胞仪检测显示A431细胞凋亡率随着GNA作用剂量的增大而升高.结论 0.75～12.0 μmol/L GNA能够剂量依赖性地抑制A431的增殖.

三氧化二砷联合干扰素抑制人表皮癌细胞株A431的生长

目的探讨三氧化二砷(As2O3)联合干扰素(INF)在不同浓度、不同作用时间对人表皮癌细胞细胞株A431增殖的抑制作用,筛选两药应用的最佳作用时间和剂量。方法通过对A431细胞常规传代培养,采用MTT比色分析法检测不同浓度As2O3、INF及二者联合对人A431细胞增殖抑制的影响;采用流式细胞分析术,检测人A431细胞的细胞周期变化和凋亡的情况。结果与阴性对照组比较,As2O3在1～10μmol/L浓度范围内对A431细胞有明显的增殖抑制作用,在24～72h对人A431细胞的抑制作用随着浓度的增加而增强,且以10μmol/L浓度组作用72h的抑制率最高(P<0.01)。与阴性对照组比较,INF在一定浓度和时间范围内对A431细胞作用也有相似结果。As2O3能诱导细胞凋亡,随着时间的延长和浓度的增加凋亡细胞数目增加。结论 As2O3和INF均对人A431细胞有明显的抑制作用,且呈现剂量依赖效应关系和时间依赖效应关系,As2O3和INF均能使S期延滞,并提高S期细胞比例,两药联合有协同效应。As2O3诱导A431细胞凋亡的作用显著,但INF能强化As2O3诱导A431细胞凋亡的作用。

异搏定联合抗肿瘤药物对人涎腺粘液表皮样癌高转移细胞生长抑制的增效效应

目的 :分析钙拮抗剂异搏定 (verapamil,Ver)联合应用阿霉素 (adriamycin ,ADM)柔红霉素 (daunorubicin ,DNR)、足叶乙甙 (etoposide,VP1 6 )、高三尖杉酯碱 (homoharringtonine,HHT)和长春花碱 (vinblastineVBL)等抗肿瘤药物对人涎腺粘液表皮样癌高转移细胞 (Mc3)的增效效应 .方法 :采用细胞培养、细胞计数及MTT等方法观察各化疗药物对Mc3细胞的杀伤作用 ,根据药物剂量 -效应曲线、半抑制浓度 (IC50 )、抗肿瘤活性 (RAA)比较各化疗药物单独用药及分别联合非细胞毒性的Ver的抗肿瘤作用及联合用药合并指数 (CI50 ) .结果 :Ver剂量超过 32 0 0 0时 ,对Mc3细胞有生长抑制作用 ,其IC50为 3981 0 .72 ;DNR ,VBL ,VP1 6 ,ADM和HHT等药物单独用药对Mc3细胞均呈现具有一定量效关系的生长抑制作用 .低浓度的DNR ,VBL ,VP1 6 ,ADM和HHT与非细胞毒性剂量的Ver联合应用 ,各用药组均呈现极强的细胞毒性作用 ,CI50 分别 <0 .95 ,其所合用的剂量水平均有显著的协同作用 .结论 :非细胞毒性剂量的Ver明显增强了化疗药物的抗肿瘤活性 ,对人涎腺粘液表皮样癌高转移肿瘤细胞生长抑制有明显的增效效应 .

EGCG对A431细胞NF-κB表达的表观遗传修饰效应及对光动力的影响

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人表皮细胞癌A431细胞内核转录因子(NF-κB)表达的表观遗传修饰效应,探讨联合5-氨基酮戊酸介导光动力疗法(ALA-PDT)的增敏作用。方法:低氧诱导培养A431细胞,用MTT比色法检测不同浓度EGCG对A431细胞增殖的影响,MS(methylation specific)-PCR检测p16INK4ɑ基因甲基化变化,免疫印迹检测NF-κBp65,DNMT1,HDAC1,Cyclin D1,HIF-1α,VEGF,p16INK4ɑ表达,并用免疫细胞化学染色观察A431细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin);用流式细胞仪检测EGCG联合ALA-PDT诱导的A431细胞凋亡。结果:EGCG具有抑制A431细胞增殖并诱导凋亡的作用,抑制效应呈浓度依赖性; p16INK4ɑ基因甲基化水平减低显著;免疫印迹显示NF-κBp65,DNMT1,HDAC1,Cyclin D1,HIF-1α,VEGF表达下调,p16INK4ɑ表达上调; E-cadherin表达上调显著,呈浓度依赖性。EGCG联合ALAPDT治疗组促凋亡作用显著。结论:EGCG对A431细胞具有抑制增殖、血管生成、侵袭的作用,通过影响NF-κB表观遗传修饰诱导细胞凋亡。EGCG联合ALA-PDT的促凋亡作用,增强了A431细胞对ALA-PDT的敏感性。

EGFR信号通路的活化状态与结肠癌细胞对吉非替尼敏感性的关系

目的评价表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂吉非替尼对不同敏感性结肠癌细胞的生长抑制效应及EGFR下游信号通路蛋白的活化状态。方法取结肠癌细胞(Lovo、HCT116、HT29),用吉非替尼(10μmol/L)处理后,采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;另取细胞,用表皮生长因子(EGF,50ng/ml)或EGF+吉非替尼(5、10μmol/L)处理后,采用Western blotting检测PTEN、EG-FR、Akt、MAPK及其相应的磷酸化蛋白(p-EGFR、p-Akt、p-MAPK)的表达。结果在吉非替尼作用下,G1期细胞比例和凋亡率在Lovo细胞中显著增加,在HT29细胞中仅轻度增加,而在HCT116细胞中无明显变化。在单纯EGF作用下,p-EGFR、p-Akt和p-MAPK在Lovo和HT29细胞中表达增加(P<0.05),而在HCT116细胞中无明显变化。在给予EGF的基础上添加吉非替尼后,Lovo细胞中EGFR、p-EGFR、p-Akt、p-MAPK和HT29细胞中p-EGFR的表达被明显抑制(P<0.05),HCT116细胞中p-EGFR的表达下降不如Lovo和HT29细胞明显;Lovo、HT29和HCT116细胞内PTEN的表达均无明显变化(P>0.05)。结论耐受吉非替尼的细胞表现为其生长不依赖EGFR,且下游信号通路的活化状态不伴随EGFR活性受阻而受抑制。结肠癌细胞对吉非替尼的敏感程度是由细胞对EGFR的依赖性以及EGFR和下游信号通路的伴随性所决定的。

A431鳞状细胞异种移植瘤模型中c-Kit信号通路诱导其对EGFRIs耐药机制的影响

目的建立EGFRIs(吉非替尼)耐药的EGFR野生型移植瘤模型,并研究其可能耐药机制。方法雌性BALB/c裸鼠皮下注射A431细胞,肿瘤生长到150×200mm^3,口服给予50mg/kg的吉非替尼,1次/d,连续25周后对EGFRIs产生耐药。比较敏感和耐药移植瘤的全基因组基因表达谱寻找目的基因。耐药模型分别接受空白对照组、吉非替尼、目的基因抑制剂(AMG706),或它们的混合物治疗21d,检测肿瘤组织生长、细胞凋亡、目的基因以及相关细胞因子表达情况。结果 C-kit在吉非替尼耐药的A431异种移植瘤中过表达,双重阻断EGFR和c-Kit信号有协同作用,引起细胞凋亡。结论 A431异种移植瘤模型中诱导的吉非替尼耐药可能与c-Kit过表达有关。EGFRIs和c-Kit抑制剂的联合治疗可能阻断这种耐药机制,抑制肿瘤细胞生长。

外阴鳞状细胞癌肿瘤干细胞的分选和鉴定

目的:分离外阴鳞状细胞癌A-431细胞系中CD44^+的细胞亚群,鉴定其具有肿瘤干细胞特性。方法:采用流式细胞术分选出CD44免疫荧光抗体标记的CD44^+细胞亚群,检测CD133、CD34蛋白在CD44^+和CD44^-中表达的差异,检测CD44^+及CD44^-细胞亚群的细胞周期。结果:A-431细胞系中CD44^+细胞亚群约占4%,胚胎干细胞因子CD133、CD34在CD44^+和CD44^-的VSCC中表达存在显著性差异,主要在细胞膜上表达,CD44^+的肿瘤细胞亚群97.69%处于G_1期,CD44^-的肿瘤细胞亚群61.12%处于S期。结论:在A-431细胞系中CD44可以作为分选肿瘤干细胞的特异性表面标志物,CD133、CD34在CD44^+的肿瘤细胞高表达,可能成为分选外阴鳞癌肿瘤干细胞的特异性表面标志物,CD44^+肿瘤细胞具有典型的干细胞增殖特点。

ABCG2在人皮肤鳞状细胞癌组织及A431侧群细胞中的表达及意义

目的 探讨干细胞相关因子三磷酸腺苷（ATP）结合转运蛋白G超家族成员2（ATP-binding cassette transporter 2，ABCG2）在人皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）组织及A431侧群细胞中的表达。方法 培养人A431细胞，流式细胞仪分选侧群细胞，噻唑蓝（MTT）实验比较侧群、非侧群细胞生长的增殖能力，逆转录PCR检测ABCG2在两者中的表达。免疫组化MaxVision法检测人鳞癌组织中ABCG2表达情况。结果 A431细胞系中存在侧群细胞，约占总细胞数的1.1%。侧群细胞具有较强的生长能力以及克隆形成能力，侧群组和非侧群组24孔板内每孔克隆形成数分别为114.8 ± 4.95和44.5 ± 3.67（t = 27.92，P ＜ 0.01），且侧群细胞ABCG2 mRNA表达量明显高于非侧群细胞（t = 5.22，P ＜ 0.01）。在人鳞癌组织中存在少量ABCG2阳性细胞，ABCG2蛋白主要表达在细胞胞质和胞膜上。结论 人鳞癌细胞A431中存在具有干细胞特性的侧群细胞，高表达ABCG2。ABCG2可作为鳞癌干细胞的表面标志物之一。

黄芩素对人皮肤癌细胞A431生长和运动的影响

目的研究黄芩素(BAI)对人表皮癌细胞A431生长和运动能力的影响。方法选取人表皮癌A431细胞株作为研究材料,运用四甲基偶氮唑蓝(MTT)分析黄芩素对A431细胞生长的作用,选用BAI细胞无毒性浓度(noncytotoxic concentration,NCC)进行实验;划痕实验测定BAI对A431细胞爬行能力的影响。结果黄芩素使A431细胞增殖能力减弱,爬行能力下降。结论黄芩素在NCC抑制A431细胞运动能力。

番茄红素对人皮肤鳞状细胞癌COLO16细胞关键信号受体调控研究

目的探讨番茄红素对人皮肤鳞状细胞癌细胞系COL016细胞关键信号受体调控的影响。方法COL016细胞分为0（对照组）、5、10、15、20、25μmol／L番茄红素6个处理组，处理24h后进行LDH实验确定对细胞活力的影响。根据LDH分泌量确定细胞死亡水平，选取番茄红素对细胞作用的安全浓度信号受体表达量实验，蛋白免疫印迹检测关键信号受体蛋白表达水平。使用SPSS软件进行单因素方差分析，采用Tukey Multiple Comparison和Brown-Forsythe（B）检验方法。结果5、10、15、20、25μmol／L番茄红素处理COL016细胞24h后，25μmol／L组细胞死亡率和对照组比差异有统计学意义（F=13．116，P〈0．05），选取5、10、20μmol／L三个浓度番茄红素处理COL016细胞24h后，表皮生长因子受体蛋白磷酸化水平降低（P〈0．05），糖皮质激素受体蛋白表达水平升高（P〈0．05），而维A酸受体、雄激素受体、孕激素受体蛋白表达水平变化不显著。5、10、20μmol／L番茄红素处理HaCaT、HEK细胞24h后，HaCaT细胞和人原代角质形成细胞中表皮生长因子受体蛋白磷酸化水平和糖皮质激素受体蛋白表达量差异无统计学意义（均P〉0．05）。结论番茄红素可降低COL016细胞活力，抑制表皮生长因子受体蛋白活化，上调糖皮质激素受体表达，这种效应可能有肿瘤细胞特异性。

Caveolin-1与人卵巢癌转移的相关性及其机制的研究

目的探讨窖蛋白-1(caveolin-1)与卵巢癌转移的相关性及其可能的调节机制。方法采用免疫荧光法、蛋白印迹实验及逆转录聚合酶链反应检测人卵巢浆液性囊腺癌高低转移细胞系(HO-8910PM及HO-8910)中caveolin-1基因的表达差异。表皮生长因子(EGF)处理低转移卵巢癌HO-8910细胞后,经上述方法检测caveolin-1基因表达的改变。同时经Transwell小室法检测细胞侵袭、迁移能力的改变。结果 caveolin-1在HO-8910细胞中为高表达,在HO-8910PM细胞中为低表达(P<0.01)。EGF可明显降低HO-8910细胞中caveolin-1基因的表达(P<0.01)并促进细胞侵袭(P<0.01)和迁移(P<0.05)。结论卵巢癌细胞的侵袭、迁移可能与caveolin-1基因表达下降有关,经由EGF/EGFR的信号很可能是caveolin-1介导的卵巢癌转移抑制的重要调节者。

灵芝醇提取物的抗肿瘤活性研究

目的 探究灵芝醇提取物在体内外的抗肿瘤活性。方法 用灵芝醇提取物处理6种人肿瘤细胞系（表皮癌A431、胃癌BGC823、直肠癌Caco2、卵巢癌ES-2、肺癌NCI-H460、结肠癌SW620）,观察细胞的生长形态、绘制生长曲线、进行MTT实验及平板集落形成实验。分别ig给予胃癌BGC823裸鼠50、100、150 mg·kg^（-1）灵芝乙醇提取物,计算瘤体积、抑瘤率及脏器系数。结果 体外实验中,灵芝提取物对表皮癌A431、胃癌BGC823、直肠癌Caco2、卵巢癌ES-2、肺癌NCI-H460、结肠癌SW620细胞的半数抑制浓度分别85.86、193.43、51.32、168.72、82.61、212.98μg·m L^（-1）。体内实验中,灵芝提取物50、100、150 mg·kg^（-1）的抑瘤率分别为32.6%、43.5%、47.2%。结论 灵芝提取物抑制表皮癌A431、直肠癌Caco2、肺癌NCI-H460细胞的增殖作用较强,且浓度大于40μg·mL^（-1）时,抑制增殖的作用较明显,体外还能抑制胃癌BGC823的生长。