应用噬菌体随机七肽库筛选人角质细胞生长因子模拟肽

目的应用噬菌体随机七肽库生物淘选人角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)噬菌体模拟肽。方法以人KGF单克隆抗体为靶,对噬菌体随机七肽库进行4轮生物淘选,测定噬菌体滴度。随机挑取单克隆噬菌体行ELISA检测其结合力,对结合活性较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,测序,并应用Basic BLAST系统行序列相似性和同源性分析。结果经过4轮生物淘选获得的噬菌体滴度逐渐升高,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,行ELISA检测的单克隆噬菌体滴度均可达到2.0×1014 pfu/mL。取吸光度值显示与特异性抗体具有较好结合性的单克隆噬菌体进行测序,共获得26个与促进分裂、生长有关的碱基序列,其中有2个序列与人KGF相似;同源序列分析显示26个碱基序列的共同序列与人KGF的部分序列相似。结论从噬菌体随机七肽库中可淘选到与人KGF DNA序列相似或相关的噬菌体模拟肽,有望改善人KGF性能,促进创面愈合和改善组织工程皮肤替代物的性能。

合成角质细胞生长因子活性短肽促进表皮细胞增殖的实验研究

目的应用噬菌体随机7肽库筛选角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor,KGF)的关键序列,进行KGF活性短肽的调整和合成,并研究其对表皮细胞增殖的作用。方法以KGF单克隆抗体为靶,筛选噬菌体随机7肽库,获得KGF的特异性序列,并进行序列调整。用免疫荧光法检测KGF活性短肽的表皮细胞亲和力。用CCK-8法检测KGF活性短肽对表皮细胞增殖的影响。用RT-PCR法和Western-blot法检测表皮细胞上特异性受体KGFR的表达水平。结果筛选噬菌体随机7肽库,获得2个与KGF相似的特异性序列,合成获得2个KGF活性短肽,并纯化至98%纯度,短肽的C端进行氨基化封闭,N端进行罗丹明激光染料标记。免疫荧光检测结果显示,2个KGF活性短肽均能够与表皮细胞相结合。CCK-8检测结果显示,与阴性对照组相比,2个KGF活性短肽能够促进表皮细胞增殖,并呈浓度依赖性。RT-PCR和Western-blot检测结果显示,2个KGF活性短肽组中表皮细胞表达KGFR增强。结论从噬菌体随机7肽库中筛选到2个KGF的关键序列,合成的2个KGF活性短肽能够与KGFR相结合,并增强KGFR的表达,从而促进表皮细胞增殖,有望应用于促进创面愈合。

Ang-1模拟肽协同血管内皮生长因子对心肌梗死大鼠心脏功能的影响

目的观察心脏细胞外基质(c-ECM)结合胶原靶向血管内皮生长因子(CBD-VEGF)和Ang-1模拟肽(AMP)对心肌梗死大鼠心脏功能的影响。方法对AMP行MTT体外人脐静脉内皮细胞(HUVEC)活性试验及对修饰了Biotin的AMP(Bio-AMP)进行与c-ECM的结合试验。将SD大鼠行左前降支结扎构建心肌梗死模型,然后随机分为PBS组(A组)、c-ECM/CBD-VEGF组(B组)和CBD-VEGF/c-ECM/AMP组(C组),每组4只,分别于梗死部位注射PBS、CBD-VEGF/c-ECM和CBD-VEGF/c-ECM/AMP进行治疗。3个月后采用超声心动图评价3组大鼠的心脏功能,采用免疫荧光染色方法检测3组大鼠心肌梗死区域血管数量、vWF阳性面积比和ZO1阳性面积比。结果MTT试验检测结果显示,AMP和Ang-1具有相似的促进HUVEC增殖的能力;结合实验结果显示,Bio-AMP可以连接在c-ECM上。处理3个月后,C组大鼠术后心脏射血分数(EF)显著高于A组和B组(t=7.794、3.613,P<0.05)。大鼠心肌梗死区域免疫荧光染色显示,C组血管数量和vWF阳性面积比高于A组(t=4.950、22.390,P<0.05),并且C组vWF阳性面积比显著高于B组(t=11.400,P<0.05)。C组和B组的ZO1阳性面积比明显高于A组(t=13.290、4.328,P<0.05),C组的ZO1阳性面积比明显高于B组(t=8.243,P<0.05)。结论将本研究合成的CBD-VEGF/c-ECM/AMP水凝胶注射于大鼠心肌梗死区域后具有促进大鼠心脏功能恢复和促进心肌梗死后血管再生及细胞连接的作用。

角质细胞生长因子活性短肽促进糖尿病大鼠创面愈合的实验研究

目的探讨角质细胞生长因子(KGF)活性多肽对糖尿病大鼠创面愈合的促进作用。方法选择24只健康雌性SD大鼠,腹腔注射链脲佐菌素酸(STZ),制备糖尿病大鼠模型。将24只大鼠随机分成4组,即阴性对照组、KGF阳性对照组、KGF活性短肽1组、KGF活性短肽2组,每组6只。分别于大鼠背部制备直径2 cm的圆形创面,并定期对创面局部注射各组药物。伤后14 d进行拍照,记录创面未愈合面积,计算创面愈合率。采用HE染色观察创面愈合情况。结果成功制备糖尿病大鼠慢性创面模型。伤后14 d,KGF阳性对照组、KGF活性短肽1组和KGF活性短肽2组的创面愈合率与阴性对照组比较,显著升高,差异有高度统计学意义(P <0.01);KGF活性短肽1组和KGF活性短肽2组的创面愈合率与KGF阳性对照组比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。阴性对照组创面皮肤全层缺失,毛囊、汗腺和皮脂腺等皮肤附件缺失,组织结构均匀致密、无层次,炎症细胞浸润明显。除阴性对照组外,其余各组均创面上皮化良好,深层组织层次清楚、结构疏松,炎症细胞浸润较少,并可见再生的毛囊、汗腺和皮脂腺等皮肤附件。结论 KGF活性短肽可促进糖尿病大鼠的创面愈合及皮肤附件的再生。

重组人角质细胞生长因子(KGF-2)在毕赤酵母中的克隆与表达

利用RT -PCR技术 ,从体外培养的人胚胎成纤维细胞中扩增出人角质细胞生长因子 (KGF - 2 )的cDNA及基因序列 ,并将其基因序列克隆入质粒pGEM -TEasy中 ,经测序与文献报道序列一致 .将KGF - 2基因切出后定向插入酵母分泌性表达质粒pPICZαA中 ,转化毕赤酵母菌株GS115 ,获得的重组体经甲醇诱导可表达出人角质细胞生长因子KGF - 2 .表达的KGF - 2经Ni2 + 柱亲和层析纯化后 ,有很好的生物学活性 .

重组人角质细胞生长因子-Ⅰ的聚乙二醇修饰及体外活性

研究大肠杆菌表达的重组人角质细胞生长因子-Ⅰ型N端缺失突变体(△N23KGF-Ⅰ)的mPEG-马来酰亚胺(mPEG-maleimide、mPEG-Mal)修饰工艺及修饰位点和初步体外生物活性。首先修饰得到聚乙二醇化的△N23KGF-Ⅰ,然后对△N23KGF-Ⅰ作还原和非还原质量肽图,确定其各肽段,对△N23KGF-Ⅰ-m PEG-Mal-20K做还原质量肽图,确定修饰位点。最后,通过BAF-3细胞对△N23KGF-Ⅰ国际标准品、△N23KGF-Ⅰ、△N23KGF-Ⅰ-m PEG-Mal-20K测活。结果表明,在尿素环境下,mPEG-MAl被均一修饰在△N23KGF-I的Cys40位。与国际活性标准品相比,△N23KGF-Ⅰ的活性保留了116%,△N23KGF-Ⅰ-m PEG-Mal-20K的活性保留了36%。

人工合成VEGF表位模拟7肽的生物学功能研究

目的: 检测人工合成血管内皮细胞生长因子(VEGF)表位模拟 7肽特异抑制VEGF促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长的活性。方法: 通过噬菌体展示技术, 筛选获得了表达模拟肽的阳性噬菌体克隆, 经测序得到VEGF表位模拟肽序列: GWYYDAX。人工合成该短肽, 用体外细胞培养的方法检测其对HUVEC的生长抑制作用。结果: 表位模拟肽GWYYDAX可剂量依赖性抑制VEGF促进HUVEC生长的活性。结论: VEGF表位模拟肽可能模拟了VEGF的部分结构, 竞争结合HUVEC细胞VEGF受体 (KDR), 阻断了VEGF VEGFR的信号传递而抑制细胞生长, 具有潜在的应用前景。

角质细胞生长因子噬菌体活性肽的构建及其对表皮细胞增殖的作用

目的构建展示角质细胞生长因子（KGF）噬菌体活性肽，检测其促表皮细胞增殖的作用。方法选择4个KGF序列，设计引物；用反转录．PCR法获得3个KGF序列（Pl、P2和P4），直接合成1个KGF序列（P3）；将KGF序列亚克隆至噬菌粒pComb3中；用噬菌体展示技术，将KGF基因片段展示于噬菌体表面；用四甲基偶氮唑盐（MTF）法检测KGF噬菌体活性肽促表皮细胞增殖的作用，测定其在570nm的吸光度（A）值，用免疫荧光法检测其细胞亲和力。结果获得4种KGF基因，构建在噬菌粒pComb3中；通过噬菌体展示技术将其表达于噬菌体的表面。MTr检测的吸光度（A）值结果显示阴性对照组（0．293±0．017）与KGF对照组（0．520±0．043）及4种KGF噬菌体活性肽组（P1～4）（0．469±0．057、0．441±0．048、0．438±0．035、0．446±0．037）间差异均有统计学意义（均P〈0．01），免疫荧光检测结果显示KGF和4种KGF噬菌体活性肽与表皮细胞具有较好的亲和力。结论构建展示的KGF噬菌体活性肽能够显著促进表皮细胞增殖。

应用噬菌体随机十二肽库筛选hFGF-7相关模拟肽

目的应用噬菌体随机十二肽库生物淘选具有刺激表皮细胞增殖作用的人成纤维细胞生长因子-7(hFGF-7)噬菌体模拟肽。方法以hFGF-7单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选噬菌体随机十二肽库;随机挑取单克隆噬菌体,应用ELISA方法检测单克隆噬菌体的结合力,对结合力较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,进行测序,并行序列分析。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,ELISA检测结果显示获得的一些噬菌体模拟肽具有较好的结合力,测序获得11个与促进细胞分裂、增殖或抑制细胞增殖有关的碱基序列。结论从噬菌体随机十二肽库中可淘选到与hFGF-7相关的噬菌体模拟肽,其中部分噬菌体模拟肽可能会促进表皮细胞增殖,期望将来可应用于促进创面愈合。

联合检测血清和胸水中多项肿瘤标志物对良恶性胸水的鉴别诊断价值

目的:探讨联合检测血清、胸水(胸腔积液)中人组织多肽特异性抗原(TPS)、可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR)、恶性肿瘤生长因子(TSGF)、癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、细胞角质蛋白19片断(CYFRA21-1)对良恶性胸腔积液的鉴别诊断价值。方法:79例临床已确诊的胸腔积液患者(恶性47例,结核性32例)的血清和胸腔积液采用酶免疫法进行TPS、sTNFR、TSGF、CEA、NSE、CYFRA21-1含量测定。结果:恶性胸腔积液患者的6种肿瘤标志物水平均明显高于良性疾病组,差异有统计学意义(P<0.05)。联合检测血清及胸腔积液6项指标,平行试验对恶性胸腔积液诊断的敏感度为95.7%,特异度为59.4%,准确度为81.0%,Youden指数为0.6,较检测单一指标提高了诊断的敏感度、准确度及Youden指数;序列试验则对恶性胸腔积液诊断的敏感度为48.9%,特异度为93.8%,准确度为67.1%,Youden指数为0.4,较检测单一指标提高诊断的特异度、准确度及Youden指数。结论:联合检测血清、胸腔积液中TPS、sTNFR、TSGF、CEA、NSE、CYFRA21-1对良恶性胸腔积液的鉴别诊断有重要价值,能提高诊断准确率。

模拟失重对HaCaT细胞增殖及细胞骨架的影响

目的研究模拟微重力环境对人永生化角质形成细胞（HaCaT）生长增殖及细胞骨架的影响。方法应用RCCS建立模拟微重力细胞培养系统，将HaCaT细胞随机（随机数字法）分为模拟微重力组（SMG）和正常重力对照组（NG），经32h、36h和42h培养后收集两组细胞，应用流式细胞仪技术检测细胞生长周期；ELISA检测细胞上清液hb．EGF浓度；激光共聚焦显微镜和荧光素FITC标记技术观察经42h培养的两组HaCaT细胞骨架形态变化。采用SPSS23．0统计学软件进行统计学分析，以P〈0．05为差异有统计学意义。结果流式细胞仪检测结果显示，与NG组比较，SMG组HaCaT细胞经32h、36h和42h培养，三个时相点的G1和G2／M期细胞数显著增加，s期细胞数显著减少（P〈0．05）。SMG组HaCaT细胞随培养时间延长，G1期细胞数呈减少趋势。ELISA结果显示，SMG组HaCaT细胞经32h和36h后hb-EGF浓度较NG组明显下降（P〈0．01）。激光共聚焦显微镜观察荧光素FITC标记的HaCaT细胞，发现模拟微重力培养42h后，HaCaT细胞的荧光强度减弱，微丝排列紊乱，结构破坏明显，部分模糊不可见，细胞间伪足较少且不规则。结论RCCS模拟微重力环境抑制HaCaT细胞周期转化和增殖，影响hb-EGF自分泌机能，并导致细胞骨架结构发生变化。

我国研制出一种治疗烧烫伤创口的新型生物药

浙江省医学科学院的研究小组在生物流体膜技术的基础上，采用自行构建的基因工程菌重组人角质细胞生长因子-2（rhKGF-2）．并采用可生物降解的壳聚糖为流体膜的基本辅料。首次在国内研制出含有rhKGF～2流体膜的新剂型，成膜后能促进创面愈合。实验研究证明，壳聚糖是一种可作为蛋白和多肽类药物的释放载体。