诱导多能干细胞来源的间充质干细胞的治疗潜力与应用风险

诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞(iMSC)已被提出作为原代间充质干细胞(MSC)的替代来源,在疾病治疗相关研究中也显示出多种优势。但是iMSC更适用于何种疾病类型,以及是否具有潜在的风险均未被充分阐明。本研究利用公共数据库中的高通量测序数据,将iMSC与骨髓源的MSC(BM-MSC)、脂肪源的MSC(AD-MSC)和脐带源的MSC(UC-MSC)进行对比,通过不同生物信息学方法,包括差异表达基因分析、功能富集分析、蛋白质相互作用网络分析及CMap数据库筛选,结果表明,iMSC具有独特的基因转录特征,与3种常用的MSC在基因表达上存在显著差异,特别是在神经、肌肉发育和免疫调节相关基因表达上;差异基因的功能富集分析进一步证实,iMSC在神经相关疾病治疗中表现出潜在优势,同时具有较低的免疫原性,但也存在较高的成瘤性风险;通过CMap数据库分析,识别了可能抑制iMSC成瘤性的基因靶点和小分子抑制剂,为降低iMSC应用风险提供了可能的策略。综上所述,iMSC作为细胞治疗的潜在来源,在神经疾病治疗中具有潜在优势,但其安全性需通过更多实验和临床研究来验证。

凋亡诱导因子基因敲减对骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的影响

背景:众多基础与临床试验证实:骨髓间充质干细胞移植后的低存活率严重制约着其发挥长期的治疗效果。课题组前期研究发现凋亡相关因子在骨髓间充质干细胞凋亡过程中发挥了重要作用,其中凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)蛋白可能是其中一个关键因子。目的:将AIF敲减的骨髓间充质干细胞移植至小鼠梗死心肌中,验证低AIF表达骨髓间充质干细胞移植后的存活情况以及对进一步改善心功能的重要性。方法:首先,通过LV-AIF-shRNA慢病毒感染骨髓间充质干细胞下调AIF蛋白表达,应用流式细胞术及Western blot、RT-qPCR检测慢病毒的感染效率,CCK-8检测AIF敲减骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的细胞活力;然后,构建急性心肌梗死小鼠模型,分别将正常及AIF敲减的骨髓间充质干细胞移植至心肌梗死区域,免疫荧光检测AIF蛋白的表达,ELISA检测血清脑钠尿肽水平,心脏超声检测心功能,Masson染色观察心肌纤维化情况,RT-qPCR检测AIF敲减骨髓间充质干细胞移植后SRY基因表达反映细胞存活情况。结果与结论:①LV-AIF-shRNA慢病毒感染成功构建AIF基因敲减的骨髓间充质干细胞,感染效率为97.7%,且AIF表达有显著下降(P<0.001);②在缺血缺氧培养状态下,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞较正常骨髓间充质干细胞的细胞活力显著增加;③与移植正常骨髓间充质干细胞相比,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞移植后在梗死心肌中的存活数目显著升高至3.71倍(P<0.001),并且显著减少了梗死区域AIF蛋白表达、心肌纤维化程度;④与移植正常骨髓间充质干细胞相比,AIF基因敲减骨髓间充质干细胞移植后血清脑钠尿肽水平显著降低(P<0.05),左室射血分数、左室缩短分数均有显著改善(P<0.05);⑤结果表明:AIF基因敲减可通过增强骨髓间充质干细胞移植后的细胞活力、增加骨髓间充质干细胞在供体内的存活从而减少心肌纤维化,改善急性心肌梗死后心功能。

缺氧诱导因子-1α调控骨形态发生蛋白9对间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导间充质干细胞(MSCs)C3H10T1/2成骨分化的影响。方法体外培养小鼠MSCs C3H10T1/2细胞系,分为5组:NC组(正常培养C3H10T1/2细胞)、Ad-GFP组(转染腺病毒液)、Ad-BMP9组(转染BMP9过表达的腺病毒液)、pcDNA3.1-mRFP组(转染Ad-BMP9+pcDNA3.1空载质粒)、pcDNA3.1-HIF-1α组(转染Ad-BMP9+HIF-1α过表达质粒)。采用碱性磷酸酶(ALP)显色及活性检测试剂盒检测各组C3H10T1/2细胞中ALP活性;采用茜素红S染色检测各组C3H10T1/2细胞钙盐沉积情况,并用吸光度(A)值进行定量分析;采用免疫印迹法检测各组C3H10T1/2细胞中BMP9、HIF-1α及成骨分化标志物骨钙素(OC)、骨桥蛋白(OPN)及Runt相关转录因子2(Runx2)蛋白表达。结果与NC组、Ad-GFP组比较,Ad-BMP9组ALP活性、钙盐沉积、A值及BMP9、HIF-1α、OC、OPN、Runx2蛋白表达增加(P<0.05)。与Ad-BMP9组、pcDNA3.1-mRFP组比较,pcDNA3.1-HIF-1α组ALP活性、钙盐沉积、A值及BMP9、HIF-1α、OC、OPN、Runx2蛋白表达增加(P<0.05)。结论HIF-1α可促进BMP9诱导MSCs C3H10T1/2成骨分化,可能与上调OC、OPN及其下游Runx2蛋白表达有关。

MAFA-PDX1过表达慢病毒感染人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化

背景:干细胞来源胰岛β细胞移植被认为是治疗1型糖尿病的有效手段。人脐带间充质干细胞是理想的细胞来源,但其向胰岛β细胞分化的效率不高。目的:研究MAFA、PDX1修饰促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能。方法:构建MAFA-PDX1过表达慢病毒载体,用细胞形态学、RT-qPCR法、双硫腙染色比较3种方案[方案A:单纯慢病毒组;方案B:先药物(尼克酰胺、β-巯基乙醇)诱导再加慢病毒组;方案C:慢病毒和药物诱导同时进行组]诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的效率和潜能。结果与结论:(1)细胞形态学改变:经3种方案诱导后细胞形态均发生了改变,方案B在诱导第11天细胞聚集生长最为明显,出现聚集生长的胰岛样细胞团;(2)RT-qPCR检测胰岛相关基因的表达差异:同一诱导时间点3种方案横向比较,在诱导第5天,方案C的MAFA和PDX1基因表达量最高,方案B的GCG基因表达量最高;在诱导第11天,方案B的MAFA、PDX1基因表达量以及INS和GLUT2基因表达量最高;(3)双硫腙染色鉴定锌离子:3种方案诱导第11天部分细胞被双硫腙染成棕红色,其中方案B中部分小岛状细胞被染成棕红色,颜色较深(阳性表达);(4)结果表明,MAFA和PDX1共过表达可促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化;MAFA-PDX1基因修饰联合药物诱导方案优于单纯基因修饰方案。

牙髓和牙周韧带间充质干细胞成骨能力差异分析研究

目的探究牙髓间充质干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)和牙周韧带间充质干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)在成骨能力上的差异机制。方法培养人牙髓干细胞和牙周干细胞(分为DPSCs组和PDLSCs组),比较两种干细胞诱导成骨分化能力的差异,通过实时荧光定量PCR检测成骨分化过程中关键转录因子的转录表达差异。同时,从GEO官网下载牙组织单细胞测序数据(GSE161267_RAW),通过比较干细胞亚群占比差异、调控成骨分化基因表达差异及生物学功能富集等揭示两种组织干细胞成骨分化功能差异的原因。结果成骨诱导分化结果显示,DPSCs组茜素红着色较PDLSCs组更深,运用RT-PCR检测成骨分化关键转录因子骨钙素(osteocalcin,OC)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RunX2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、破骨细胞抑制因子(osteoprotegerin,OPG)和骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)。结果显示,与PDLSCs组相比,DPSCs组Osteocalin、ALP、RunX2、OPG和BMP-2基因转录水平显著升高(**P<0.01,*P<0.05)。单细胞测序数据分析结果显示,牙周和牙髓组织中干细胞构成比例不同,其中牙周组织中MSC2和MSC3亚群占比多,牙髓组织中MSC1亚群占比多;MSC1中调控成骨分化基因表达显著高于MSC2和MSC3。差异基因生物学功能富集结果显示,MSC1亚群主要表现为成骨分化及参与成骨分化的信号通路。结论DPSCs较PDLSCs有更高的成骨分化功能,是由于DPSCs中成骨分化功能强大的细胞亚群含量高于PDLSCs。

调整细胞培养条件提高间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎的潜能

背景:间充质干细胞外泌体有望发展成为治疗骨关节炎的无细胞疗法,而通过调整细胞培养条件,可以进一步提高其治疗活性和临床转化潜能。目的:综述分析细胞培养条件对外泌体活性的影响,分析其临床转化潜力。方法:查阅国内外有关骨关节炎/软骨损伤修复与间充质干细胞来源外泌体的文献。检索词分别为“外泌体,间充质干细胞,骨关节炎,软骨修复”和“exosomes,extracellular vesicles,mesenchymal stem cells,osteoarthritis,cartilage repair”,检索数据库分别为PubMed和中国知网数据库,检索时限为2010-2023年,最后纳入100篇文献进行总结和分析。结果与结论:(1)在间充质干细胞的培养过程中,提供有利于软骨细胞生长的物理环境,或添加软骨保护小分子、成软骨诱导因子和炎症因子等刺激细胞,可以进一步提高间充质干细胞外泌体在维持软骨细胞表型、促进软骨再生和免疫抑制等方面的调控活性;因此,其他具有相似特征的物理或化学因素,也有可能提升间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎的疗效。(2)低氧诱导、脉冲电磁场刺激、生物反应器及软骨保护分子(如人甲状旁腺素1-34)刺激等细胞培养方案具有安全、可规模化生产等优点,可用于制备临床用途的、疗效好的间充质干细胞外泌体。(3)间充质干细胞外泌体有望实现骨关节炎的修正治疗,通过调整细胞培养方案提升治疗活性,可进一步提高其临床转化的可行性。

利用Luciferase修饰的T细胞检测间充质干细胞免疫抑制功能方法的建立与评价

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。广泛存在于骨髓、脐带、胎盘、脂肪等组织中,具有向炎症部位募集、多向分化、自我更新以及释放可溶性生物因子和分泌多种旁分泌因子的特点,这些特性使得MSCs能够在组织内修复受损细胞、减轻炎症反应、调节免疫的过程中发挥着重要作用^([1]),目前应用于改善急性呼吸窘迫综合征(ARDS)^([2-3])、移植物抗宿主病(GVHD)^([4])等。

多孔Ti-6Al-4V医用金属植入材料对骨髓间充质干细胞活性和成骨特性的作用

目的初步研究多孔(Ti-6Al-4V,TC4)金属支架的成骨分化作用和对SD大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的细胞毒性作用。方法SD大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)原代细胞的培育,采用体外全骨髓贴壁的方法进行;rBMSCs表型鉴定采用流式细胞术;实验组TC4支架分别为圆形9、16、64孔,方形25、64孔,对照组为无孔,都采用选择性激光熔化(SLM)制备;在TC4上接种rBMSCs,用扫描电镜(SEM)观察48 h后的细胞形态和黏附状况,利用CCK-8对TC4的细胞毒性作用进行检测;用酶标法定量到第7、14天测碱性磷酸酶(ALP),用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测骨连接蛋白(on)、Ⅰ型胶原蛋白(col1)这两者成骨基因的表达,于21 d时行茜素红染色。结果扫描电镜显示:小孔径TC4金属支架更利于rBMSCs细胞黏附;CCK-8结果显示:大孔径支架细胞增殖活性更高,圆形9孔为最高(第7天OD平均值0.69);ALP活性测定显示:ALP活性随着孔径减小而提高,圆形和方形64孔组ALP活性最高(第14天圆形64孔、方形64孔组ALP平均值分别为1.75金氏单位/gprot、1.61金氏单位/gprot);qRT-PCR检测显示:成骨基因表达水平随着孔径减小而提高,圆形和方形64孔组on和col1表达水平最高(第14天圆形64孔on和col1平均值分别为2.17、2.29;方形64孔on和col1平均值分别为1.70、1.81);茜素红染色显示:圆形和方形64孔支架组橘红色钙化结节相较于对照组颜色更深,面积更大。结论由SLM制备的多孔TC4支架对rBMSCs无细胞毒性,并且能促进其增殖,较大孔径对rBMSCs增殖有益,较小的孔径更利于rBMSCs黏附及成骨分化。

人诱导多能间充质干细胞来源外泌体对肺泡巨噬细胞焦亡的抑制作用

目的探讨人诱导多能间充质干细胞来源外泌体(iMSC-Exos)对肺泡巨噬细胞(AM)焦亡的作用及机制。方法通过旋转超滤法提取人诱导多能间充质干细胞(iMSC)培养上清液中的外泌体,并利用透射电镜、蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)、高分辨率可调电阻脉冲对提取的外泌体进行鉴定。体外培养大鼠AM细胞株NR8383,取对数生长期细胞分为3组:对照组在AM上清液中加入等量磷酸盐缓冲液(PBS);脂多糖/三磷酸腺苷(LPS/ATP)组AM经500μg/L的LPS刺激23 h后再加入5 mmol/L的ATP刺激1 h诱导细胞焦亡;iMSC-Exos组将100 mg/L iMSC-Exos与NR8383细胞共孵育3 h后再给予LPS和ATP刺激。采用细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)和乳酸脱氢酶(LDH)分析检测细胞毒活性;采用免疫荧光法观察细胞凋亡和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)表达;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测AM释放炎性因子白细胞介素(IL-1β、IL-18)水平;采用Western blotting法检测NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体途径及焦亡相关蛋白消皮素D(GSDMD)表达。结果提取的外泌体经透射电镜观察为圆形囊泡,Western blotting显示外泌体标志物CD63、CD9呈阳性表达,高分辨率可调电阻脉冲检测显示粒子平均直径130 nm,提示外泌体提取成功,能被AM吞噬。与对照组相比,LPS和ATP刺激后,细胞活性下降〔(0.56±0.05)%比(1.06±0.07)%,P<0.01〕,坏死物质LDH释放增加(U/L:1218.86±22.73比188.30±1.61,P<0.01),炎性因子分泌增加〔IL-1β(ng/L):958.91±32.78比194.63±5.14,IL-18(ng/L):870.89±21.86比288.85±24.48,均P<0.01〕,细胞凋亡率〔(55.35±6.19)%比(12.01±1.32)%,P<0.01〕及caspase-1表达均升高(荧光强度:41.06±3.65比2.80±0.54,P<0.01),提示LPS联合ATP可成功诱导细胞焦亡。与LPS/ATP组相比,给予iMSC-Exos预处理后,AM活性增加〔(0.81±0.05)%比(0.56±0.05)%,P<0.01〕,LDH释放减少(U/L:535.05±42.55比1218.86±22.73,P<0.01),炎性因子分泌减少〔IL-1β(ng/L):381.82±19.50比958.91±32.78,IL-18(ng/L):533.77±31.54比870.89±21.86,均P<0.01〕,细胞凋亡率〔(19.74±2.96)%比(55.35±6.19)%,P<0.01〕和caspase-1表达均下降(荧光强度:12.16±1.31比41.06±3.65,P<0.01),同时NLRP3炎症小体途径及焦亡相关蛋白GSDMD表达水平受到显著抑制〔NLRP3蛋白(NLRP3/β-actin):0.62±0.06比1.89±0.11,活化的caspase-1蛋白(cleaved caspase-1/β-actin):0.42±0.07比1.22±0.17,GSDMD蛋白(GSDMD/β-actin):0.57±0.05比1.22±0.05,均P<0.01〕。结论iMSC-Exos抑制了LPS/ATP诱导的AM焦亡和炎性因子表达,可能与靶向抑制NLRP3炎症小体途径有关,提示iMSC-Exos能抑制AM焦亡,发挥抗炎效应。

体外人多能干细胞向间充质样细胞分化、鉴定和纯化方法的研究进展

人多能干细胞来源间充质干细胞(hPSCs-MSCs)具有与成体间充质干细胞(MSCs)相似的分化功能,还具有体外增殖能力强、来源丰富和免疫原性风险低等优点。hPSCs-MSCs可应用于免疫调节、抑制炎症、血管化和组织缺损修复及再生等多个领域,使其成为在再生医学和组织工程中应用最多的种子细胞。针对现有问题并结合相关文献,对hPSCs-MSCs的分化、鉴定标准、纯化方法和细胞性能等进行综述,为hPSCs-MSCs在再生医学与组织工程领域中的应用研究提供理论依据。

间充质干细胞诱导的神经干细胞对脑出血大鼠的神经保护作用

目的探讨胎盘间充质干细胞(pMSCs)诱导的神经干细胞(iNSCs)对脑出血(ICH)大鼠的神经保护作用。方法利用诱导培养基将胎盘间充质干细胞诱导生成神经干细胞;采用免疫荧光染色鉴定诱导生成的神经干细胞表达神经干细胞相关标记物的情况。SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、脑出血组(ICH组)、诱导的神经干细胞移植组(iNSCs组),构建大鼠纹状体内囊出血模型,24 h后,将诱导的神经干细胞原位移植入脑出血部位。移植7 d后,采用前肢放置实验、转角实验、改良型神经功能缺损评分等方法评估各组的神经功能;评估各组大脑血肿体积率;采用HE及尼氏染色观察各组大脑组织形态变化;采用免疫荧光双标染色观察各组神经元Cleaved-Caspase-3表达情况;采用Western blot检测各组大脑组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)蛋白表达水平。结果胎盘间充质干细胞诱导培养7 d后,有大量直径100μm左右、桑葚样或圆球体形的细胞球出现,细胞球中Nestin、GAP-43、Sox-2等神经干细胞标记物高表达。与ICH组比较,iNSCs组的神经功能障碍改善,且大脑血肿体积率降低(P均<0.05)。HE及尼氏(Nissl)染色结果显示,iNSCs组大脑血肿周围的炎细胞浸润数目较ICH组减少,同时,iNSCs组神经元数量增加(P<0.05)。免疫荧光双标染色结果显示,与ICH组比较,iNSCs组大脑血肿周围Cleaved-Caspase-3阳性神经元数目减少(P<0.05);Western blot结果显示,iNSCs组SOD蛋白水平高于ICH组(P<0.05)。结论胎盘间充质干细胞诱导的神经干细胞移植可能通过提高大脑抗氧化能力,减少脑出血大鼠神经元凋亡,进而促进脑出血大鼠的神经损伤修复。

运动介导低氧诱导间充质干细胞在糖尿病足血管新生中的作用

糖尿病足(diabetic foot,DF)作为糖尿病常见的并发症,目前尚未发现理想的治疗手段,且糖尿病发展为DF的发病机制尚未厘清,但有效的干预措施可以改善糖尿病血管病变的发生、发展和降低DF发生风险。因此,探究DF新的发病机制对丰富其治疗手段具有重要的意义。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成为DF研究的新兴热点,运动介导低氧诱导MSCs促进DF血管新生成为运动干预DF可能的关键机制之一。回顾运动介导机体在低氧状态下的相关研究,对低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的依赖途径上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达从而增强MSCs促血管生成活性及运动干预机制进行了综述,提出运动介导低氧诱导MSCs分化可能成为DF有效预防、延缓和治疗的一种新途径。科学运动促进MSCs分泌促血管生长因子和释放外分泌体调控血管新生从而缓解DF缺血、缺氧可能是防治DF不同病程的有效策略。

人诱导多能干细胞定向分化为间充质干细胞的方法研究

目的研究一种高效、简捷的直接将人诱导多能干细胞(hiPS)诱导分化为间充质干细胞(MSCs)的方法。方法用MSCs诱导培养基将iPS诱导为MSCs样细胞,倒置显微镜下观察诱导过程中细胞形态的变化,流式细胞术检测iPS及iPS-MSCs表面标志物的表达,RT-PCR检测诱导过程中细胞内NANOG、OCT-4、MSX-1等干性基因表达水平,成骨、成脂、成软骨诱导鉴定其三系分化能力。结果诱导后iPS逐渐向外生长,P4代iPS-MSCs逐渐变为长梭形;CD29、CD44、CD73、CD90、CD105在iPS-MSCs中表达阳性,而CD34、CD45、HLADR则为阴性;iPS在诱导过程中NANOG和OCT-4基因表达逐渐降低,iPS-MSCs不表达NANOG和OCT-4基因,MSX-1基因在诱导第4天即高表达并维持在高水平;iPS-MSCs具有成骨、成脂、成软骨能力。结论成功建立一种高效、简捷的直接将iPS诱导为功能性的MSCs样细胞的方法,为iPS-MSCs进一步的研究与应用提供了技术基础。

小鼠骨髓间充质干细胞、骨髓单核细胞和胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞的效率比较

目的比较小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、小鼠骨髓单核细胞(BM-MNCs)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程为诱导性多能干细胞(iPS细胞)的效率。方法用慢病毒LV-ef1a-mOct4-IRES-EGFP、LV-ef1amSox2-IRES-EGFP、LV-ef1a-mKlf4-IRES-EGFP和LV-ef1a-mc-Myc-IRES-EGFP感染BMSCs、BMMNCs和MEFs,通过计算碱性磷酸酶染色阳性克隆数比较这3种细胞重编程为iPS细胞的效率。用胚胎干细胞表面标记检测、胚胎干细胞内源基因检测、拟胚体形成实验和畸胎瘤形成实验验证重编程获得的iPS细胞的多能性。结果起源于小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs的3种iPS细胞均能形成边缘光整的致密克隆,可表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织。但是BMSCs来源的碱性磷酸酶阳性克隆数低于BM-MNCs和MEFs来源的克隆数。结论小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs均可重编程为iPS细胞,但BMSCs重编程为iPS细胞的效率低于BM-MNCs和MEFs。

诱导多能干细胞来源间充质干细胞对大鼠骨关节炎的治疗作用

目的研究诱导多能干细胞来源间充质干细胞(iPSC-MSCs)对大鼠骨关节炎(OA)的治疗作用。方法采用Hulth法建立大鼠OA模型,编号后运用Excel表格随机分组功能将其分为模型组、iPSC-MSCs组、人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSCs)组、玻璃酸钠(HA)阳性对照组,另设假手术组作为对照,每组10只。除HA组动物多次给药(每周1次,共给药5次)外,其它各组均单次给药,每次每只动物在术侧关节腔注射50μL药物iPSC-MSCs和hUC-MSCs,假手术组和模型组同法给予生理盐水。给药5周后处死动物,观察iPSC-MSCs对关节直径差值、关节腔结构及评分、关节面评分、病理学评分等指标的影响;检测膝关节基质金属蛋白酶(MMP)-13、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)及解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS)-5表达情况。结果 iPSCMSCs和hUC-MSCs给药均可显著降低膝关节面Pelletier评分、关节直径和病理Mankin评分,改善关节腔结构,降低X线评分和关节肿胀,且iPSC-MSCs较hUC-MSCs给药在降低Pelletier评分[(1.22±0.67)比(2.00±0.71),P=0.021]方面差异有统计学意义;相比于模型组,iPSC-MSCs关节腔注射给药可显著增加软骨层CollagenⅡ表达[(35.87±8.52)比(69.90±7.65),P<0.01],降低MMP-13[(59.25±5.56)比(33.75±5.85),P<0.01]和ADAMTS-5[(52.25±10.47)比(22.25±6.13),P<0.01]表达水平,且与hUC-MSCs给药差异有统计学意义,iPSC-MSCs组与hUC-MSCs组CollagenⅡ、MMP-13、ADAMTS-5值分别为[(69.90±7.65)比(61.00±5.52),P=0.010]、[(33.75±5.85)比(43.25±6.02),P=0.028]、[(22.25±6.13)比(36.50±4.65),P=0.011]。结论关节腔注射iPSC-MSCs可显著改善OA大鼠关节病理,具有明显的软骨保护作用。

人诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞促进成体造血发生研究

目的探讨人诱导性多能干细胞(hiPSCs)在神经分化因子作用下生成的间充质干细胞(N-MSCs)对成体造血的影响。方法 1)与神经发育相关的MSCs的获得:hiPSCs在向前脑类器官培养过程中分离纯化出1个性质稳定的细胞系,命名为N-MSCs,通过形态学观察、流式检测和脂肪、成骨、软骨细胞分化实验对其进行鉴定。2)N-MSCs对成体造血的影响:人胚胎干细胞(hESCs)与鼠AGM-S3细胞共培养获得的CD34^+细胞分别与AGM-S3、N-MSCs(2×10~4个)共培养,单独悬浮培养为对照组(CD34^+组,1×10~4个),流式检测关于造血干/祖细胞(CD34^+CD45^+)和巨噬细胞(Mφ)表面标记的变化。3)N-MSCs对人脐带血来源的巨噬细胞(CB-Mφ)的影响:Mφ分别与脐带MSCs(UC-MSCs)、N-MSCs(2.5×10~5个)在transwell中共培养,Mφ单独培养为对照组(5×10~5个),再用IL-4对Mφ做刺激试验。用MGG染色、流式检测、qRT-PCR等方法分析Mφ形态学、M2型Mφ相关表面标记CD206和IL-10基因表达情况。结果 CD34^+组及其分别与AGM-S3、N-MSCs 2个共培养组培养10 d时收获的CD34^+CD45^+细胞数量(×10~3个)分别为:0.44±0.045 vs 0.63±0.170 vs 2.93±0.190(P<0.01);Mφ数量(×10~4个)分别为1.70±0.046 vs 1.49±0.057 vs 2.46±0.086(P<0.05)。Mφ与UC-MSCs共培养组及与N-MSCs共培养组CB-Mφ的CD206占比(%)为56.1±1.15 vs 60.0±1.76(P<0.05)、IL-10的相对表达量为6.8±0.748 vs 8.10±0.804(P<0.01)。结论 N-MSCs能促进成体造血和CB-Mφ向M2型Mφ的转变。

诱导多能干细胞来源的间充质干细胞的生物学特性

目的:利用外周血单个核细胞获得诱导多能干细胞(iPSC)并进一步诱导分化为间充质干细胞(MSC),观察iPSC来源MSC的生物学特性,并与其他来源MSC的相关生物学特性进行对比。方法:获取外周血单个核细胞并使用仙台病毒载体对其进行重编程因子的转导,鉴定其细胞形态和多能性因子的免疫荧光表达水平。对1株完成所有鉴定的iPSC进行MSC的诱导分化,并利用免疫组织化学和流式细胞术对其细胞形态、免疫表型进行鉴定。使用成脂、成骨培养液进行成脂成骨的诱导分化,以鉴定其分化能力。利用PCR鉴定其转录因子的表达,以系统阐明iPSC诱导分化所得的MSC的生物学特性。结果:外周血单个核细胞经过携带重编程因子的仙台病毒转染后,命运发生转归。通过启动干性基因表达,成功地获得iPSC克隆,经扩增、纯化,最后获得了可稳定增殖的iPSC。免疫荧光定位证明,其多能性因子分别在胞膜和胞内得到表达。经鉴定,利用iPSC诱导获得了间充质干细胞,其形态与其它来源的MSC一致,免疫表型检测也相符。iPSC-MSC的成脂成骨诱导分化与UC-MSC结果一致,表明iPSC-MSC具有分化(成脂成骨)能力,也表明了其具备MSC的多项基本特征。RT-PCR检测显示,iPSC-MSC高表达PDL1,低表达A20;其STAT3表达水平与BM-MSC相当,但高于UC-MSC;而HIF1α的表达水平与UC-MSC相当,但低于BM-MSC。结论:外周血单个核细胞在携带重编程因子的仙台病毒载体的转导后,成功地启动了细胞的干性表达,获得了具有多能干性的iPSC。iPSC可成功诱导分化为MSC,且分化后的MSC具备标准的MSC形态、免疫表型和分化能力。iPSC来源的MSC与脐带MSC相比,高表达免疫抑制分子PDL1并低表达A20等转录因子,提示iPSC来源细胞在细胞增殖和免疫调节等方面具有不同的生物学特性。

胚胎干细胞/诱导多能干细胞向间充质干细胞转化的研究进展

胚胎干细胞(ESCs)/诱导多能干细胞(iPSCs)因其有潜在成瘤性,制约了它的临床应用。间充质干细胞(MSCs)具有多向分化能力、免疫调节功能以及低免疫原性,且仍未发现它有成瘤性,因而成为干细胞治疗颇具临床应用价值的种子细胞。近年来研究发现应用合适的诱导方案可以从ESCs/iPSCs获取MSCs,结合ESCs/iPSCs的无限自我更新能力,ESCs/iPSCs向MSCs转化将可能是获取MSCs的一种数量充足且稳定的新来源。本文将对目前ESCs/iPSCs向MSCs转化的方法、机制以及新衍生的MSCs的免疫调节功能、干性特征做一综述。

当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的 研究当归体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞 (MSCs)分化的作用。方法 通过贴壁法分离大鼠MSCs,体外扩增培养。MSC用 2 0 μl当归注射液 /ml含 10 %胎牛血清的L -DMEM为预诱导条件 ,预诱导 2 4h后用当归注射液 10 0 μl/ml不含胎牛血清的L -DMEM进行诱导。光镜下观察细胞形态 ,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果 大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。当归诱导 3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞 ,出现胞体和突起 ,免疫细胞化学染色NSE及nestin呈阳性、GFAP阴性。

人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定

目的 探讨将成人骨髓间充质干细胞 (MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的方法 ,并对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定。 方法 分离人骨髓 ,梯度离心并结合全骨髓法进行培养 ,培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠及抗坏血酸。贴壁细胞传代 ,取第 3代细胞鉴定其成骨特性 ;在倒置相差显微镜下观察细胞形态 ,钙 -钴法染色检测碱性磷酸酶 (AL P)表达 ,免疫组织化学检测 型胶原表达 ,原位杂交检测骨连接素 (ON)、骨桥素 (OP)表达 ,Von Kos-sa染色检测钙结节形成。 结果 第 3代人 MSCs呈典型的成骨细胞形态 ,可连续传代 10次 ;AL P染色阳性率达 85 % ; 型胶原、ON和 OP表达阳性 ;Von Kossa染色可见钙结节形成。 结论 成功地将人 MSCs诱导分化为成骨细胞 ,所诱导的细胞具有典型的成骨细胞特性。