沉默LncRNA DLGAP1-AS2对人视网膜母细胞瘤增殖和迁移及侵袭的影响

目的:探讨沉默LncRNA DLGAP1-AS2对人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44增殖、迁移和侵袭的影响及其可能作用机制。方法:收集病理确诊且临床资料完整的视网膜母细胞瘤组织标本25例,同时选取因外伤摘除眼球的正常视网膜组织9例为对照;qRT-PCR法检测正常视网膜组织、视网膜母细胞瘤组织、人正常视网膜血管内皮细胞ACBRI-181、视网膜母细胞瘤细胞HXO-Rb44中DLGAP1-AS2、miR-1193的表达量;将si-NC、si-DLGAP1-AS2、miR-NC、miR-1193 mimic、si-DLGAP1-AS2与miR-1193 inhibitor(共转染)分别转染至HXO-Rb44细胞;双荧光素酶报告实验检测DLGAP1-AS2与miR-1193的靶向关系;CCK-8法、平板克隆形成实验与Transwell实验分别检测细胞增殖、集落形成数、迁移及侵袭;Western blot法检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达量。结果:视网膜母细胞瘤组织中DLGAP1-AS2的表达量高于正常视网膜组织(P<0.05),而miR-1193的表达量低于正常视网膜组织(P<0.05);HXO-Rb44细胞中DLGAP1-AS2的表达量高于ACBRI-181细胞(P<0.05),miR-1193的表达量低于ACBRI-181细胞(P<0.05);DLGAP1-AS2可靶向调控miR-1193的表达;转染si-DLGAP1-AS2或转染miR-1193 mimic可抑制HXO-Rb44细胞增殖、迁移及侵袭;共转染si-DLGAP1-AS2与miR-1193 inhibitor可降低转染si-DLGAP1-AS2对HXO-Rb44细胞增殖、迁移及侵袭的作用。结论:沉默DLGAP1-AS2可通过靶向调控miR-1193表达而抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖、迁移及侵袭。

川芎嗪抑制人视网膜母细胞瘤SO-RB50生长机制的研究

目的:研究川芎嗪对人视网膜母细胞瘤(RB)SO-RB50细胞增殖的影响,并探讨其作用与趋化因子CXCR4表达水平之间的关系。方法:体外培养人SO-RB50细胞,经川芎嗪处理不同时间后,应用MTT法检测SO-RB50细胞的增殖抑制;采用荧光定量逆转录PCR和蛋白免疫印迹法分别从基因和蛋白质水平检测川芎嗪对SO-RB50细胞趋化因子受体CXCR4表达的影响,进而应用流式细胞仪检测SO-RB50细胞的细胞周期分布。结果:MTT结果显示川芎嗪对人SO-RB50细胞增殖有明显的抑制作用,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01);细胞周期结果显示川芎嗪处理后的SO-RB50细胞G0/G1期增多,S期细胞减少,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);通过荧光定量逆转录PCR及蛋白免疫印迹实验证明,川芎嗪能下调人SO-RB50细胞CXCR4的表达水平。结论:川芎嗪对人SO-RB50细胞的增殖有明显抑制作用,且能下调SO-RB50细胞中与肿瘤发生及生长密切相关的CXCR4表达水平。

大蒜素和顺铂联合作用对人视网膜母细胞瘤细胞凋亡影响的研究

目的:探讨大蒜素和顺铂联合应用对人视网膜母细胞瘤细胞的抑制作用,及其对人视网膜母细胞瘤细胞凋亡的影响。方法:人视网膜母细胞瘤细胞株,经复苏,孵育,传代分为4个实验组,分别用大蒜素、顺铂、大蒜素和顺铂联合处理人视网膜母细胞瘤细胞,在不同时间(24、48、72 h)观察细胞的形态,并应用免疫细胞化学SP法检测不同处理条件下和各时间点bcl-2和PDCD5的表达情况。结果:人视网膜母细胞瘤细胞在大蒜素、顺铂以及大蒜素和顺铂联合作用下,细胞生长增殖受到抑制,与对照组的人视网膜母细胞瘤细胞相比形态学变化明显。大蒜素、顺铂及两者联合作用均可以下调人视网膜母细胞瘤细胞中bcl-2的表达,上调人视网膜母细胞瘤细胞中PDCD5的表达,大蒜素15μg/mL和顺铂3μg/mL联合用药可增强对人视网膜母细胞瘤细胞的生长抑制,与大蒜素15μg/mL、顺铂3μg/mL单独处理人视网膜母细胞瘤细胞比较,下调bcl-2表达和上调PDCD5表达的作用差异有统计学意义(P<0.05)。结论:大蒜素和顺铂联合用药作用强于单独用药,可进一步提高药物对肿瘤细胞的生长抑制。

siRNA抑制缺氧诱导因子-1ɑ表达对人视网膜母细胞瘤细胞增殖与凋亡的影响

目的观察si RNA抑制人视网膜母细胞瘤表达低氧诱导因子(HIF)对细胞增殖和凋亡的影响。方法以Y-79细胞系为研究对象,分别在正常氧和低氧环境下培养,MTT法检测细胞增殖,RT-PCR和Western blot检测HIF-1ɑm RNA和蛋白质水平的表达变化,si RNA抑制细胞表达HIF-1ɑ,膜联蛋白V-FITC和PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光评估测定法检测半胱天冬酶活性。SPSS 16.0软件包作统计学分析,配对t检验。结果与常氧和低氧环境培养Y79细胞比较,在0、4、8、12 h后HIF-1ɑm RNA和蛋白质数倍高表达。si RNA干扰技术处理24、48、72 h后,常氧环境培养下的Y-79细胞表达HIF-1ɑ呈时间依赖性轻度下降趋势,低氧条件下呈显著下降。si RNA HIF-1ɑ可能是通过上调Bax/Bcl-2比率和活化caspase-9、caspase-3途径促进Y-79细胞凋亡。结论 si RNA HIF-1ɑ下调人视网膜母细胞瘤表达低氧诱导因子,可抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。抑制HIF-1ɑ表达可能是治疗视网膜母细胞瘤的潜在新策略。

大蒜素对人视网膜母细胞瘤细胞中PDCD5表达的影响

目的探讨大蒜素对人视网膜母细胞瘤(Rb)细胞的抑制作用及其对程序化细胞死亡因子5(PDCD5)表达的影响。方法分别用不同质量浓度的大蒜素、顺铂及大蒜素和顺铂联合处理人Rb细胞,在作用24、48、72h后观察Rb细胞的形态,并应用免疫细胞化学法检测不同处理条件下各时间点PDCD5的表达情况。结果人Rb细胞在不同质量浓度大蒜素、顺铂以及大蒜素和顺铂联合作用下,细胞生长受到抑制。不同质量浓度的大蒜素均可以上调人Rb细胞中PDCD5的表达,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。随着大蒜素作用时间的延长,PDCD5的表达依次上升。大蒜素(15μg/mL)和顺铂(3μg/mL)联合用药可增强对人Rb细胞的生长抑制,与单独用药比较,上调PDCD5表达的作用差异有统计学意义(P<0.05)。结论Rb细胞中存在与细胞凋亡有关的PDCD5蛋白低表达。大蒜素可抑制人Rb细胞的生长,且抑制作用具有时间和质量浓度依赖性。大蒜素和顺铂联合用药作用强于单独用药,可提高药物对肿瘤细胞的生长抑制。

奥沙利铂对人视网膜母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨不同浓度奥沙利铂对人视网膜母细胞瘤(RB)细胞Y79增殖及凋亡的影响。方法将Y79细胞于RPMI 1640培养基中进行培养,分别给予0.000、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000μmol·L-1奥沙利铂对Y79细胞进行处理,检测Y79细胞增殖情况、凋亡情况及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性变化。结果不同浓度的奥沙利铂对Y79细胞增殖均有抑制作用,且随着浓度的增加,抑制作用逐渐增强(P<0.05);与0.000μmol·L奥沙利铂比较,0.250μmol·L-1奥沙利铂对Y79细胞增殖已有较强的抑制作用(P<0.05)。0.000、0.250μmol·L-1奥沙利铂处理下Y79细胞凋亡率分别为(2.18±0.43)%、(36.94±1.36)%,0.250μmol·L-1奥沙利铂处理下Y79细胞凋亡率显著高于0.000μmol·L-1奥沙利铂处理时(P<0.01)。0.000、0.250μmol·L-1奥沙利铂处理下Y79细胞中Caspase-3活性分别为(1.97±0.72)%、(5.82±0.64)%,0.250μmol·L-1奥沙利铂处理下Y79细胞中Caspase-3活性显著高于0.000μmol·L-1奥沙利铂处理时(P<0.01)。结论奥沙利铂可抑制人RB细胞增殖,并促进其凋亡。

大蒜素对人视网膜母细胞瘤Rb细胞中Bcl-2表达影响的研究

目的探讨大蒜素对人视网膜母细胞瘤Rb细胞的抑制作用,及其对Bcl-2表达的影响。方法人视网膜母细胞瘤Rb细胞株,经复苏,孵育,传代分为10个实验组。分别用不同浓度大蒜素(5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml)、顺铂(3μg/ml)及大蒜素(15μg/ml)和顺铂(3μg/ml)联合处理人视网膜母细胞瘤Rb细胞,在不同时间(24h、48h、72h)观察Rb细胞的形态,并应用免疫细胞化学SP法检测不同处理条件下和各时间点Bcl-2的表达情况。结果人视网膜母细胞瘤Rb细胞在不同浓度大蒜素、顺铂以及大蒜素和顺铂联合作用下,细胞生长增殖受到抑制,与大蒜素空白液、培养液对照组的Rb细胞相比形态学变化明显。不同浓度的大蒜素均可以下调人视网膜母细胞瘤Rb细胞中Bcl-2的表达,大蒜素作用组与对照组两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。大蒜素下调Bcl-2的表达具有时间和剂量依赖性,随着大蒜素作用时间的延长,Bcl-2的表达依次下降。大蒜素(15μg/ml)和顺铂(3μg/ml)联合用药可增强对人视网膜母细胞瘤Rb细胞的生长抑制,与大蒜素(15μg/ml)、顺铂(3μg/ml)单独处理Rb细胞比较,下调Bcl-2的表达作用具有显著性差异(P<0.05)。结论人视网膜母细胞瘤Rb细胞中存在与细胞凋亡有关的Bcl-2蛋白低表达。大蒜素可抑制人视网膜母细胞瘤Rb细胞的生长,且抑制作用随药物作用浓度的增高和作用时间的延长而增强,具有时间和浓度依赖性。采用免疫细胞化学的方法检测人视网膜母细胞瘤Rb细胞中Bcl-2的表达,发现大蒜素作用组Bcl-2的表达较空白和溶剂对照组低,提示大蒜素抑制人视网膜母细胞瘤Rb细胞的生长与Bcl-2介导的细胞凋亡有关,大蒜素和顺铂联合用药作用强于单独用药,可进一步提高药物对肿瘤细胞的生长抑制。

人视网膜母细胞瘤蛋白真核表达载体的构建及其在前列腺癌细胞中的表达与定位

目的构建人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma 1,RB-1)基因真核表达载体,并在前列腺癌细胞株PC-3中表达,为进一步研究其在前列腺癌发病中的作用和机制打下基础。方法采用PCR方法扩增RB-1基因编码区的全长序列,并加上FLAG标签,利用分子克隆技术将其重组于CMV载体中。利用酶切、序列分析鉴定克隆正确性。转染PC-3细胞,用Western Blot检测其表达,用免疫荧光检测其在细胞中的定位。结果克隆的RB-1真核表达载体完全正确,Western Blot检测到RB-1有表达,免疫荧光检测其主要定位于细胞核内。结论成功地构建了RB-1真核表达载体,其能够在PC-3中高效表达,并主要定位于细胞核内。

粉防己碱对人视网膜母细胞瘤细胞株S0-Rb50增殖凋亡影响的可能机制研究

目的观察粉防己碱(tetrandrine,Tet)通过磷脂酰肌醇-3激酶(PI 3K)/蛋白激酶B(Akt)通路对人视网膜母细胞瘤细胞株S0-Rb50增殖及凋亡的影响。方法对数期生长S0-Rb50细胞分为4组,即对照组、Tet低、中、高剂量组,分别用0、2.5、5.0、10.0μmol/L Tet处理,观察干预24h细胞形态学变化;MTT法检测干预24、48、72h时各组吸光度(A)值;流式细胞术检测干预24h各组细胞周期及细胞凋亡率;实时荧光定量PCR及Western blot法检测干预24h各组细胞PI 3K、Akt、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA和蛋白表达量及裂解的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)蛋白表达量。结果倒置相差显微镜观察发现,对照组细胞形态规则、融合成片,不同干预组细胞随Tet浓度升高细胞体积逐渐减小、核质比例减小,不能融合成片,视野内漂浮细胞或细胞崩解碎片增多。与对照组比较,Tet高剂量组干预24h时A值较低,差异有统计学意义(P<0.05),Tet各剂量组干预48、72h时A值均较低,且随干预剂量升高呈降低趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组MTT试验A值随干预时间的延长呈升高趋势(P<0.05),Tet高剂量组MTT试验A值随干预时间的延长无明显变化(P>0.05)。与对照组比较,Tet各剂量组G 0/G 1、S期细胞占比、PI 3K、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量及pAkt/Akt较低,且随干预剂量升高呈降低趋势,差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,Tet各剂量组G 2/M期细胞占比、凋亡率、Bax mRNA和蛋白相对表达量及cleaved caspase-3蛋白相对表达量较高,且随干预剂量升高呈降低趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论Tet可抑制人视网膜母细胞瘤细胞株S0-Rb50增殖、促进凋亡,可能与抑制PI 3K/Akt信号通路、下调Bcl-2 mRNA和蛋白、上调Bax mRNA和蛋白及cleaved caspase-3蛋白表达相关。

人ERK2基因对人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞生长的影响

目的:构建携带Myc标签的人细胞外信号调节激酶2(ERK2)的真核表达载体,表达Myc-ERK2融合蛋白,检测其对人视网膜母细胞瘤细胞生长的影响。方法:采用PCR技术从乳腺文库中扩增人ERK2基因序列,将其插入pXJ-40载体;将重组质粒与空载体转染人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞系后,Western印迹检测表达情况,并进行生长曲线实验。结果:双酶切和测序鉴定表明Myc-ERK2真核表达质粒构建成功;转染WERI-Rb-1细胞后融合蛋白获得表达,生长曲线实验结果表明ERK2可促进肿瘤细胞的生长。结论:携带Myc标签的人ERK2基因的真核表达载体能在人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞中表达,且能促进该细胞的生长。本实验为进一步研究ERK2在肿瘤尤其是眼恶性肿瘤中的功能奠定了基础。

miR-130b在人视网膜母细胞瘤中的表达及促癌机制研究

目的:检测miR-130b在人视网膜母细胞瘤(RB)中的表达并初步探究其促癌机制。。方法:采用qRT-PCR检测miR-130b在人RB癌组织及癌旁组织、人RB细胞系(HXO-Rb44与Y79)中的表达;采用qRT-PCR、Western Blot及免疫荧光实验检测miR-130b过表达及干扰前后HXO-Rb44与Y79细胞中PTEN的表达水平;采用双荧光素酶报告基因试验验证miR-130b与PTEN的靶向关系;采用共转染实验考察PTEN与miR-130b影响RB细胞系PI3K/Akt信号通路表达的关系。结果:miR-130b在RB癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0. 05)。与ACBRI-181细胞比较,miR-130b在HXO-Rb44与Y79细胞中的表达水平显著增高(P <0. 05)。与RB癌组织比较,PTEN在其癌旁组织中的表达水平显著增高(P<0. 05); miR-130b表达水平与PTEN表达水平呈负相关性(P<0. 001)。过表达miR-130b后的HXO-Rb44细胞PTEN mRNA与蛋白表达水平均显著降低,而干扰miR-130b后的Y79细胞PTEN mRNA与蛋白表达水平均显著升高(P<0. 05)。与miR-130b mimics+PTEN-NC组比较,miR-130b mimics+wt-PTEN组荧光素酶活性明显降低(P<0. 05)。共转染miR-130b mimics+PTEN-NC HXO-Rb44细胞p-Akt 308与p-Akt 473蛋白表达水平显著增高(P<0. 05),PTEN蛋白表达水平显著降低(P<0. 05);共转染miR-130b mimics+PTEN HXO-Rb44细胞中,以上三种蛋白表达水平均未发生明显改变。结论:miR-130b在RB组织及细胞系中呈高水平表达,PTEN为miR-130b的靶基因,miR-130b可能是经负向调控PTEN对PI3K/Akt信号通路的表达产生影响,最终发挥促癌作用。

miR-370通过FoxM1相关通路调控人视网膜母细胞瘤细胞凋亡机制研究

目的探讨miR-370对人视网膜母细胞瘤细胞Y79增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法通过Lipofectamine TM 2000将miR-370-mimics、miR-370-NC及miR-370-inhibitor转染至Y79细胞内,分别建立miR-370过表达组(mimics组)、对照组(NC组)和抑制组(inhibitor组),三组转染24 h、48 h、72 h和96 h时,均使用CCK-8检测各组细胞增殖活性;转染48 h后,RT-PCR检测各组细胞内miR-370表达;Annexin V-FITC/PI联合流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,Western Blot检测各组细胞PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达。结果mimics组细胞miR-370 mRNA表达远高于其他两组(均为P<0.05),inhibitor组细胞miR-370 mRNA表达显著低于其他两组(均为P<0.05)。自转染48 h起,inhibitor组细胞增殖活性显著高于其他两组(均为P<0.05),而mimics组细胞增殖活性显著低于其他两组(均为P<0.05),这种趋势一直持续至转染后96 h。mimics组细胞早期凋亡率显著高于其它两组(均为P<0.05),而inhibitor组细胞早期凋亡率在三组中最低(P<0.05)。mimics组细胞内PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达均显著低于其他两组(均为P<0.05),而inhibitor组细胞内PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达显著高于其他两组(均为P<0.05)。结论miR-370能够抑制人视网膜母细胞瘤细胞Y79的增殖,促进其凋亡,这种影响可能是通过降低PI3K/AKT/FoxM1信号通路的活性实现的。

白藜芦醇对视网膜母细胞瘤SO-Rb50增殖抑制作用的观察

目的观察白藜芦醇对人视网膜母细胞瘤SO-Rb50细胞增殖的影响,并探讨作用机制。方法体外培养的视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞,分别加入6.25、12.5、25、50、100μmol/L白藜芦醇,对照组加入等体积0.5%DMSO,分别孵育24、48 h,MTT方法测定细胞活力,流式细胞术(FCM)测定细胞周期的变化。50μmol/L白藜芦醇孵育48h后,收集细胞,RT-PCR、Western blot分别测定PCNA、Cyclin D、Rb和P16 mRNA和蛋白的表达水平。结果白藜芦醇对视网膜母细胞瘤SO-Rb50增殖具有明显的抑制作用;白藜芦醇处理后,G1期的细胞均显著增加,S期细胞明显减少;50μmol/L白藜芦醇处理48 h显著降低了PCNA和Cyclin D的mRNA和蛋白表达水平,明显提高了Rb和P16mRNA和蛋白表达水平(均P<0.01)。结论白藜芦醇对视网膜母细胞瘤细胞增殖具有明显的抑制作用,其机制可能是下调PCNA和Cyclin D表达、上调Rb和P16表达,进而影响其细胞周期进程,发挥其抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖的作用。

腺病毒介导的人视网膜母细胞瘤94基因对人食管癌细胞辐射增敏作用的研究

目的探讨重组腺病毒人视网膜母细胞瘤94基因（Ad—Rb94）对吖射线杀伤人食管癌EC109细胞的增敏作用。方法将Ad—Rb94体外转染后的EC109细胞，按数字随机表法，分为空白对照组、Ad-LacZ对照组、Ad-Rb94组、照射组和Ad—Rb94联合照射组，观察EC109的细胞的抑制率、细胞周期和Rb蛋白的表达。结果Ad-Rb94组、照射组和Ad—Rb94联合照射组对EC109细胞生长均具有抑制作用，Ad—Rb94联合照射组的抑制效应最强，明显高于Ad—Rb94组和照射组（F=23．31，P〈0．05）。Ad—Rb94联合照射组EC109细胞出现明显的G2期阻滞，G2期细胞所占比例达50％。Ad-Rb94联合照射组表达Rb蛋白的细胞明显增加，阳性率达71％，较Ad—Rb94组和照射组差异有统计学意义（x^2=8．31和6．73，P〈0．05）。结论Rb9d基因联合照射能明显提高对人食管癌细胞的辐射增敏性。

hsa-miR-328-3p对人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1生物学活性的影响

目的探究hsa-miR-328-3p对人视网膜母细胞瘤WERl-Rb-1生物学活性的影响。方法将hsamiR-328-3pmimic、MMP-16分别或两者共转染于WERI-Rb-1细胞。验证hsa-miR-328-3p与MMP-16的靶向关系,检测各组细胞生长、迁移、侵袭能力及各蛋白表达水平。将对照组及miR-328mimic组WERI-Rb-1细胞分别皮下注射入裸鼠体内,30d后处死、取瘤,检测肿瘤组织各蛋白及基因表达水平。结果MMP-16是hsa-miR-328-3p的靶基因,相比较于pc-MMP-16组,过表达hsa-miR-328-3p能显著抑制MMP-16表达,抑制WERI-Rb-1细胞生长、迁移及侵袭(P<0.01)。与对照组比较,miR-328mimic组肿瘤体降低,hsamiR-328-3p表达量上升(P<0.01)。结论过表达hsa-miR-328-3p可靶向抑制MMP-16表达,从而抑制WERI-Rb-1细胞生长、迁移及侵袭,并降低其上皮间质转化程度。

绿原酸对视网膜母细胞瘤细胞株HXO-RB44的生长抑制作用

目的探讨绿原酸(CHA)对体外培养人视网膜母细胞瘤(Rb)细胞株HXO-RB44的作用及机制。方法应用CCK-8体外抑制实验,筛选CHA对体外培养传6代的人Rb细胞株HXO-RB44的最佳抑癌浓度。Western blot检测人Rb细胞株HXO-RB44中抑癌基因Rb1和P16及细胞周期蛋白(Cyclin D2)和细胞周期蛋白依赖激酶(CDK 4)的表达变化;ELISA检测培养基中乳酸脱氢酶(LDH)水平。结果 CCK-8体外抑制实验结果显示,CHA对人Rb细胞株HXO-RB44的最佳抑癌浓度为80μmol/L。经80μmol/L CHA处理5d的HXO-RB44细胞株中,抑癌基因Rb1和P16均有少量表达,而在阳性对照组(HT1080细胞)和未处理的HXO-RB44细胞几乎没有表达。CHA处理5d的HXO-RB44细胞株的Cyclin D2和CDK4的表达明显低于阳性对照组(HT1080细胞)和未处理的HXO-RB44细胞(P<0.01)。CHA处理5d的HXO-RB44的培养基中LDH的含量为(226.75±42.74)U/L,明显低于正常培养的细胞培养基(425.84±31.67)U/L(P<0.01)。结论 80μmol/L CHA可能通过增加HXO-RB44抑癌基因的表达,降低细胞周期蛋白的表达及LDH水平,而抑制HXO-RB44细胞株的增殖。

采用Gateway^(TM)系统构建人Rb94基因重组腺病毒载体

目的采用GatewayTM技术构建人Rb94基因重组腺病毒载体(Ad-hRb94)。方法从人类胚胎中提取总RNA,经反转录得到目的 cDNA,PCR扩增Rb94目的基因片段。设计含有attB侧翼序列的引物,用于重组片段的PCR扩增,在BP重组酶的作用下,将含attB位点的PCR产物与受体载体pDONRTM221发生重组反应,产生入门克隆。在LR重组酶作用下,将入门克隆与带attR1、at-tR2位点的目的载体Ad/CMV/V5-DEST体外重组形成表达克隆Ad-hRb94。经PCR和测序鉴定,将Ad-hRb94线性化后转入293A细胞进行病毒的包装、扩增及病毒滴度测定。结果经PCR和测序证实目的基因Rb94片段按正确方向重组入目的载体中,带Rb94基因的目的载体在293A细胞中包装成功,获得高滴度的病毒颗粒,滴度为9.41×1010pfu/ml。结论本实验利用GatewayTM技术成功构建了Ad-hRb94,为进一步进行肿瘤基因治疗研究奠定了实验基础。

增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因共表达载体的构建和表达

目的构建增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因的真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达。方法用PCR技术对cDNA-Rb质粒中的目的基因片段进行扩增,使用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切,切胶回收DNA片段。将其连接入pEGFP-C1,构建pEGFP-C1/Rb94真核表达载体并再进行酶切鉴定。将重组质粒用脂质体转染法转染至人视网膜母细胞瘤细胞(HXO-Rb44)中,荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达,Western blot检测Rb蛋白的表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果重组克隆载体内的目的片段序列与Rb94基因序列完全一致。pEGFP-C1/Rb94酶切鉴定结果与预期结果一致。荧光显微镜下观察可见转染后的细胞有荧光出现。Western blot检测结果表明Rb94基因得到了有效表达。流式细胞仪检测结果显示,含Rb94基因的细胞凋亡率为(21.17±0.45)%,明显高于其他组(P<0.05)。结论成功构建EGFP和Rb94真核共表达载体,并可在真核细胞中有效表达,Rb94对视网膜母细胞瘤细胞有明显抑制生长作用。