Rho激酶抑制剂Y27632促进人诱导多能干细胞来源原始神经上皮细胞向多巴胺能神经前体细胞的转化

目的提高人诱导多能干细胞来源原始神经上皮细胞(hiPSCs-NECs)定向诱导中脑多巴胺能神经前体细胞(DAPs)的效率。方法将人iPSCs在含有小分子组合[DMH1(10μmol/L)、SB431542(10μmol/L)、音猬因子(SHH 200 ng/mL)、成纤维细胞生长因8(FGF8100 ng/mL)、嘌吗啡胺(2μmol/L)、CHIR99021(3μmol/L)、N2(1%)]的mTeSRTM培养基中诱导至12 d,细胞分化为原始神经上皮细胞(NECs)。特异性诱导DAPs,将诱导的hiPSCs-NECs用胶原酶IV消化后,在神经分化培养基[添加1%N2、2%B27-A、BDNF(10 ng/mL)、GDNF(10 ng/mL)、AA、TGF-β、cAMP、1%GlutaMax]中加入不同浓度的Rho激酶抑制剂Y27632重新接种,并于次日更换培养基去除Y27632,持续诱导至第28天获得DAPs。结果人iPSCs可在基质胶上稳定传代,表达多潜能性标记物OCT4、SOX2、Nanog和SSEA1,且碱性磷酸酶染色呈阳性。诱导分化至第13天获得hiPSCs-NECs,形成玫瑰花结样结构,能够表达特征性标记物(SOX2、Nestin和PAX6)。将hiPSCs-NECs消化后,添加5μmol/LY27632的hiPSCs-NECs相比较未加Y27632的对照组,细胞解离后贴壁存活率明显增加,处于S期的细胞(P<0.01)与细胞活力显著提高(P<0.01),且凋亡率显著降低(P<0.05),持续诱导至第28天,细胞高表达DAPs特异性的标记物(TH、FOXA2、NURR1和Tuj1)。结论添加Y27632(5μmol/L)24 h可显著提高人iPSCs-NECs细胞向iPSCs-DA神经前体转化时的细胞存活率,并且Y27632去除后,不会影响后续向DA神经前体细胞分化,间接的提高了细胞的分化效率.

人诱导多能干细胞来源的心脏前体细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死

目的探索人诱导多能干细胞来源的心脏前体细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的效果。方法利用免疫荧光染色鉴定人诱导多能干细胞的多能性,利用GiWi法在体外将其分化为心脏前体细胞,再继续分化为心肌细胞,利用流式细胞术及免疫荧光染色对所获得的心脏前体细胞和心肌细胞进行分化效率及形态学鉴定。通过结扎大鼠冠状动脉左前降支制备急性心肌梗死模型,利用TTC染色、超声心动图评估造模情况。将心脏前体细胞移植到心肌梗死边缘区,术后1周、4周利用超声心动图检测心功能;利用HE、Masson染色评估梗死区域大小以及纤维化程度;利用免疫荧光染色评估心脏前体细胞的体内存活及分化情况。结果人诱导多能干细胞高表达干性标志物OCT4、SOX2、Nanog以及Tra-1-60。心脏前体细胞的体外分化效率高达77.8%,表达心脏前体细胞特异性标志物Isl1;并可进一步分化为心肌细胞,其效率高达83.3%,同时高表达cTnT、α-actinin等心肌特异性标志物。大鼠急性心肌梗死模型制备成功,TTC染色见梗死区发白,左室射血分数降低。体内移植后4周,与模型组相比,细胞组心功能改善明显,心室扩张减弱,纤维化减轻;移植细胞体内存活并分化为心肌细胞。结论人诱导多能干细胞来源的心脏前体细胞体外分化效率高,体内移植后可存活并分化为心肌细胞,可抑制心室重构,改善心功能。

机械牵张对人诱导多能干细胞分化来源的心肌细胞成熟的影响

目的通过使用标准的化学定义和基于小分子诱导方案(chemically defined medium,3 components,CDM3)获得人诱导多能干细胞分化来源的心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs),进一步对其施加机械牵张,探讨机械牵张对hiPSC-CMs成熟的影响及潜在机制。方法复苏、培养和鉴定hiPSCs后,将hiPSCs接种到覆有基质胶的传统培养皿上。24 h后在荧光显微镜下通过DAPI荧光观察细胞生长情况,并通过八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)荧光进行hiPSCs干性鉴定,在细胞汇合度达到80%时更换CDM3分化培养基,分化6 d后将获得的hiPSC-CMs分为对照组和机械牵张组,拉伸结束后重新种板培养24 h后在荧光显微镜下通过DAPI荧光观察细胞生长情况,通过心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)和肌球蛋白轻链2V(myosin light chain 2V,MLC2V)荧光进行hiPSC-CMs心肌细胞标志物鉴定,Piezo1荧光进行潜在机制研究。结果hiPSCs培养24 h免疫荧光显示:OCT4发出绿色荧光,hiPSCs保持干性。DAPI发出蓝色荧光:细胞呈克隆生长,细胞形态均一。机械牵张结束后重新种板培养,24 h后免疫荧光显示机械牵张组较对照组心肌标志物cTnT和MLC2V表达增高(P<0.05);机械牵张组较对照组机械敏感型离子通道Piezo1蛋白表达增高(P<0.05)。结论机械牵张可以促进人诱导多能干细胞分化来源心肌细胞的成熟,这可能与Piezo1蛋白表达增高有关。

诱导多能干细胞移植后对急性前壁心肌梗死小鼠ST-T改变的影响分析

目的研究诱导多能干细胞(iPSc)移植后对急性前壁心肌梗死小鼠ST-T改变的影响分析,进而为其临床应用提供最佳的种子细胞。方法建立癌症研究机构(ICR)小鼠心肌梗死模型组并随机分为假手术对照组[急性心肌梗死+生理盐水组(AMI+NS)],急性心肌梗死+移植iPS细胞组(AMI+iPSc),急性心肌梗死+移植成纤维细胞组(AMI+Fb),与此同时设立正常对照组(NCG)。在急性心肌梗死造模后即刻及移植iPSc后5 min、1周、2周、3周的各个时间点,依次应用BL-420生物机能系统分析测量各组小鼠体表心电图指标肢体导联I、加压肢体导联(AVL)ST-T演变的情况。应用免疫组化法分阶段检测各组小鼠心肌缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达,然后采用Image Proplus软件对比分析。结果假手术对照组小鼠造模后即刻的ST段压低及T波倒置与NCG组小鼠比较,差异有统计学意义(P<0.05)。AMI+iPSc组及AMI+Fb组ST-T指标分别与假手术组比较,前者iPSc移植2周后小鼠体表心电图的ST段压低、T波倒置改变较假手术组减轻,后者Fb移植2周后则未见此改变。AMI+iPSc组梗死心肌Cx43表达高于假手术对照组(P<0.05)。结论iPSc移植后2周可明显改善前壁梗死后小鼠ST-T改变,进而改善心肌组织的急性缺血损伤,亦可使小鼠急性梗死心肌Cx43的表达增加,而成纤维细胞移植的小鼠中则未见此效果。

大鼠诱导性多能干细胞向神经前体细胞诱导分化研究

目的探讨大鼠来源的诱导性多能干细胞(iPS细胞)向神经前体细胞(NPC)定向诱导分化的方法。方法在大鼠iPS细胞培养到悬浮类胚体阶段加入维甲酸(RA)诱导分化,对分化获得的细胞,分别通过免疫荧光染色和实时定量PCR方法检测NPC标志物、用BrdU免疫荧光染色检测其增殖能力、并通过大鼠视网膜下腔移植对其存活、整合情况及分化能力进行检测。结果经诱导分化获得的细胞能够在贴壁培养条件下形成Rosette结构、表达NPC标志物并且绝大多数呈BrdU阳性,移植到大鼠视网膜下腔后能分化为神经元和胶质细胞。结论大鼠iPS细胞能够通过悬浮EB加RA诱导的方法分化为NPC,有可能作为细胞移植治疗视网膜退行性疾病的供体细胞。

氯化铯增加人诱导多能干细胞来源心肌细胞自发动作电位的节律性

目的探讨氯化铯对人诱导多能干细胞来源心肌细胞自发动作电位以及起搏电流的影响。方法利用CHIR99021和IWP-2小分子在体外将人诱导多能干细胞分化为心肌细胞。通过免疫荧光和动作电位测定对转化心肌细胞进行形态学和电生理鉴定。利用膜片钳系统记录氯化铯对培养60 d人诱导多能干细胞来源心肌细胞自发动作电位及起搏电流的影响。结果免疫荧光显示人诱导多能干细胞来源心肌细胞高表达心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)心肌标志物,电生理鉴定提示其具有自发动作电位,2 mM氯化铯增快自发动作电位的频率(P=0.003,n=5)。2 mM氯化铯提高动作电位的静息电位(P<0.001,n=5),提高动作电位的阈电位(P<0.001,n=5),降低动作电位的振幅(P=0.002,n=5),缩短动作电位复极90%(APD90)的时间(P<0.001,n=5)。2 mM氯化铯抑制人诱导多能干细胞来源心肌细胞起搏电流的平台期电流以及尾电流有统计学意义(P<0.05,n=5)。结论氯化铯增加人诱导多能干细胞来源心肌细胞自发动作电位的自发节律性,并抑制其起搏电流。

一种人诱导多能干细胞向内皮细胞定向分化方案的建立及鉴定

背景:人诱导多能干细胞是一种与胚胎干细胞性状高度类似的多能干细胞,其具备三胚层分化潜能和持续自我更新能力,因此能够为临床细胞替代治疗提供足量目的细胞。目的:构建并鉴定一种高效的基于人诱导多能干细胞的内皮细胞定向分化实验方案。方法:采用免疫荧光技术对人诱导多能干细胞干性和增殖活性进行鉴定。采用转录因子重组蛋白和小分子化合物时序性调控系列信号通路,即在第0,1,2,5天顺序加入激活素A、GSK通路抑制剂CHIR99021/骨形态发生蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子/血管内皮生长因子/骨形态发生蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子/血管内皮生长因子/CHIR99021,人诱导多能干细胞经历心脏中胚层、内皮前体细胞命运转变并最终分化成为有功能的内皮细胞。采用明场显微镜、实时定量PCR、免疫荧光动态观察不同阶段细胞形态特征和分子标记物,采用血管成环实验验证内皮细胞的体外血管形成功能。结果与结论:(1)人诱导多能干细胞内源性高表达诱导多能干细胞干性特异标记物(OCT4、NANOG、SSEA4)和增殖标记物(Ki67);(2)开始分化后的人诱导多能干细胞经历了诱导多能干细胞、心脏中胚层、内皮前体细胞、内皮细胞等阶段显著的形态改变;(3)qPCR结果显示,随着分化进展,内皮前体细胞标记物(KDR、CD34)呈现先升高再下调趋势,而内皮细胞标记物(VE-CADHERIN、ICAM1、PECAM1)则呈现出逐渐递增趋势,免疫荧光在蛋白水平进一步证实了内皮细胞标记物的表达递增趋势;(4)血管成环实验显示,内皮细胞血管形成数量随血管内皮生长因子质量浓度增加而增多;(5)综上提示:成功建立了人诱导多能干细胞定向分化内皮细胞的实验方案,有望为未来血管构建提供细胞基础和实验依据。

MiR-125a-5p靶向APC激活经典WNT信号通路促进hiPSCs分化为多巴胺能神经前体细胞

目的通过调节miR-125a-5p的表达实现人诱导性多能干细胞(hiPSCs)向多巴胺(DA)能神经前体细胞及DA能神经元的高效转化。方法应用MicroRNAs高通量测序与分析,miR-125a-5p的筛选、靶基因(APC)的预测与验证;miR-125a-5p前体miR-125a慢病毒载体的构建与包装,miR-125a-5p过表达hiPSCs细胞株的构建、筛选及其向多DA能神经前体细胞与DA能神经元的诱导分化;免疫细胞化学、实时定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印迹(WB)法检测miR-125a-5p过表达hiPSCs与对照hiPSCs向DA能神经前体细胞及DA能神经元诱导分化过程中神经前体细胞标志物Nestin、底板细胞标志物Foxa2、DA能神经前体细胞标志物En1、DA能神经前体细胞分选标志物Corin、神经元标志物Tuj1及DA能神经元标志物TH的表达。结果 MiR-125a-5p在hiPSCs向DA能神经前体细胞及神经元诱导分化过程中的表达呈递增趋势,miR-125a-5p靶向调节经典WNT信号通路关键因子APC,稳定过表达miR-125a-5p的hiPSCs细胞株能向DA能神经前体细胞及DA能神经元分化,其诱导分化效率与对照hiPSCs相比在神经前体细胞(NPCs)阶段FOXA2、EN1、CORIN的表达明显增高,神经元阶段TH、DAT和Nurr1的表达明显增高,提示过表达miR-125a-5p的hiPSCs具有更好的向DA能神经前体细胞及DA能神经元的诱导分化潜能。结论 MiR-125a-5p能通过靶向下调APC的表达激活经典WNT信号通路活性,促进hiPSCs向DA能神经前体细胞及DA能神经元的诱导分化。

hiPSCs向多巴胺能神经前体细胞的定向分化对细胞增殖和迁移的影响

目的探讨人诱导性多能干细胞(hiPSCs)向多巴胺能神经前体细胞(DAPs)的定向分化对细胞增殖和迁移的影响,为优化诱导分化方案和细胞移植治疗提供新思路。方法hiPSCs的诱导分化分为实验组(Exp)和对照组(Cont)。实验组的诱导分化方案是在基础诱导培养基上添加3个信号通路的激活剂或抑制剂,对照组则仅使用基础诱导培养基。通过实时荧光定量PCR(qPCR)和免疫荧光检测诱导分化第0、7、14天的细胞多能性标志物NANOG、OCT4和SOX2,细胞增殖标志物KI67,神经干细胞(NSCs)标志物NESTIN,底板标志物FOXA2和DAPs标志物EN1、LMX1A、MSX1的表达;CCK8和划痕实验分别检测细胞增殖和迁移能力。结果qPCR结果显示,在诱导分化过程中,对照组和实验组的多能性基因NANOG的表达均下降,且实验组下降趋势更明显(D7:P=0.0019,D14:P=0.0001)。与对照组相比较,实验组第7天和第14天NESTIN、EN1、LMX1A和MSX1的mRNA水平表达均明显增加(NESTIN:P=0.0043;EN1:P=0.0002、LMX1A:P=0.0142、MSX1;P=0.0233)。免疫荧光染色结果表明,两组未诱导的hiPSCs均大量表达NANOG、OCT4、SOX2和KI67;第7天,实验组细胞大量表达FOXA2/NESTIN双阳性,对照组细胞大多仅表达NESTIN阳性;第14天,实验组大量表达EN1、LMX1A、MSX1,而对照组表达较少;CCK8增殖实验结果显示,第7天和14天时,实验组的450nm吸光值均高于对照组(D7:P=0.0430;D14:P=0.0001);划痕实验结果显示,在第7天时,对照组与实验组的划痕愈合趋势的差异无统计学意义(P>0.05),而第14天时,对照组相对于实验组的24 h划痕愈合趋势明显增加(P=0.0023)。结论诱导分化方案添加的通路激活剂或抑制剂,可以促进hiPSCs向DAPs的分化,在总体水平能够促进细胞增殖,而抑制细胞分化后期的迁移能力。

SHH信号通路调控hiPSCs定向分化为腹侧底板类神经前体细胞

目的激活Sonic Hedgehog(SHH)信号通路促进人诱导性多能干细胞(hiPSCs)定向分化为腹侧底板类细胞。方法将hiPSCs设3个实验组:LDN193189+SB431542组(LSB组)、SHH C24-II+Purmorphamine组(SHH组)和Cyclopamine组(CYC组)。采用RT-qPCR检测诱导第7天各组细胞背侧前脑标志物PAX6、腹侧底板标志物FOXA2和SHH信号通路关键因子SHH、Ptc-1、Smo、Gli-1及诱导第11天多巴胺能神经前体细胞LMX1A、EN1的mRNA表达。免疫细胞化学(ICC)检测诱导第7天FOXA2、PAX6及分化第25天多巴胺能神经元标志物TH的蛋白表达。结果 RT-qPCR结果显示分化第7天,SHH组FOXA2的mRNA表达明显上调(P<0.01),PAX6的表达明显下调(P<0.01);SHH信号通路相关因子SHH、Ptc-1及Gli-1的表达明显上调(P<0.01),Smo的表达无明显变化;ICC结果显示LSB组、CYC组以PAX6+细胞为主;SHH组以FOXA2^+细胞细胞为主;分化第11天,SHH组多巴胺能神经前体标志物LMX1A及EN1的mRNA表达量较LSB组高(P<0.05);分化第25天ICC结果显示SHH组TH+细胞数量较LSB、CYC组多。结论分化早期激活SHH信号可诱导hiPSCs定向分化为FOXA2^+的腹侧底板细胞,该类细胞能进一步分化为多巴胺能神经前体细胞及多巴胺能神经元。

丹酚酸B对心肌缺血再灌注损伤的作用

目的:探究丹酚酸B对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的作用及其可能的作用机制。方法:本实验选用人诱导多功能干细胞来源的心肌细胞(hiPSC-CMs),通过缺氧6 h复氧24 h建立心肌损伤模型,选取丹酚酸B(7.5、15、30、60和120μg/mL)5个剂量研究其对hiPSC-CMs及hiPSC-CMs心肌损伤模型阻抗与场电位的影响。后进行动物实验,分为假手术组,心肌缺血再灌注模型组,丹酚酸B低(15 mg/kg)、中(30 mg/kg)、高(60 mg/kg)剂量组,阳性对照普萘洛尔(2.5 mg/kg)组,灌胃给药4 d后,进行冠状动脉左前降支结扎手术(缺血30 min,再灌注24 h)建立大鼠MIRI模型,采用TTC染色法观察大鼠心脏缺血区域面积;HE染色法观察大鼠心肌结构病理形态;全自动生化分析仪测定血清中心肌酶活性探究丹酚酸B用药在MIRI中的作用;使用试剂盒检测丹酚酸B在MIRI过程中可能存在的抗氧化机制。结果:丹酚酸B有增强hiPSC-CMs收缩力,减轻心肌损伤,改善场电位功能的作用。并且可以有效减少MIRI模型大鼠的心肌缺血面积,改善心肌结构损伤,降低心肌酶活性。此外,还能够降低MIRI大鼠血清中丙二醛(MDA)含量,提升超氧化物歧化酶(SOD)活性和还原型谷胱甘肽(GSH)活性,在改善心肌损伤的过程中发挥抗氧化作用。结论:丹酚酸B可以有效降低MIRI,并发挥着改善心肌细胞生理功能,保护心脏的作用。其作用机制可能与降低血清MDA水平、提高SOD和GSH活性有关。

本期专题:干细胞与微环境

1体外局部微环境下小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞的定向诱导分化——见2009年1期75页。 2化学诱导剂5-氮杂胞苷及模拟生物微环境对骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响——见2009年40期7931页。

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞构建短QT综合征疾病模型概况

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞(hiPSC-CMs)已经成为疾病模型构建、药物筛选、组织工程等领域的研究热点。不少学者利用hiPSC-CMs在细胞或组织水平进行了短QT综合征的疾病模型构建,并在该模型上进行了相关的药物检测,这为短QT综合征的病理机制探究及药物治疗提供了新的见解。

Sox10和Olig2加速人源性诱导多能干细胞向少突胶质前体细胞分化

少突胶质细胞(OLs)有望用于治疗多发性硬化和先天性脑瘫等脱髓鞘疾病.近年来,一些研究者利用人的胚胎干细胞和神经干细胞作为起始细胞来获得少突胶质细胞前体细胞(OPCs).然而,神经干细胞的应用受到其来源的限制;现有的将胚胎干细胞分化为OPCs的方法耗时较长.因此,本研究探讨了一种通过在人诱导多能干细胞中过表达两个转录因子(Sox10和Olig2),从而有效获得OPCs的方法.通过这种方法,可以在14天内获得PDGFRα阳性的OPCs,并在56天内获得O4阳性的OPCs.获得的OPCs在和大鼠(Rattusnorvegicus)皮质神经元共培养时能分化为成熟的少突胶质细胞并包裹轴突形成髓鞘.该研究结果在自体细胞移植领域中具有一定的应用潜力.

采用Accutase酶分离适合膜片钳记录的人诱导多能干细胞来源心肌细胞及其电生理学特性分析

目的 采用Accutase酶分离适合膜片钳记录的人诱导多能干细胞来源心肌细胞,并对其电生理学特性进行分析。方法 将人诱导多能干细胞在体外分化为心肌细胞。选择培养28~32天活性良好的心肌细胞,免疫细胞化学检测心肌细胞肌钙蛋白(cTNT)和肌动蛋白(α-actin)表达,膜片钳全细胞技术记录人诱导多能干细胞来源心肌细胞的动作电位。记录动作电位前采用Accutase酶将人诱导多能干细胞来源心肌细胞消化成单个心肌细胞,依据消化时间不同随机分为A、B、C、D、E组,各组消化时间依次为0.5、1、2、5及10 min,每组分别记录5~6个来自不同培养皿的细胞自发动作电位。对自发动作电位的频率、静息电位、阈电位、振幅、最大去极化速率、复极时间、超极化电位和最大自动除极速率进行分析。结果 免疫荧光显示人诱导多能干细胞来源心肌细胞高表达心肌特异性标志物cTnT和α-actin;细胞消化前,肉眼下可见人诱导多能干细胞来源心肌细胞有自发跳动;各组细胞全细胞记录模式建立前的巨阻封接形成时间随着消化时间延长逐渐缩短[(4.80±1.10) min、(2.10±0.55) min、(2.20±0.84) min、(2.30±0.45) min、(0.75±0.27) min,P<0.01]。各组间建立全细胞记录模式的细胞膜电容和串联电阻无差异。消化后膜片钳全细胞模式记录显示人诱导多能干细胞来源心肌细胞有自发动作电位,并有明显平台期,随着消化时间延长,平台期逐渐缩短[各组90%复极时间依次为:(0.77±0.02) s、(0.78±0.06) s、(0.65±0.03) s、(0.45±0.01) s、(0.35±0.03) s,P<0.01]。结论 采用Accutase酶对人诱导多能干细胞来源心肌细胞进行分离有助于膜片钳记录。相比其他消化时间,Accutase酶消化1 min记录人诱导多能干细胞来源心肌细胞动作电位相对省时,同时可获得最佳动作电位形态。

用人类诱导多能干细胞来源的心肌细胞快速检测中药毒性的方法

目的建立一种利用人类诱导多能干细胞来源的心肌细胞(hi PSC-CM)快速并且有效筛选中药复方毒性的方法。方法用hi PSC-CM检测了29种市场上常用的中药复方,通过细胞的形态和心肌跳动速度的变化,检测中药复方的毒性。结果实验发现包括云南白药胶囊等在内的19种中药复方对hi PSC-CM的跳动有明显影响,而包括痰咳净片等在内的10种中药复方对hi PSC-CM无明显影响。结论药物效果与已报道的药物不良反应一致,利用hi PSC-CM是一种快速且有效筛选中药复方毒性的方法。

利用hiPSC-CPCs结合纤维蛋白凝胶构建3D心肌微组织

目的利用人诱导多能干细胞来源心肌前体细胞(Human induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitor cells,hiPSCs-CPCs)结合纤维蛋白凝胶构建3D心肌微组织用于研究心脏发育及药物筛选。方法首先利用化学分化法获得hiPSC-CPCs,并对其进行鉴定,然后将其混于纤维蛋白凝胶构建3D微组织,待hiPSC-CPCs分化成心肌细胞后获得心肌微组织;观察心肌微组织随培养时间延长的形态变化;分别于第15天和第30天对心肌微组织进行冰冻切片,使用免疫荧光对获得的心肌微组织进行心肌鉴定,并统计分析心肌微组织中心肌细胞的肌节长度、Z带宽度和排列情况;使用钙成像技术检测第15天和第30天心肌微组织的钙信号变化;使用MUSCLEMOTION ImageJ macro插件分析第15天和第30天的心肌微组织的收缩情况,并利用该软件检测心肌微组织对药物的反应。结果使用化学分化法可高效分化获得hiPSC-CPCs,将其与纤维蛋白凝胶结合可成功构建3D微组织,且该微组织培养至第10天可成功获得具有自发跳动能力的心肌微组织,继续培养至第30天,心肌微组织形态仍可维持,未出现溶解情况;免疫荧光结果显示,心肌微组织可高表达心肌标志物c Tn T和α-actinin,随着培养时间延长,肌节更趋于成熟状态;钙成像结果显示,可顺利检测到心肌微组织的钙信号变化,且随着培养时间延长,钙信号变化一致性明显提升;MUSCLEMOTION ImageJ macro结果显示,随着培养时间延长,心肌微组织收缩频率降低、收缩幅度增强,且异丙肾上腺素能成功激动心肌微组织,且随培养时间的延长,心肌微组织对异丙肾上腺素的反应更加灵敏。结论将hiPSC-CPCs混于纤维蛋白凝胶中可成功构建可持续培养的3D心肌微组织,其钙信号及收缩易于检测,且对药物反应敏感,有望成为研究心脏发育和药物筛选的有利工具。

心脏组织工程中细胞和生物支架的研究热点

背景:心脏组织工程技术的出现和发展,为心血管疾病尤其是心肌梗死的治疗提供了新的选择。目的:通过对心脏组织工程的2个核心要素即细胞和生物支架的研究进展进行综述,以期为心脏组织工程技术应用于心血管疾病治疗提供参考及依据。方法:通过检索PubMed数据库及中国知网数据库2010至2019年期间心脏组织工程相关文章,以"cardiac tissue engineering,cardiomyocytes differentiation,cardiac tissue engineering,cardiomyocytes differentiation,bone marrow derived stem cells,human embryonic stem cells,induced pluripotent stem cells,menstrual blood stem cells,biological scaffolds"为英文检索词,以"心脏组织工程,心肌细胞分化,干细胞,生物支架"等为中文检索词,最终选择78篇英文文献纳入研究。结果与结论:多种来源的细胞(包括心肌细胞、骨骼肌细胞、心脏成纤维细胞、骨髓来源干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、月经血干细胞)和生物支架(包括水凝胶、脱细胞支架、细胞片及心脏芯片)都可应用于心脏组织工程,但心脏组织工程仍然存在诸多需要解决的问题,如合适的细胞来源、新型支架材料的研发、诱导分化技术的优化,植入时机及途径的优化。

基于hiPSC-CM的新型明胶水凝胶构建体外心肌微组织研究

目的 探索应用新型明胶水凝胶复合人诱导多能干细胞来源心肌细胞(hiPSC-CMs)构建体外心肌微组织的可行性。方法 制备一种新型明胶水凝胶,以冷冻扫描电镜观察其表面结构,以循环拉伸试验测定其机械强度。在该材料上种植hiPSC-CMs,评估该材料的细胞相容性及其沟槽结构对心肌细胞的影响。将交联明胶水凝胶与hiPSC-CMs混合制备心肌微组织,探索构建体外心肌微组织过程中和冻存后心肌细胞的活性。结果 冷冻扫描电镜显示,新型明胶水凝胶表面呈现均匀的疏松多孔结构。循环拉伸试验显示,新型明胶水凝胶具有良好的机械性能。细胞试验显示,心肌细胞在该材料上生长良好,其沟槽结构对心肌细胞的有序排列有一定的引导作用。新型明胶水凝胶与hiPSC-CMs混合构建心肌微组织的实验结果表明,明胶水凝胶对心肌细胞具有良好的保护作用,对冻存复苏的心肌细胞具有一定的细胞保护作用。结论 新型明胶水凝胶具有疏松多孔的表面微结构、良好的力学性能和细胞相容性,对体外构建心肌微组织中的细胞和冻存后的细胞具有保护作用,未来有望用于组织工程领域,进行器官再生、药物筛选、体外建模等方面的研究。

氯化钴诱导hiPSC-CMs体外缺氧模型的建立

为进一步了解缺氧性心血管疾病的发病机制,通过使用CHIR99021和IWP2抑制剂的组合诱导和单层诱导分化方法获得人诱导性多能干细胞来源心肌细胞(Human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs),并在hiPSC-CMs的培养系统中加入氯化钴进行处理,通过CCK-8检测、Hoechst荧光染色分析、台盼蓝染色分析、qRT-PCR检测和Western blot检测确定最佳处理浓度和时间。CCK-8检测结果显示,低浓度CoCl2(100、300μmol/L)处理显著提高hiPSC-CMs细胞活力(p<0.01),高浓度CoCl2(900、1200μmol/L)处理显著抑制hiPSC-CMs细胞活力(p<0.001),并且作用趋势呈剂量和时间依赖性,600μmol/L CoCl2处理对于hiPSC-CMs的细胞活力影响不明显(p<0.05);Hoechst荧光染色结果显示,CoCl2处理24 h和48 h后,低浓度CoCl2处理对细胞无影响,Hoechst染色阳性细胞数量少(p>0.05),高浓度CoCl2处理剂量依赖性增加阳性细胞数量(p<0.0001),且48 h处理组的结果与24 h处理组无显著差异;台盼蓝染色结果表明,CoCl2处理可剂量依赖性促进细胞凋亡;CoCl2处理后,促凋亡相关基因Bax和蛋白Bax表达呈剂量依赖性上调(p<0.001),抗凋亡相关基因Bcl-2和蛋白Bcl-2表达呈剂量依赖性下调(p<0.001);CoCl2处理可剂量依赖性促进hiPSC-CMs细胞的凋亡。通过qRT-PCR检测和Western blot检测确定600μmol/L为最佳处理浓度,24 h为最佳处理时间,证明了该处理条件既不影响hiPSC-CMs细胞活力又可致其缺氧凋亡,建立了氯化钴诱导的hiPSC-CMs体外缺氧模型。论文结果为体外探索缺氧引起的心血管疾病的发病机理和寻找新的治疗靶点与药物提供了可靠的工具。