多西环素对TGF-β1诱导的人角膜基质细胞纤维化的抑制作用

目的:探讨多西环素(Doxy)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人角膜基质细胞纤维化的抑制作用。方法:收集飞秒激光微小切口基质透镜取出术(SMILE术)后角膜基质透镜提取人角膜基质细胞,利用TGF-β1诱导人角膜基质细胞建立体外角膜纤维化模型,设置对照组、TGF-β1组、DOXY组。采用CCK-8法检测各组细胞增殖能力、划痕实验检测增殖能力;酶联免疫吸附实验(ELISA)测定胶原合成关键因子羟脯氨酸(HYP)含量;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测纤维化关键因子Thy-1、Vimentin mRNA表达情况;蛋白免疫印迹(western blotting)检测Thy-1、Vimentin蛋白表达水平。结果:与对照组相比,TGF-β1组能促进人角膜基质细胞细胞增殖、迁移,增加HYP含量、Thy-1和Vimentin的表达(均P<0.05)。与TGF-β1组比较,DOXY组细胞增殖、细胞迁移和胶原合成能力明显降低,Thy-1和Vimentin的表达减少(均P<0.05)。结论:Doxy可抑制TGF-β1诱导的人角膜基质细胞细胞增殖、迁移和胶原合成,下调Thy-1、Vinmentin表达水平,从而抑制角膜纤维化。

丹参酮ⅡA对人角膜基质细胞纤维化的抑制作用

目的研究丹参酮ⅡA (tanshinoneⅡA,TSN)对转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的人角膜基质细胞(human keratocyte,HK)纤维化的作用,探索该药物是否具有防治角膜瘢痕的潜能。方法采用胰蛋白酶消化培养HK,并传代至4-7代用于实验。通过TGF-β1诱导建立HK纤维化模型,并分别用5.0μg·L^(-1)TGF-β1和不同浓度的TSN联合给药方法对HK进行处理。采用Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)与Vimentin的表达,qPCR检测纤连蛋白(fibronectin,FN)和I型胶原(collgen I,COL I) mRNA的表达;利用细胞免疫荧光染色观察HK细胞形态的改变氉。结果 5.0μg·L^(-1)TGF-β1可以显著上调α-SMA与Vimentin蛋白的表达和胞外基质成分FN mRNA(2.238±0.227)、COL I mRNA(3.554±0.526)的表达。2.5μmol·L^(-1)和5.0μmol·L^(-1)TSN均能抑制α-SMA蛋白的表达和FN mRNA(0.619±0.017、0.263±0. 006)、COL I mRNA(0.631±0.011、0.275±0.081)的表达。5.0μg·L^(-1)TGF-β1诱导组HK形态呈长梭形,具有两极,细胞呈极性分布; 5.0μmol·L^(-1)TSN联合5.0μg·L^(-1)TGF-β1培养HK形态同原始细胞形态,细胞呈三角形或星形。结论 TSN可抑制TGF-β1诱导的HK纤维化,具有抗角膜瘢痕的潜力。

树鼩角膜基质永生化细胞系的构建及其在病毒感染性方面的研究

目的建立树鼩永生化角膜基质细胞(corneal stromal cells,CSCs)系,并探讨其在病毒感染中的应用。方法利用组织块贴壁培养法分离培养树鼩原代CSCs,将携带SV40T基因的慢病毒转染细胞后,再挑取单克隆进行传代培养,传至50代以上进行形态学观察并与40代细胞形态进行比较,波形蛋白(vimentin)和SV40T基因免疫荧光鉴定、核型鉴定、细胞增殖曲线测定。用单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)(McKrae株)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)(GZ01株)、登革病毒Ⅱ型以及甲型流感病毒H1N1(PR8株)在该细胞上进行病毒感染实验。结果传至50代以上的树鼩永生化CSCs呈梭形,细胞形态结构与40代相比仍较好。vimentin和SV40T基因免疫荧光表达阳性。增殖曲线结果显示:细胞生长旺盛,第4~5天时处于对数生长期。原代细胞核型的染色体数稳定为62条,而永生化细胞第21、56代突变为64条且保持稳定。病毒感染实验显示:树鼩永生化CSCs对HSV-1(McKrae株)、ZIKV(GZ01株)、登革病毒Ⅱ型以及H1N1(PR8株)病毒敏感,产生较高感染滴度,分别为1.32×105、5.62×106、2.69×107、7.76×104CCID50/mL。结论成功建立了树鼩永生化CSCs细胞系,提示该细胞系可用于单纯疱疹病毒、寨卡病毒、登革病毒和甲型流感病毒感染眼角膜疾病的作用机制及抗病毒药物的研究。

转化生长因子-β1介导的角膜基质细胞外基质纤维化体外三维培养模型的构建

背景 角膜损伤修复过程中细胞外基质（ECM）纤维化是角膜瘢痕形成的基础,转化生长因子-β1（TGF-β1）可引起角膜基质过度产生ECM.我们在前期的研究工作中构建了角膜基质三维培养模型,而将TGF-β1添加于该三维培养体系中是否可达到构建角膜基质ECM纤维化的体外三维培养模型有待研究.目的 评估TGF-β1对该三维培养模型中ECM纤维化相关基因表达的影响,确定该三维培养体系是否可以作为角膜基质ECM纤维化的体外三维培养候选模型.方法分离新鲜成年牛角膜,并在基础培养液（DMEM/F12＋体积分数10％胎牛血清）中进行角膜基质细胞的培养,将5＆#215;105个牛角膜基质细胞收集于15 ml离心管中构建体外三维培养模型（Pellet）,根据培养液中添加的TGF-β1质量浓度的不同分为基础培养液组（无TGF-β1）、基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β1组和基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β1组,于培养2周时用钙黄绿素-AM/碘化丙啶法（Calcein-AM/PI）法进行细胞活性测定;分别于培养后48 h、1周和2周应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）和Western blot法检测各组Pellet中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原（Col Ⅰ）、ColⅢmRNA及其蛋白的表达. 结果 Pellet模型培养后48 h,角膜基质细胞开始抱团,培养后2周经Calcein AM/PI染色证实绝大多数细胞存活.培养后48 h、1周和2周,基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β1组和基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β1组角膜基质细胞中α-SMA、Col Ⅰ和ColⅢmRNA的相对表达量均明显高于基础培养液组,3个组间的总体差异均有统计学意义（F分组=696.745,P＜0.001;F分组=35.166,P＜0.001;F分组=33.677,P＜0.001）,且随着培养时间的延长,α-SMA、Col Ⅰ和ColⅢmRNA的相对表达量逐渐升高,差异均有统计学意义（F时间=5.863,P＜0.05;F时间=298.614,P＜0.001;F时间=607.472,P＜0.001）;ColⅢmRNA合成速率均大于Col Ⅰ mRNA的合成速率;Western blot检测发现,培养后48 h和1周α-SMA、Col Ⅰ和ColⅢ蛋白的表达量为微量,培养后2周基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β1组Pellet模型中α-SMA、Col Ⅰ和ColⅢ蛋白的相对灰度表达量分别为0.395±0.208、1.060±0.175和0.629±0.382,基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β1组o-SMA、Col Ⅰ和ColⅢ蛋白的灰度表达量分别为0.758±0.228、1.201±0.187和0.753 ±0.468,组间总体比较差异均有统计学意义（α-SMA：F=10.691,P＜0.05;Col Ⅰ：F=14.094,P＜0.05;ColⅢ：F=10.995,P＜0.05）. 结论 培养液中添加TGF-β1和血清促进角膜ECM的纤维化,表现为Pellet三维培养模型中牛角膜基质细胞高表达纤维化特异性标志物.该培养体系可作为角膜基质ECM纤维化研究的体外三维培养模型.

皮肤成纤维细胞构建组织工程化猪角膜基质样组织

目的探讨以皮肤成纤维细胞为种子细胞,在猪角膜微环境中构建组织工程化角膜基质组织的可行性。方法分离获取胎猪皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增。通过转染绿色荧光蛋白(GFP)基因标记细胞,示踪细胞的转归。选取第3代的细胞接种于可吸收生物材料聚羟基乙酸(PGA),形成细胞-生物材料复合物,体外培养1周后,移植于猪的角膜基质层内,于第8周取材进行大体、组织学检查及超微结构观察。以角膜基质细胞为种子细胞构建的组织工程化角膜基质组织作为对照。结果术后8周,实验组角膜逐渐恢复透明,与对照组角膜无明显差别。组织学检查显示形成新生的角膜基质样组织,呈板层状,排列较规则,与对照组角膜组织相似。超微结构观察及胶原纤维直径检测显示,实验组与对照组角膜组织差异无统计学意义。荧光显微镜观察到GFP阳性细胞存在。结论皮肤成纤维细胞可能替代角膜基质细胞,在猪角膜内构建角膜基质样组织。

吡非尼酮抑制转化生长因子β1诱导的大鼠角膜基质细胞纤维化

目的观察吡非尼酮(PFD)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠角膜基质细胞向成纤维细胞转化过程的影响,探讨PFD抗角膜基质纤维化的作用。方法分离培养大鼠角膜基质细胞,免疫细胞化学法检测波形蛋白(Vimentin)进行细胞鉴定。实验分为对照组(DMEM+10%FBS)、TGF-β1组(2 ng/mL TGF-β1+DMEM+10%FBS)和PFD组(1 mg/mL PFD+2 ng/mL TGF-β1+DMEM+10%FBS)。CCK-8法检测细胞增殖能力,Western blot检测细胞CollagenⅠ、CollagenⅢ、Keratocan和CD90蛋白表达。结果大鼠角膜基质细胞呈Vimentin胞浆阳性。与对照组及TGF-β1组比较,PFD组细胞的增殖OD值显著减低(P<0.05)。Western blot显示PFD组的细胞CollagenⅠ、Keratocan蛋白表达增强而CollagenⅢ和CD90蛋白表达减弱(P<0.05)。PFD组的CollagenⅢ/CollagenⅠ比值在3组中最低(P<0.05)。结论 PFD抗角膜基质细胞纤维化是通过抑制TGF-β分子途径,从而影响胶原合成和Keratocan、CD90蛋白表达实现的。

补肾祛瘀法对中重度宫腔粘连的抗纤维化作用及经血中细胞外基质降解相关因子的影响

【目的】探究补肾祛瘀法对中、重度宫腔粘连的抗纤维化作用及经血中细胞外基质降解相关因子的影响。【方法】将124例肾虚血瘀证中、重度宫腔粘连并拟行宫腔镜宫腔粘连分离术(TCRA)的患者随机分为研究组和对照组,每组各62例。2组患者均给予TCRA治疗,对照组术后给予黄体酮+戊酸雌二醇片治疗,研究组在对照组的基础上联合补肾祛瘀方(以归肾汤加减)治疗,共治疗3个月经周期。观察2组患者治疗前后月经情况、阴道彩色多普勒超声检查指标、肾虚血瘀证评分和宫腔粘连评分的变化情况,检测2组患者治疗前后的血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板源性生长因子(PDGF)、结缔组织生长因子(CTGF)以及基质金属蛋白酶9(MMP-9)m RNA、基质金属蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)mRNA、磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)m RNA、Ⅰ型胶原A1蛋白(COL1A1)mRNA的表达水平,并评估2组患者的临床疗效和安全性。【结果】(1)疗效方面:治疗3个月经周期后,研究组患者的总有效率为93.55%(58/62),对照组为80.65%(50/62),组间比较,研究组的疗效明显优于对照组(P<0.05)。(2)月经情况方面,治疗后,2组患者的月经经量、周期、经期均较治疗前明显改善(P<0.05),且研究组患者治疗后的月经经量、周期、经期的恢复情况均明显优于对照组(P<0.05)。(3)阴道彩色多普勒超声检查方面,治疗后,2组患者的子宫血流指数(FI)、搏动指数(PI)、阻力指数(RI)、宫腔容积、子宫内膜厚度等均较治疗前明显改善(P<0.05),其中,研究组患者治疗后的FI、宫腔容积、子宫内膜厚度均明显高于对照组,PI、RI均明显低于对照组(P<0.05或P<0.01)。(4)宫腔粘连评分和肾虚血瘀证评分方面,治疗后,2组患者的宫腔粘连评分和肾虚血瘀证评分均较治疗前明显下降(P<0.05),且研究组患者治疗后的宫腔粘连评分和肾虚血瘀证评分均明显低于对照组(P<0.01)。(5)相关因子表达方面,治疗后,2组患者的VEGF、TGF-β1、PDGF、CTGF水平均较治疗前明显下降(P<0.05),且研究组患者治疗后的VEGF、TGF-β1、PDGF、CTGF水平均明显低于对照组(P<0.01)。(6)相关蛋白基因表达方面,治疗后,2组患者经血中MMP-9、PI3K m RNA相对表达量均较治疗前明显上升(P<0.05),COL1A1 mRNA相对表达量均较治疗前明显下降(P<0.05),其中研究组患者治疗后经血中MMP-9、PI3K mRNA相对表达明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。(7)安全性方面,对照组的不良反应总发生率为25.81%(16/62),研究组为16.13%(10/62);组间比较,差异无统计学意义(P>0.05),且经对症处理后,2组患者的不良反应症状均消失,同时研究过程中未见与服用中药相关的不良反应。【结论】补肾祛瘀方联合西药治疗宫腔粘连TCRA术后患者较单用西药治疗效果更佳,加用补肾祛瘀方可进一步促进患者月经恢复,改善子宫内膜血流循环,增加子宫内膜厚度,调节患者体内纤维化因子表达,并可上调PI3K、MMP-9 mRNA表达,恢复患者细胞外基质(ECM)平衡,预防宫腔再粘连,且临床使用安全。

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨子宫内膜来源间充质干细胞抑制子宫内膜纤维化的机制

目的探讨Wnt/β-catenin信号通路介导间质上皮转化(EMT)在子宫内膜来源间充质干细胞(eMSCs)抑制子宫内膜纤维化中的作用机制。方法将18只雌性SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组和eMSCs组,每组6只。Sham组的大鼠在剖腹手术后不接受任何形式的子宫介入手术。Model组和eMSCs组建立子宫内粘连大鼠模型。eMSCs组在模型损伤后立即移植eMSCs细胞悬液进行治疗,总量为每子宫0.05 ml(2×107细胞/ml)。3周后收集单侧损伤子宫进行苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色。通过蛋白质印迹分析子宫内膜纤维化、EMT、Wnt/β-catenin通路蛋白表达。结果Model组大鼠宫腔结构破坏,腺体数量明显减少并积聚大量蓝色胶原纤维,但在eMSCs治疗后子宫内膜腺体数量显著增加,并且纤维化面积显著降低。与Sham组相比,Model组中I型胶原和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白的表达水平显著增加(P<0.05),但在eMSCs组中均显著减少(P<0.05)。在Model组中,N-cadherin、Vimentin和ZEB1的表达显著增加,而E-cadherin的表达减少。然而,在eMSCs组中,上述分子蛋白质的变化完全相反。与Sham组相比,Model组β-连环蛋白(β-catenin)和C-myc表达增加(P<0.05)。与Model组相比,eMSCs组中周期蛋白E(CyclinE)、β-catenin和C-myc表达增加(P<0.05)。结论eMSCs可以通过抑制EMT和子宫内膜纤维化来促进子宫内粘连大鼠子宫内膜修复,这种作用部分是通过激活Wnt/β-catenin信号通路来实现。

汉防己甲素等5种抗纤维化药物对离体兔角膜基质细胞的抑制作用

目的比较汉防己甲素等5种抗纤维化药物对离体兔角膜基质细胞的抑制作用,为减轻角膜创伤愈合反应提供一种新药。方法选用原代及传代兔角膜基质细胞,实验组分别加入含不同浓度汉防己甲素、TGF-β抗体、α-2b干扰素、维拉帕米、氟美童的培养液,对照组加入含等量PBS的培养液,分别培养24h、48h、72h后,采用MTT法检测其对细胞增殖的抑制作用,计算出抑制率和IC50,并对其进行比较。结果汉防己甲素在各时间段各浓度组,均能明显抑制角膜基质细胞的增殖,其24h、48h、72h的IC50分别为4·407mg·L-1、3.758mg·L-1和3.524mg·L-1,并具有明显的时间剂量-效应依赖关系。TGF-β抗体在各时间段各浓度组均有较强抑制作用,其IC50分别为6.550mg·L-1、4.060mg·L-1和3.860mg·L-1。α-2b干扰素在各时间段各浓度组均有抑制作用,但作用都较弱。维拉帕米的抑制作用不确切。氟美童在各时间段各浓度组均有确切的抑制作用,其IC50分别为36.190mg·L-1、43.742mg·L-1和47.052mg·L-1。结论在5种药物中,汉防己甲素对离体兔角膜基质细胞增殖的抑制作用最强,且明显强于激素类药物氟美童,因此在减轻角膜创伤愈合方面具有潜在的运用前景。

基于氧化应激和细胞外基质构建圆锥角膜的基因预测模型

目的氧化应激(OS)和细胞外基质(ECM)降解与圆锥角膜(KC)发生密切相关。基于OS和ECM构建KC基因预测模型,可为KC早期诊断和治疗提供新视角。方法分析KC转录组数据并筛选与OS和ECM基因集的共有差异表达基因(OEDEGs);通过LASSO和SVM_REF算法提取OEDEGs中的关键特征基因,利用LR、SVM及NB算法构建OS和ECM相关的KC基因预测模型;通过内、外部数据集及RT-PCR验证模型的有效性,并探究模型基因对角膜上皮细胞(HCET)应答活性氧(ROS)和ECM刚度变化的影响。结果与正常角膜相比,454个基因在KC差异表达,其主要参与细胞外基质重塑、炎症等信号通路;对17个OEDEGs进行分析得到6基因(COL1A1、CYP1B1、MMP3、HMOX1、GDF15和FOS)的KC预测模型;与RNA-Seq结果一致,模型基因在人KC临床样本均表达下调;HCET细胞中,6个模型基因的表达伴随ECM刚度降低而降低,4个模型基因应答过氧化氢(H2O2)处理发生表达变化(CYP1B1降低,FOS、GDF15和HMOX1升高);CYP1B1低表达或GDF15高表达促进HCET细胞增殖并增加H2O2的杀伤作用,敲低HOMX1和FOS不影响HCET细胞增殖和H2O2敏感性。结论成功构建了基于OS和ECM的KC基因预测模型,初步验证了模型基因对HCET细胞应答ROS和ECM刚度变化的调控作用。

细胞外基质微环境在心脏纤维化发生发展中的作用和机制

目的心脏纤维化与细胞力学微环境关系密切,生物力学刺激通过力学信号转导调控细胞生物功能,促进心脏纤维化的发生发展。本研究的目的是研究巨噬细胞Piezo1在心脏纤维化中的功能。方法对公共数据库心力衰竭数据进行生物信息学分析,该项研究选择8周龄的SPF级雄性C57BL/6J小鼠为研究对象,随机分成对照组和试验组,每组3只。对照组给予普通饲料以及饮水喂养,试验组予以高脂饲料(含60%脂肪)以及含0.5 g/L Nω-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(Nω-nitro-Larginine methyl ester hydrochloride,L-NAME)的饮水。持续饲喂4周,成功构建心力衰竭HFp EF模型,采集心脏组织进行单细胞转录组测序,数据下机后使用Cellranger软件进行定量,对捕获的高质量细胞使用经典的细胞Marker进行细胞注释。结果本研究共定义了包括成纤维细胞(Dcn)、内皮细胞(Pecam1)和M1型巨噬细胞(Cd86)在内的10类主要细胞类型;其中HFp EF试验组心脏中的心肌成纤维细胞表现出高代谢和高纤维化表型;Piezo1基因在HFp EF试验组的M1型巨噬细胞特异性高表达。结论本研究对公共数据进行深入分析,明确了分泌促炎性细胞因子和趋化因子的M1巨噬细胞在心脏纤维化发生发展过程中扮演重要角色,靶向Piezo1通道可能是治疗心脏纤维化的潜在策略。

PVT1通过TGF-β1/SMAD通路促进子宫内膜基质细胞过度纤维化的研究

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)浆细胞瘤多样异位基因1(PVT1)在调控子宫内膜基质细胞纤维化中的病理生理作用及分子机理。方法通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测人子宫内膜基质细胞(HESCs)中PVT1、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、转化生长因子-β1(TGF-β1)、SMAD2及SMAD3的表达水平。结果PVT1过表达促进HESCs增殖(P<0.05),而PVT1沉默抑制HESCs增殖(P<0.05)。过表达PVT1在HESCs中上调胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白ⅢmRNA的表达(P<0.05),而PVT1被敲除时,胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白ⅢmRNA的表达水平被显著下调(P<0.05)。过表达PVT1在HESCs中可以进一步上调TGF-β1/SMAD信号相关基因(TGF-β1、SMAD2、SMAD3)的表达(P<0.05)。当PVT1被敲除时,TGF-β1/SMAD信号相关基因胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白ⅢmRNA的表达水平被显著下调(P<0.05)。PVT1可诱导HESCs上清液中TGF-β1的产生(P<0.05)。结论PVT1可通过TGF-β1/SMAD通路促进子宫内膜基质细胞过度纤维化而产生胶原蛋白。同时,PVT1可能是一个用于治疗子宫内膜粘连的新靶点。

基于巨噬细胞-肌成纤维细胞转分化的肾间质纤维化病理机制及药物干预作用

在肾间质纤维化过程中,骨髓中募集的巨噬细胞可在损伤的肾脏中直接转化为肌成纤维细胞。巨噬细胞-肌成纤维细胞转分化(MMT)是肾间质纤维化的重要病理机制之一。在MMT过程中,巨噬细胞的活化受转化生长因子-β1、Janus激酶3/信号转导及转录活化因子6、Wnt等信号通路调控,阻断这些信号通路可抑制MMT,改善肾间质纤维化。在临床及体内外实验中,针对防治肾纤维化的药物干预研究较活跃,其中某些药物的干预作用可能与巨噬细胞及MMT相关。因此,深入研究肾脏MMT的病理机制及药物干预作用可以为相关疾病的治疗提供新思路。

辐射合成的温敏材料上兔角膜基质细胞的培养

目的:探索以电子加速器合成具有温度敏感特性的聚异丙基丙烯酰胺凝胶(PNIPAAm)及接枝有PNIPAAm水凝胶的培养皿的方法,及兔角膜基质细胞在温敏材料PNIPAAm水凝胶上的生长条件及特性,以及利用PNIPAAm水凝胶获得的细胞片。方法:55%N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)单体和0.5%的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的异丙醇溶液70μL,加入到35 mm培养皿上,电子加速器下辐射合成温敏材料(PNIPAAm),后续处理后,接种兔角膜基质细胞体外培养。结果:按本实验中的单体配方以及辐射合成方案,能够在培养皿表面合成PNIPAAm,角膜基质细胞能在部分接枝了PNIPAAm的培养皿上生长,并能成片脱离。结论:使用辐射合成温敏培养皿能够获得单层及多层无载体的角膜基质细胞片。

姜黄素对角膜基质细胞纤维化的抑制作用

背景角膜的创伤或手术可导致角膜基质细胞纤维化，进而形成瘢痕。研究表明姜黄素可明显减轻组织的纤维化程度，但姜黄素是否会影响角膜基质细胞纤维化的研究尚少。目的观察不同质量浓度的姜黄素对小鼠角膜基质细胞向成纤维细胞转化过程的影响，探讨姜黄素抗角膜基质纤维化的作用。方法150只6～8周龄BALB／c小鼠，分离角膜基质细胞并在含质量分数10％胎牛血清（FBS）的DMEM中进行培养，以原代角膜基质细胞重悬于DMEM中并分为5组：（1）空白对照组（DMEM＋10％FBS，含质量分数1％。DMSO，CG组）。（2）低剂量组（CG＋7．5mg／L姜黄素组）。（3）中剂量组（CG＋10mg／L姜黄素组）。（4）高剂量组（CG＋12．5mg／L姜黄素组）。（5）无诱导剂组（DMEM，含1％oDMSO）。上述因素干预7d后，用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测各组中细胞表型keratocan、醛脱氢酶（ALDH）、CD90、decorin、fibronectin一1的表达。用MTS法检测姜黄素对角膜基质细胞增生的影响。制备小鼠角膜冰冻切片，采用免疫荧光技术检测角膜基质细胞内fibronectin-1的表达。结果原代培养的角膜基质细胞呈梭形，为细胞质丰富且核大的角膜基质成纤维细胞。随着姜黄素质量浓度的增加，角膜基质细胞中keratocanmRNA、ALDHmRNA的表达量增加，CD90mRNA和decorinmRNA的表达量减少，差异均有统计学意义（P〈O．05），fibronectin-1mRNA的表达变化差异无统计学意义（P〉0．05）。MTS法检测发现，随着姜黄素质量浓度的增加，对角膜基质细胞增生的抑制率逐渐增加（F=956．00，P〈0．05）。免疫荧光技术检测发现角膜基质细胞中fibronectin-1的表达呈红色荧光。结论姜黄素对离体小鼠角膜基质细胞纤维化有明显的抑制作用，可减轻角膜基质创伤修复过程中的过度纤维化。

脱细胞猪角膜基质深板层移植治疗感染性角膜炎的疗效观察

目的:评价脱细胞猪角膜基质深板层移植治疗感染性角膜炎的有效性、安全性。方法:前瞻性研究。收集2017-02/2020-10在我院经药物保守治疗无效的感染性角膜炎患者17例17眼,应用脱细胞猪角膜基质进行深板层角膜移植手术。术后随访6 mo,观察BCVA、角膜上皮愈合情况、角膜透明情况,并记录有无感染复发以及植片排斥。结果:所有患者中均顺利完成深板层角膜移植手术,均未发生术中并发症,无失访病例,术后角膜感染均得到有效控制。术后BCVA均较术前改善(P<0.05)。17眼中16眼术后1 mo上皮完全覆盖角膜植片,仅1眼上皮未完全愈合,为病毒性角膜炎的反复发作。术后1.5 mo所有患者上皮均完全愈合。术后1 mo角膜水肿开始改善,其中1眼角膜植片轻度混浊,16眼中重度混浊;术后3-6 mo角膜透明度稳定,至术后6 mo时4眼完全透明,6眼轻度混浊,6眼中度混浊,1眼重度混浊。随访过程中,无感染复发,有1眼发生眼压升高现象,经治疗后眼压恢复正常。结论:脱细胞猪角膜基质深板层移植治疗感染性角膜炎,不仅能有效控制感染,缓解患者角膜刺激症状,恢复角膜的解剖与功能,而且能维持良好的透明性,提高患者视力,可作为替代同种异体人角膜。

芍药苷对血管紧张素Ⅱ诱导心肌成纤维细胞纤维化的保护作用

背景:研究表明芍药苷对肝、肾等器官纤维化具有改善作用,尤其是在肝纤维化中表现出突出优势,但芍药苷对于血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化的保护作用尚不明确。目的:探讨芍药苷对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞的保护作用及分子机制。方法:在分离培养的SD大鼠乳鼠心肌成纤维细胞中加入血管紧张素Ⅱ(1μmol/L)干预48 h作为模型组;芍药苷低、高剂量组给予不同剂量的芍药苷(50,100μmol/L)预处理2 h,再用血管紧张素Ⅱ处理48 h;SIRT1抑制剂组先用10μmol/L SIRT1抑制剂EX527处理2 h,再用100μmol/L芍药苷处理2 h,最后用血管紧张素Ⅱ处理48 h。采用CCK-8法检测细胞活力,Transwell检测细胞迁移能力,用DHA荧光探针检测细胞内活性氧水平,用试剂盒检测氧化应激标志物水平,Western blot检测纤维化相关基因的蛋白表达,qRT-PCR检测细胞外基质和纤维化相关基因的mRNA表达。结果与结论:①与对照组相比,血管紧张素Ⅱ干预后心肌成纤维细胞的增殖、迁移能力明显提高,细胞内活性氧和丙二醛水平升高,超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性降低,α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤维连接蛋白、结缔组织生长因子、基质金属蛋白酶9的mRNA表达增加;与模型组相比,芍药苷剂量依赖性抑制上述效应改变(P<0.01);②与模型组相比,芍药苷剂量依赖性上调SIRT1的蛋白表达(P<0.001);③与芍药苷高剂量组相比,SIRT1抑制剂组细胞迁移数量、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白表达水平显著增加(P<0.01)。结果表明,芍药苷可能通过上调SIRT1的表达,有效减轻了血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞纤维化改变,剂量依赖性地抑制了心肌成纤维细胞氧化应激和细胞外基质沉积,对于心肌成纤维细胞纤维化具有保护作用。

低剂量TGF-β1维持三维培养模型中牛角膜基质细胞生长和缓解细胞外基质纤维化的作用

背景转化生长因子（TGF）-β1在角膜损伤修复过程中发挥重要作用，不同剂量的TGF-β1对角膜细胞外基质（ECM）的合成具有不同影响，从而影响瘢痕形成的程度。既往研究多集中于高质量浓度TGF-β1对二维培养的角膜基质细胞的影响，而低质量浓度TGF-β1对角膜基质细胞ECM合成的影响鲜见研究。目的研究低质量浓度TGF-β1对体外三维培养的角膜基质细胞生长状况及ECM合成的影响。方法采用两步胶原酶消化法从新鲜牛眼中分离牛角膜基质细胞并置于含体积分数10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基，利用Pellet体外三维培养模型对牛角膜基质细胞进行培养。将细胞分为0.25 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组和0.50 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组，分别于培养后48 h、1周、2周、3周观察Pellet培养模型的形态变化。于培养后3周采用苏木精－伊红染色法对Pellet培养模型进行常规组织形态学检查，采用钙黄绿素-AM/碘化丙啶法（Calcein-AM/PI法）于激光扫描共焦显微镜下检查角膜基质细胞的死亡率；采用实时荧光定量PCR及免疫荧光细胞化学法分别检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤维连接蛋白（FN）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）和Col Ⅲ mRNA及其蛋白的相对表达量；采用实时荧光定量PCR法检测细胞中角膜蛋白（KERA）mRNA和基膜聚糖（LUM）mRNA的表达。结果培养后48 h、1周、2周和3周Pellet细胞均成团生长。苏木精－伊红染色可见，Pellet球内均有大量红色淡染的胶原纤维以及大部分正常的成纤维细胞和少量坏死的成纤维细胞，坏死细胞可见细胞形态破坏，呈均质红染，且0.25 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组和0.50 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组培养细胞形态无明显差别。0.25 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组和0.50 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组细胞死亡率分别为（33.60±1.65）%和（30.90±0.78）%，差异无统计学意义（t＝0.144，P＝0.887）。0.25 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组Pellet培养模型中α-SMA、FN、Col Ⅲ蛋白表达量均低于0.50 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组，差异均有统计学意义（tα-SMA＝4.622，P＝0.010；tFN＝2.973，P＝0.040；tCol Ⅲ＝7.845，P〈0.001），0.25 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组ColⅠ的表达量明显高于0.50 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组，差异有统计学意义（tColⅠ＝4.022，P＝0.016）。在转录水平和蛋白表达水平，0.25 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组Col Ⅲ/ColⅠ比值均低于0.50 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组，差异均有统计学意义（tmRNA＝－3.039，P＝0.038；t蛋白＝3.215，P＝0.032）。培养后48 h、1周、2周Pellet培养模型中KERA mRNA和LUM mRNA均呈阳性表达，0.25 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组LUM mRNA相对表达量随培养时间延长而逐渐增加；0.50 ng/ml TGF-β1＋5% FBS组LUM mRNA相对表达量于培养后1周时达峰值。2个组Pellet培养模型中KERA mRNA相对表达量均在培养后1周达峰值。结论低剂量的TGF-β1既能够维持Pellet体外三维培养模型中角膜基质细胞的生长并合成ECM，也使ECM组成成分的合成倾向于正常状态，以减少瘢痕化修复的趋势。

MicroRNA-29a-3p调控转化生长因子β1诱导的人角膜基质细胞的肌成纤维细胞转化

目的探讨MicroRNA-29a-3p对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人角膜基质细胞肌成纤维细胞转化的影响。方法本实验选用培养至2~4代的人角膜基质细胞,分别设置对照组、TGF-β1组、miR-29a过表达对照+TGF-β1组、miR-29a过表达+TGF-β1组、miR-29a抑制表达对照+TGF-β1组及miR-29a抑制表达+TGF-β1组。采用TGF-β1体外诱导的人角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化,细胞饥饿过夜之后,在无血清的条件下转染miR-29a 24 h;然后以浓度5 ng/mL加入TGF-β1,无血清培养48 h。采用CCK-8法检测细胞活力,采用细胞总RNA提取法提取细胞总RNA,逆转录成cDNA后采用实时荧光定量PCR法检测目的相应指标的表达情况,Western Blot法检测相应蛋白的表达。结果人角膜基质细胞呈多角形,树突状,排列规则。按实验设计处理完细胞之后,各组细胞活性差异无统计学意义(P>0.05),转染效果良好。与对照组比较,TGF-β1组平滑肌肌动蛋白α(αSMA)的mRNA表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.001);与miR-29a过表达对照+TGF-β1组比较,miR-29a过表达+TGF-β1组αSMA mRNA表达有明显下降,差异有统计学意义(P=0.001);与miR-29a抑制表达对照+TGF-β1组比较,miR-29a抑制表达+TGF-β1组αSMAmRNA表达有明显上升,差异有统计学意义(P=0.019)。同时,αSMA在蛋白水平的表达结果可得,对照组与TGF-β1组相比,αSMA的相对表达量显著升高,差异有统计学意义(P<0.001);miR-29a过表达+TGF-β1组与miR-29a过表达对照+TGF-β1组相比αSMA的相对表达量明显降低,差异有统计学意义(P=0.007);而该指标在miR-29a抑制表达+TGF-β1组与miR-29a抑制表达对照+TGF-β1组的比较中增高且差异有统计学意义(P=0.034)。结论MicroRNA-29a对TGF-β1诱导的人角膜基质细胞的肌成纤维细胞转化作用是负性的。

CC类趋化因子受体2、Th1/Th2细胞在IgA肾病大鼠肾间质纤维化中的表达及意义

目的检测IgA肾病大鼠肾间质纤维化中CC类趋化因子受体2(C-C motif chemokine receptor 2,CCR2)的表达和辅助性T细胞1/2(helper T cell 1/2,Th1/Th2)的含量,并观察其在肾脏纤维化中的作用。方法40只SD雄性大鼠,随机分为模型组和对照组,每组20只。采用脂多糖+改良牛血清白蛋白+四氯化碳法构建免疫球蛋白A(IgA)肾病模型。观察大鼠肾组织病理改变和IgA沉淀,计算胶原纤维占肾组织百分比,采用Katafuchi评分标准评估肾小管间质损伤程度。蛋白质印迹测定肾组织CCR2水平。双抗体夹心酶联免疫吸附法测定血清白细胞介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)水平。流式细胞术检测Th1/Th2细胞比例。结果模型组大鼠肾组织胶原纤维面积百分比和Katafuchi评分显著高于对照组(P<0.05);模型组大鼠肾组织CCR2、血清IL-4水平、Th2细胞含量及IL-4/IFN-γ比值显著高于对照组,血清IFN-γ水平、Th1细胞含量显著低于对照组(P<0.05);CCR2和IL-4水平及IL-4/IFN-γ比值与胶原纤维面积百分比、Katafuchi评分呈正相关(P<0.05);IFN-γ水平与胶原纤维面积百分比、Katafuchi评分呈负相关(P<0.05)。结论CCR2和Th1/Th2失衡参与IgA肾病大鼠肾间质纤维化发生和发展,拮抗CCR2和调节Th1/Th2平衡有可能减轻IgA肾病大鼠肾脏纤维化改变。