人角质细胞生长因子2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:构建人角质细胞生长因子2(hKGF2)基因的高效原核表达载体pET-30a(+)-hKGF2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达。方法:从培养的人胚胎肺成纤维细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出去除了信号肽部分的hKGF2基因,克隆到pMD18-T载体,经DNA序列分析后与pET-30a(+)表达载体连接,在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达6×His-hKGF2,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白。结果:构建了表达载体pET-30a(+)-hKGF2,经IPTG诱导后,表达的重组蛋白理论相对分子质量约为23000,约占菌体总蛋白的20%。结论:6×His-hKGF2蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中为可溶性高效表达,为获得高纯度、高活性的产物,以及进一步的大规模生产和应用研究奠定了基础。

角质细胞生长因子-2与新生儿相关肺部疾病的研究进展

角质细胞生长因子-2(KGF-2)是一类来源于间充质细胞的生长因子,具有多功能生物学作用,特别其作为一种肺组织保护因子,可调控肺泡上皮细胞增殖、分化及迁移,促进受损肺组织修复和抑制肺泡纤维化。KGF-2缺失或基因突变与新生儿相关肺部疾病的发生、发展密切相关,且有增加儿童期甚至成年后发生慢性肺部疾病的风险。本文就KGF-2结构、生物学功能,以及其与新生儿相关肺部疾病的关系做一综述,旨在为开拓新生儿呼吸系统疾病新的诊治策略提供理论参考依据。

重组人角质细胞生长因子-2基因克隆、表达、纯化与活性分析

从人胚肺二倍体细胞KMB17中抽提总RNA ,经RT PCR扩增获得编码人角质细胞生长因子 2 (keratinocytegrowthfactor 2 ,KGF 2 )的cDNA .克隆于硫氧环蛋白表达载体pThioHisA ,序列分析表明与文献报道一致 .经IPTG诱导 ,在大肠杆菌BL2 1中实现高效表达 ,表达量可达菌体总蛋白 10 %～15 % .菌体超声破碎 ,上清经CM SepharoseFF阳离子交换 ,Heparin Sepharose亲和层析 ,Superdex 75凝胶过滤层析纯化得到重组人KGF 2 ,纯度高于 95 % .生物活性分析表明 ,它能够促进成纤维细胞NIH 3T3的增殖 ,诱导鸡胚背根神经结神经轴突的生长 ,促进鸡胚尿囊膜血管生成 .研究结果表明 ,获得了 95 %纯度的具有生物学活性的重组人KGF 2 。

人角质化细胞生长因子-2基因的克隆、表达及产物的纯化、鉴定

用高表达菌株BL 2 1codonpluscompententcells表达重组人角质化细胞生长因子 (hKGF 2 )蛋白并初步纯化和检测其活性。通过RT PCR从流产胎儿肺组织中钓取hKGF 2cDNA ,将其克隆入pBV2 2 0载体质粒。在大肠杆菌BL 2 1codonpluscompentcells中表达hKGF 2蛋白。采用亲和层析和离子交换层析分离纯化 ,以细胞增殖实验测定表达蛋白的生物活性。结果显示 ,hKGF 2蛋白在BL2 1中得到高效表达 ;hKGF 2蛋白能刺激NIH3T3细胞的增殖 ,具有显著的促有丝分裂活性。

重组人角质细胞生长因子-2基因的克隆、表达及活性

从人胚肺成纤维细胞中提取总RNA,利用RT-PCR法获得人角质细胞生长因子-2(hKGF-2)cDNA,并通过PCR方法扩增,再与原核表达载体pET3c连接后转化至BL21(DE3)宿主细胞中获得表达菌株.通过流加补料方式和发酵条件的控制,进行高密度培养,并通过IPTG诱导获得可溶性表达的目的产物.结果表明:目的蛋白占菌体总蛋白的30.0%以上;经阳离子交换层析、肝素亲和层析两步柱层析方法获得的rhKGF-2纯度高于99.0%.建立了利用转受体FGFR2-Ⅲb的BaF3细胞株进行rhKGF-2促增殖作用的活性测定方法,活性测定结果呈典型的S型曲线,并在一定范围内具有剂量依赖性.

转角质细胞生长因子-2基因红花研究

【目的】构建转角质细胞生长因子-2基因(KGF2)红花,为KGF2药用蛋白的生产奠定了基础。【方法】利用融合PCR方法扩增人源KGF2基因与拟南芥油体蛋白Oleosin基因的融合基因,将融合基因克隆至表达载体pOP上,构建了重组质粒pOP-OL-KGF2,采用冻融法将质粒pOP-OL-KGF2转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化红花,采用PCR检测筛选转基因红花阳性植株,SDS-PAGE检测Oleosin-KGF2融合蛋白的表达情况。【结果】成功构建了植物特异表达载体pOP-OL-KGF2,转染后共获得了12株转基因红花植株,其中2株鉴定为阳性,阳性率为17%,对转化植株进行DNA水平检测和蛋白水平检测,可知KGF2基因已经整合进红花基因组中,且有所表达。【结论】成功获得转KGF2基因的红花株系。

角质细胞生长因子2对细胞生长、移行及创伤愈合的作用

角质细胞生长因子2(KGF-2)是成纤维细胞生长因子超家族的一员,由间质细胞合成并分泌,能特异促进上皮细胞增殖、分化与迁移,对脊椎动物多种组织和器官的发育起重要调控作用.通过PCR从人的肾组织cDNA文库中克隆分离获得了KGF-2的cDNA,表明该因子在成人肾中有表达.采用大肠杆菌表达并纯化重组蛋白用于生物学功能研究的结果显示:KGF-2在体外不仅能够促进角质细胞的生长和增殖,而且对其凋亡具有抑制作用,还对细胞的移行具有影响.在动物实验中,KGF-2能促进皮肤切除产生的伤口愈合,提示该蛋白质可以作为创伤治疗或辅助用药的候选分子.

重组人角质细胞生长因子-2对兔碱烧伤模型角膜上皮损伤的治疗作用

目的:研究外用旋滴重组人角质细胞生长因子-2(KGF-2)对兔碱烧伤模型角膜上皮损伤的治疗作用,为角膜上皮损伤的早期治疗探索新方法。方法:制备兔角膜碱烧伤模型,60只日本大耳白兔随机分为碱烧伤对照组和KGF-2组(25mg·mL-1)(n=30);各组日本大耳白兔于造模后以50μL药物滴眼,每日3次。7和14d裂隙灯观察角膜烧伤面积以及角膜新生血管的形成,MTT法检测角膜上皮细胞活性,免疫组化方法进行病理组织学检查。结果:碱烧伤后7和14d,KGF-2组角膜烧伤面积小于碱烧伤对照组,差异有显著性(P<0.01)。碱烧伤对照组7d角膜新生血管发生率为17.50%,KGF-2组为7.32%;碱烧伤对照组14d角膜新生血管发生率为41.67%,KGF-2组为32.50%。MTT检测结果显示:碱烧伤后7和14d,KGF-2组492nm吸光度与碱烧伤对照组比较差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。碱烧伤后7和14d,病理切片HE染色显示:对照组角膜基质水肿,板层纤维排列松散、紊乱,炎症反应反复出现,角膜上皮层变薄,部分脱落,角膜内皮层内侧有大量成纤维细胞增生;KGF-2组碱烧伤后7d,角膜上皮细胞生长良好,基质轻度增厚,无明显的炎症反应;碱烧伤后14d,未出现炎症复发,角膜上皮细胞生长良好,排列整齐,角膜基质仅有轻度增厚。结论:外用旋滴25mg·mL-1KGF-2可加速角膜上皮损伤的恢复,减轻角膜烧伤的各种炎症反应症状;减轻角膜基质水肿和纤维化,同时KGF-2亦表现出显著的抑制角膜新生血管形成的作用;KGF-2有可能成为另一个对角膜上皮损伤具有重要调控作用的生长因子。

重组人角质细胞生长因子-2对实验秃毛大鼠的毛发再生作用

目的建立实验秃毛大鼠模型,研究重组人角质细胞生长因子-2(recombinant human keratinocyte growth factor-2,rhKGF-2)对实验秃毛大鼠的毛发再生作用。方法对大鼠背部以脱毛膏拔毛,随机分为7个组,即正常对照组、5%米诺地尔组、aFGF组、rhKGF2高、中、低剂量组、0.9%生理盐水组。造模次日皮肤涂抹给药,以给药第1、5、9、14天为观察时间点,记录实验大鼠的体重、实验区毛长、实验区毛发生长状况。于第14天处死实验大鼠,取实验区皮肤进行组织病理学检查。结果体重方面:在第1、5、9、14天,与正常对照组相比,各组差异无显著性(P>0.05);毛长方面:与0.9%生理盐水组相比,在第5、9天,rhKGF2高、中剂量组存在显著性差异(P<0.05,P<0.01)。在第14天,高、中、低剂量组差异有显著性(P<0.05,P<0.01,P<0.05);毛重方面:在第14天,与0.9%生理盐水组相比,各组(正常对照组除外)差异有显著性(P<0.01);病理检查结果显示:rhKGF2具有促进实验秃毛大鼠毛囊新生与成熟的作用。结论 rh-KGF2具有促进实验秃毛大鼠毛发再生的作用。rhKGF2具有很好的临床应用前景。

ERK1/2信号通路在角质细胞生长因子-2诱导角膜基质细胞增殖中的作用

目的观察角质细胞生长因子(keratinocyte growthfactor-2,KGF-2)对角膜基质细胞的增殖作用及ERK1/2信号在角膜基质细胞增殖中的调控作用,探讨KGF-2对角膜基质细胞增殖的可能机制。方法体外培养角膜基质细胞,MTT法检测细胞增殖,Western blot检测磷酸化ERK1/2表达水平。结果 KGF-2在1～100 mg·L-1对角膜基质细胞有明显的促进增殖作用且呈现剂量-效应关系;100 mg·L-1 KGF-2处理角膜基质细胞,5、15、30 min后ERK1/2磷酸化表达水平明显升高,60、90、120、180 min后ERK1/2磷酸化表达水平逐渐减弱;20μmol.L-1 ERK1/2抑制剂PD98059可抑制KGF-2对角膜基质细胞的促增殖作用。结论 KGF-2激活ERK1/2信号通路,提高细胞增殖率,可被抑制剂PD98059阻断;ERK1/2信号通路调控角膜基质细胞的增殖,在角膜基质细胞损伤中发挥作用。

重组人角质细胞生长因子(KGF-2)在毕赤酵母中的克隆与表达

利用RT -PCR技术 ,从体外培养的人胚胎成纤维细胞中扩增出人角质细胞生长因子 (KGF - 2 )的cDNA及基因序列 ,并将其基因序列克隆入质粒pGEM -TEasy中 ,经测序与文献报道序列一致 .将KGF - 2基因切出后定向插入酵母分泌性表达质粒pPICZαA中 ,转化毕赤酵母菌株GS115 ,获得的重组体经甲醇诱导可表达出人角质细胞生长因子KGF - 2 .表达的KGF - 2经Ni2 + 柱亲和层析纯化后 ,有很好的生物学活性 .

人角质细胞生长因子2真核表达载体的构建及功能验证

目的:构建人角质细胞生长因子2(KGF-2)基因真核表达载体,探索KGF-2的上皮细胞迁移功能。方法:以人乳腺cDNA文库为模板,PCR扩增KGF-2基因片段,将其插入pXJ-40-myc,经双酶切和测序验证后,将重组质粒转染HEK-293T细胞,采用Western印迹检测重组蛋白;转染人肠上皮细胞FHC,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果:PCR扩增获得627 bp的DNA产物,插入pXJ-40-myc载体,双酶切及测序结果证明重组质粒含有目的序列;转染HEK-293T细胞,Western印迹检测到相对分子质量约23×103的目的蛋白;细胞划痕实验显示,转染Myc-KGF-2的FHC细胞较未转染或转染空载体的细胞迁移能力强。结论:构建了人KGF-2基因真核表达载体,并验证了其促进细胞迁移的功能。

胰岛素样生长因子1对成骨细胞中BMP-2、BMP-7基因表达的影响

目的 研究胰岛素样生长因子1(IGF-1)对成骨细胞中BMP-2、BMP-7基因表达的影响,探讨IGF-1促进成骨细胞增殖、分化的分子机理。方法 以不同浓度的IGF-1刺激分离培养的大鼠成骨细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR扩增BMP-2及BMP-7基因cDNA,同时扩增管家基因β-actin作为内对照。扫描PCR产物电泳照片,计算BMP-2/β-actin及BMP-7/β-actin的积分光密度比值,推算BMP-2及BMP-7基因的相对表达水平。结果 IGF-1可以在转录水平增加大鼠成骨细胞中BMP-2及BMP-7基因的表达,并呈明显的剂量依赖关系。结论IGF-1促进成骨细胞增殖、分化的作用可能是通过增加BMP-2及BMP-7基因的表达来实现的。

角质细胞生长因子-2对角膜激光烧伤的治疗作用及机制研究

目的探讨角质细胞生长因子-2(KGF-2)对角膜激光烧伤的治疗作用及其作用机制。方法采用日本大耳白兔构建激光角膜烧伤模型,实验分烧伤对照组、bFGF治疗对照组、KGF-2 12.5μg/ml组、KGF-225μg/ml组、KGF-2 50μg/ml组。通过裂隙灯显微镜与组织病理学观察、烧伤斑图像分析、角膜OD值测定和MTT法检测损伤后角膜的恢复情况,比较治疗后7、14 d各组的差异。结果 KGF-2治疗后兔角膜上皮细胞修复良好,基质中纤维板层排列整齐,无明显的炎症反应,新生血管形成较少,角膜透光率增加,损伤斑面积明显缩小,且KGF-2浓度为25μg/ml时达到最大修复。KGF-2对角膜上皮细胞无明显的促增殖活性。结论 KGF-2可通过减轻角膜激光烧伤后的各种炎症反应、加速角膜上皮细胞的再生和迁移以及促进角膜基质纤维修复等机制,促进激光烧伤后受损角膜的修复。

乳糖诱导角质细胞生长因子-2在大肠杆菌中的表达

目的:研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行角质细胞生长因子-2(KGF-2)基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。方法:分别比较乳糖诱导浓度、诱导时机、诱导时间及诱导温度对重组表达产物的影响,并以IPTG诱导作为对照,确定较为优化的乳糖诱导条件。结果:对于重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到良好效果,以乳糖为诱导剂的A600值较IPTG高,诱导产物的表达量与IPTG诱导产物相当。以终浓度为10g.L-1乳糖在33℃下诱导6h,可以达到良好的诱导效果,并且具有较好的可溶性和促细胞生长活性。结论:乳糖可替代IPTG诱导角质细胞生长因子基因表达,并取得良好效果,为工程化生产提供了良好的实验依据。

角质细胞生长因子-2的发酵及纯化工艺研究

目的研究重组人角质细胞生长因子 2 (rhKGF 2 )工程菌的高密度发酵和提纯工艺。方法通过增加培养基营养成分 ,发酵过程补加葡萄糖 ,获得高产率菌体。细菌裂解液经硫酸铵沉淀、分子筛、肝素亲和色谱和离子交换色谱等方法进行纯化 ,电泳分析结果。结果每 1L发酵液可获得菌体 12 .2g ,表达率达 2 8.7%。纯化后rhKGF 2纯度达 97%。结论rhKGF 2工程菌可获得高密度发酵。纯化工艺适用于rhKGF

碱性成纤维细胞生长因子对脊髓损伤后bcl-2及bax基因表达的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对脊髓损伤后bcl-2和bax基因表达的影响。方法:利用AllenWD法以25gcf致伤SD大鼠脊髓制作损伤模型,经蛛网膜下腔导管于术后即刻,0.5,1,2,3,4,6,12,24,48h导管注入bFGF20μL(含bFGF200U);对照组相同时间点注入等量生理盐水作对照。术后2,6,12,24,48h取损伤脊髓组织,采用免疫组化和原位杂交方法分别检测Bcl-2、Bax蛋白和bcl-2mRNA基因的表达。结果:脊髓损伤后应用bFGF显著促进bcl-2基因的表达,2,6,12,24,48hBcl-2平均光密度值分别为0.165±0.020,0.254±0.081,0.312±0.017,0.415±0.021,0.304±0.031,(P<0.01,t=2.729～9.279),Bax平均光密度值分别为0.034±0.021,0.184±0.014,0.204±0.014,0.216±0.027,0.180±0.013(P<0.01,t=4.601～6.376),提高Bcl-2蛋白的含量,降低了Bax蛋白的水平,每组数据差异具有统计学意义。结论:bFGF通过促进bcl-2基因的表达、抑制Bax蛋白的表达抑制脊髓损伤后神经细胞的凋亡,从而保护脊髓组织,这可能是bFGF对脊髓损伤具有保护作用的机制之一。

血管内皮生长因子与Bcl-2基因在急性淋巴细胞白血病的表达及意义

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)和抗凋亡基因Bcl-2在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的表达与临床危险分级和早期治疗反应及其预后的关系。方法采用S-P免疫组织化学方法,检测32例ALL骨髓细胞VEGF和Bcl-2基因的表达状况,比较不同危险分级及不同的早期治疗反应的ALL患者之间的表达差别。选择同期住院的非白血病患者15例正常骨髓细胞作为对照组。结果VEGF、Bcl-2在ALL患者中表达均明显高于对照组(t=7.4917,3.2558Pa<0.01;二者呈正相关(r=0.457P<0.01)。VEGF、Bcl-2在高危组(HR)、中危组(MR)、标危组(SR)中的表达化疗前后均有显著性差异(F=11.570,4.558,4.574,3.013Pa<0.05);治疗反应好与反应差化疗前、后组间比较均有显著性差异(t=1.957,2.798,3.565,2.375Pa<0.05);化疗前后组内比较,反应好组有显著性差异(t=1.8038,1.7309Pa<0.05),反应差组均无显著性差异(t=1.3798、1.1875Pa>0.05);二者均低表达者与均高表达者复发率有显著性差异(P<0.05)。结论VEGF和Bcl-2在儿童急性白血病中存在高表达,与临床高危因素分级一致,二者以不同机制参与急性白血病的发生、发展,可作为判断疾病预后的参考指标,联合检测对预后判断优于单一指标检测。

重组人角质细胞生长因子-2对大鼠皮肤烫伤的治疗作用及其可能机制探讨

目的:研究重组人角质细胞生长因子-2(rh-KGF-2)对大鼠皮肤烫伤愈合的影响及其可能的作用机制。方法:建立大鼠深Ⅱ度烫伤模型,每天局部给药1次,连续15d,每4d测量伤口面积并计算愈合率,d16观察新生上皮面积、厚度和上皮细胞迁移距离。体外培养HaCaT细胞,MTT法检测不同浓度的rhKGF-2对HaCaT细胞增殖率的影响;划痕实验检测rhKGF-2对HaCaT细胞移行的影响。结果:rh-KGF-2对大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤的愈合有明显的促进作用,使新生上皮面积、平均厚度和上皮细胞移行距离等明显增加。rhKGF-2可刺激HaCaT细胞增殖,集落形成率增加(P<0.05),且细胞呈明显的增殖形态,形成的集落较大,集落内细胞多呈星状,胞内染色质丰富;rhKGF-2能显著促进创伤周围细胞向创面中央移行(P<0.01)。结论:rhKGF-2能明显加快大鼠烫伤创面愈合,可能作用机理为通过促进表皮细胞增殖和移行,加速创面皮肤再上皮化。

腺病毒介导人转化生长因子β2基因转染诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化

背景:前人的工作已证实转化生长因子β1能促进骨髓间充质细胞的增殖,诱导其向软骨细胞分化。目的:进一步验证人转化生长因子β2(human transforming growth factor-β2,hTGFβ2)基因转染诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化作用。方法:取清洁级3周龄雄性Lewis大鼠16只,用于分离培养骨髓间充质干细胞。通过腺病毒重组载体Ad-hTGFβ2将外源性hTGFβ2基因转染到体外培养的第2代大鼠骨髓间充质干细胞中,48h后采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测转染细胞中目的基因与软骨特异性蛋白——Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况。结果与结论:从成体大鼠骨髓组织中培养出骨髓间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代。Ad-hTGFβ2转染骨髓间充质干细胞获得稳定表达,免疫组织化学染色和Western blotting检测到基因转染细胞中Ⅱ型胶原蛋白的合成表达,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和蛋白多糖aggrecan mRNA的表达。结果提示,从骨髓组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代;Ad-hTGFβ2成功转染骨髓间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化。