牛诱导性多能干细胞向心肌细胞的诱导分化

【目的】研究牛诱导性多能干细胞(Bovine induced pluripotent stem cells,biPSCs)向心肌细胞的分化能力。【方法】将biPSCs悬浮培养制备类胚体,采用类胚体介导体外自由分化与定向诱导分化(添加RA、DMSO和RA+DMSO3种诱导物)的方法,使biPSCs在体外分化,比较了biPSCs在3种不同心肌诱导条件下定向分化为心肌细胞的诱导效率;分别提取biPSCs、类胚体及不同诱导体系分化细胞的总RNA,用RT-PCR检测心肌细胞发育标志基因的表达。【结果】biPSCs在悬浮条件下培养7d,能够形成典型球形和囊腔样类胚体。类胚体再贴壁培养7d,经过免疫细胞化学检测,贴壁细胞大量分化为α-actin阳性的心肌样细胞。在体外诱导分化体系中,RA+DMSO共同诱导的效率较RA和DMSO单独诱导显著增高(P<0.05)。RT-PCR结果显示,各组分化后的细胞中心肌细胞发育特异性基因ACTA2与GATA4均有高水平表达。【结论】biPSCs在体外悬浮培养能够形成类胚体,类胚体贴壁培养后可以分化为α-actin阳性的心肌样细胞;分化形成的心肌样细胞均表达心肌特异性基因。

心肌营养素-1诱导小鼠诱导性多能干细胞心肌细胞定向分化的实验研究

目的:观察心肌营养素-1(CT-1)对小鼠诱导性多能干细胞(miPSCs)心肌细胞定向分化的诱导作用。方法:实验分为对照组与CT-1处理组。miPSCs经悬滴法诱导形成拟胚体,第3天培养基中加入1μmol/ml CT-1(CT-1组),对照组采用普通培养基。于第4、7、10和14天,收取细胞样本,采用实时PCR检测心脏特异标志物基因的表达。用免疫荧光染色及流式细胞术检测干细胞标志物Oct4和心肌特异性分化标志物肌钙蛋白I(cTnI)的表达。用透射电镜观察心肌样细胞的超微结构。结果:CT-1组第10天,样本中心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)基因表达的水平为同期对照组的1.75倍,有显著性差异(P<0.05)。免疫荧光染色法检测显示,两组均有cTnI表达。流式细胞术鉴定的结果显示,对照组与CT-1组cTnI的阳性率分别为28.5%和56.4%,有显著性差异(P<0.05)。电镜观察显示,CT-1组肌原纤维及胞内线粒体明显增多,肌纤维排列规则,可见细胞间桥粒连接和缝隙连接。结论:CT-1可显著提高miPSC向心肌细胞定向分化的效率。

高效制备人诱导多能干细胞并诱导分化为心肌细胞

目的提高人诱导性多能干细胞(hiPSC)转化效率,缩短其产生周期,并避免引入异源基因。方法利用GP2-293反转录病毒包装系统对人包皮成纤维细胞(HFFs)进行转化,引入小分子物质,并对类胚胎干细胞(ESC)克隆进行独立培养,检测标记蛋白,定向诱导分化能力和核型分析。结果 HFFs经转化后,20 d出现形态与ESC克隆相似的hiPSC,比经典法缩短了10 d,效率提高约12倍。它们与ESC同样表达标记蛋白;体外成功定向分化为心肌细胞。核型分析表明该hiPSC染色体核型正常。结论建立稳定的转化效率高、周期短的hiPSC生成体系,并成功诱导分化成心肌细胞,为心血管疾病的模型构建和临床研究提供实验基础。

microRNA-1和microRNA-133参与小鼠诱导多能干细胞向心肌的分化

目的研究microRNA-1(miRNA-1)和microRNA-133(miRNA-133)对小鼠诱导多能干细胞(mi PSCs)向心肌分化的影响。方法 RT-PCR分析mi PSC分化过程中microRNA-1和microRNA-133的表达变化;microRNA-1和micro-133反义寡核苷酸转染mi PSCs,增强miRNA-1和miRNA-133表达;并按照转染分子的不同,将细胞分为对照组(添加miRNA-U6)、miRNA-1组、miRNA-133组和miRNA-1+miRNA-133组。RT-PCR、q-PCR和免疫荧光化学染色检测miRNA转染并诱导mi PSCs分化后,各组细胞内miRNA-1和miRNA-133的表达变化以及心肌细胞相关特异性基因和蛋白的变化。结果 mi PSCs心肌分化过程中miRNA-1,miRNA-133的表达具有差异性,均在后期有显著增高(P<0.01);在分化过程中单独过表达miRNA-1和miRNA-133对心肌的分化并未有促进作用,但共表达miRNA-1和miRNA-133后,却显著增加心肌细胞的搏动数量和心肌基因的表达,并且促进了心肌细胞成熟。结论 miRNA-1和miRNA-133通过协同作用促进mi PSCs体外分化为心肌细胞,显著提高mi PSC向心肌细胞定向分化效率。

ERRα对hiPSCs衍生心肌细胞ATP合成的调控作用

目的探讨雌激素受体α(ERRα)在人诱导多能干细胞衍生心肌细胞(hiPSC-CMs)中对腺苷三磷酸(ATP)合成的调控作用。方法采用时序性短暂激活/抑制Wnt信号通路的方法诱导未分化人诱导多能干细胞(hiPSCs)分化为心肌细胞。使用免疫荧光法分别检测hiPSCs中多能性标志物性别决定区Y框蛋白2(SOX2)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA4)及肿瘤抗性抗原1-60(TRA-1-60),以及hiPSC-CMs中心肌特异性标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT)、缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达情况;RT-qPCR检测hiPSCs及hiPSCs-CMs中心肌肌钙蛋白T2(TNNT2)、肌球蛋白重链6(MYH6)mRNA的表达水平;Western blotting检测ERRα、细胞色素C(CytC)及线粒体丙酮酸载体1(MPC1)的蛋白表达水平。此外,用ERRα特异性抑制剂XCT790处理hiPSC-CMs后,采用Western blotting检测ERRα、CytC与MPC1蛋白表达的变化,试剂盒检测hiPSC-CMs的细胞活力、胞内ATP含量及线粒体膜电位的改变。结果免疫荧光检测显示,hiPSCs表达SOX2、SSEA4及TRA-1-60,而hiPSC-CMs表达cTnT及Cx43;与hiPSCs相比,hiPSC-CMs中TNNT2及MYH6 mRNA的表达水平明显增高(82.820±2.005 vs.1.001±0.029,90982.000±1968.000 vs.1.003±0.053),胞内ATP含量及ERRα、CytC、MPC1蛋白表达水平明显增高[分别为(9.905±1.286)nmol/mg prot vs.(4.582±0.141)nmol/mg prot,5.392±0.313 vs.1.050±0.076,8.954±0.293 vs.1.071±0.067,2.605±0.088 vs.1.031±0.091],差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,10μmol/L XCT790能有效抑制hiPSC-CMs中的ERRα蛋白活性且无细胞毒性,并可降低胞内ATP含量及线粒体膜电位[分别为(4.903±1.158)nmol/mg prot vs.(9.310±0.980)nmol/mg prot,1.407±0.022 vs.1.977±0.093],同时下调MPC1及CytC蛋白的表达水平(分别为0.705±0.019 vs.0.897±0.011,0.594±0.021 vs.0.797±0.025),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论hiPSCs分化为心肌细胞后,ATP含量的增加与ERRα表达增加有关,在hiPSC-CMs中ERRα可通过调控线粒体膜电位及CytC、MPC1蛋白的表达而调控ATP的合成。

诱导性多能干细胞在遗传性心脏病实验研究中的应用

人类诱导性多能干细胞(iPS细胞)的建立是目前最重要的科技进展之一。近年来,iPS细胞应用于遗传性心脏病细胞模型的建立,及其iPS细胞治疗动物心梗模型成功,为探索遗传性心脏病的发病机制和治疗带来了光明前景。

齐墩果酸对hiPSCs衍生心肌细胞成熟的促进作用及机制

目的探讨齐墩果酸(OA)促进丙酮酸激酶(PK)同工型转换在人诱导多能干细胞(hiPSCs)衍生心肌细胞(hiPSC-CMs)成熟过程中的作用。方法通过时序性激活和抑制Wnt信号通路,诱导未分化hiPSCs向心肌细胞分化,在诱导第19天将hiPSC-CMs分为空白对照组(添加B27的RPMI 1640培养基)、DMSO组(添加DMSO 2μl/ml)、OA加药组(添加5 mmol/L的OA 2μl/ml),所有培养基每2 d更换1次,共处理7 d。免疫荧光及RT-qPCR检测hiPSCs中干性因子及hiPSC-CMs中心肌特异性标志物的表达情况;Western blotting检测各组PK、线粒体融合蛋白(MFN2)的表达情况;Mito-Tracker染色检测各组细胞线粒体形态,电镜观察各组线粒体超微结构;EDU染色检测各组细胞增殖情况;流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期。结果免疫荧光染色结果显示,hiPSCs表达干性因子Nanog、Sox2,hiPSC-CMs表达心肌特异性标志物cTnT、Cx43、α-actinin。RT-qPCR检测结果显示,与诱导前的hiPSCs比较,hiPSC-CMs心肌相关基因TNNI3、MYH6、MYH7的表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。免疫荧光染色结果显示,与空白对照组、DMSO组比较,OA加药组细胞面积、肌节长度增加,细胞圆度指数降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,与空白对照组、DMSO组比较,OA加药组丙酮酸激酶1与丙酮酸激酶2比值(PKM1/PKM2)及MFN2的表达明显增高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。电镜观察见OA加药组线粒体融合变长;Mito-Tracker染色结果显示,OA加药组线粒体形成更成熟的网状结构。EDU染色结果显示,与空白对照组、DMSO组比较,OA加药组细胞增殖率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,与空白对照组、DMSO组比较,OA加药组多核细胞数有所增加。结论OA可促进hiPSC-CMs细胞结构、线粒体结构及形态的成熟,也可促进细胞多核化,并可通过调节PK同工型转换促进hiPSC-CMs的成熟。

诱导性多能干细胞与心血管疾病

背景:诱导性多能干细胞具有自我更新和多向分化能力的同时,又避免了胚胎干细胞的免疫排斥、伦理学争议等问题,因此在组织修复领域有着巨大的应用前景。目的:综述诱导性多能干细胞向心肌细胞、内皮细胞方向的分化以及其在心血管疾病领域的研究进展。方法:由第一作者检索2000至2015年Pub Med数据库以及中国知网数据库有关诱导性多能干细胞向心肌细胞和内皮细胞方向分化的文献,并进行系统整理、总结和分析,最终保留78篇文献进行分析。结果与结论:诱导性多能干细胞可以通过多种方法分化为心血管细胞。环孢菌素A、维生素C等因子可促进诱导性多能干细胞向心肌细胞方向分化,血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子等可促进诱导性多能干细胞向内皮细胞方向分化。诱导性多能干细胞源心血管细胞可用于建立体外疾病模型、体内移植、药物筛选等方面。

诱导性多能干细胞与心血管疾病

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)可通过对多种终末分化的体细胞进行外源性重编程而获得。iPSCs作为自体来源的细胞,在组织修复领域有着巨大的应用前景。然而,iPS诱导技术尚存在诸如制备率低、成瘤风险增加和整合基因残留等一系列问题。现结合国内外最新研究成果,在介绍有关解决iPSCs自身缺陷上所取得的研究进展的同时,重点对iPSCs的心肌定向诱导分化、iPS细胞源性心肌细胞的细胞特性以及其在心血管疾病再生医学临床治疗的最新研究进展做一综述。

参麦注射液对人诱导多能干细胞衍生心肌细胞钙信号的影响

目的 研究参麦注射液对人诱导多能干细胞衍生心肌细胞(HiPSC-CM)钙信号的影响。方法 通过CCK-8法测定参麦注射液(培养基中终体积分数为0.25%、0.50%、1.00%、2.00%)培养24 h对HiPSC-CM细胞存活率的影响;采用钙离子探针Fluo-4研究参麦注射液(2%,处理3 min)对HiPSC-CM自发钙瞬变频率的影响,并在不同电刺激频率(0.2、1.0、2.0 Hz)下研究参麦注射液对HiPSC-CM钙瞬变振幅、上升及下降时间和半峰全宽(FWHM)的影响。结果CCK-8结果显示,参麦注射液对HiPSC-CM无毒性,且在体积分数2%时细胞存活率显著高于对照组(P<0.05)。与加药前比较,对照组加药后自发钙瞬变频率没有明显变化,2%的参麦注射液组自发钙瞬变频率显著降低(P<0.001)。与加药前比较,在0.2、1.0 Hz电刺激频率下,参麦注射液显著降低HiPSC-CM的钙瞬变振幅、上升及下降时间和FWHM(P<0.01);在2.0 Hz电刺激频率下,参麦注射液显著降低HiPSC-CM的上升、下降时间和FWHM(P<0.01)。结论 参麦注射液能够降低HiPSC-CM自发钙瞬变的频率,且在不同频率的电刺激下能降低HiPSC-CM的钙瞬变振幅,表明钙信号调控可能是参麦注射液心肌保护作用的潜在机制之一。

诱导性多能干细胞在缺血性心脏病中的研究进展

缺血性心脏病已成为人类死亡的主要原因，特别是冠心病急性心肌梗死后，因大量终末分化的心肌细胞坏死后再生能力有限，使心功能严重下降，引发左室重构和扩大，并最终导致心力衰竭，预后很差。现有冠脉再通治疗（包括急诊溶栓和介入）虽能挽救部分缺血心肌，但本身不能实现心肌再生。近年来，采用干细胞移植的方法进行心肌重建应运而生，为缺血性心脏病的治疗开辟了新的途径。

糖尿病心肌病体内与体外模型研究进展

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是由持续高血糖状态引起心脏结构和功能损伤的心肌病变,是糖尿病最常见的并发症,其表型独立于高血压和冠心病等心脏疾病而显著增加糖尿病患者心力衰竭的发生风险。糖尿病心肌病实验模型的开发将有助于深入研究其分子机理,进而开发糖尿病心肌病的诊疗新方案。本文总结了目前领域内常用的糖尿病心肌病动物模型和体外细胞研究模型,介绍了诱导性多能干细胞来源的人源心肌细胞糖尿病心肌病模型的优势,以期为糖尿病心肌病研究中模型的选取提供新的思路。

氯化钴诱导hiPSC-CMs体外缺氧模型的建立

为进一步了解缺氧性心血管疾病的发病机制,通过使用CHIR99021和IWP2抑制剂的组合诱导和单层诱导分化方法获得人诱导性多能干细胞来源心肌细胞(Human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs),并在hiPSC-CMs的培养系统中加入氯化钴进行处理,通过CCK-8检测、Hoechst荧光染色分析、台盼蓝染色分析、qRT-PCR检测和Western blot检测确定最佳处理浓度和时间。CCK-8检测结果显示,低浓度CoCl2(100、300μmol/L)处理显著提高hiPSC-CMs细胞活力(p<0.01),高浓度CoCl2(900、1200μmol/L)处理显著抑制hiPSC-CMs细胞活力(p<0.001),并且作用趋势呈剂量和时间依赖性,600μmol/L CoCl2处理对于hiPSC-CMs的细胞活力影响不明显(p<0.05);Hoechst荧光染色结果显示,CoCl2处理24 h和48 h后,低浓度CoCl2处理对细胞无影响,Hoechst染色阳性细胞数量少(p>0.05),高浓度CoCl2处理剂量依赖性增加阳性细胞数量(p<0.0001),且48 h处理组的结果与24 h处理组无显著差异;台盼蓝染色结果表明,CoCl2处理可剂量依赖性促进细胞凋亡;CoCl2处理后,促凋亡相关基因Bax和蛋白Bax表达呈剂量依赖性上调(p<0.001),抗凋亡相关基因Bcl-2和蛋白Bcl-2表达呈剂量依赖性下调(p<0.001);CoCl2处理可剂量依赖性促进hiPSC-CMs细胞的凋亡。通过qRT-PCR检测和Western blot检测确定600μmol/L为最佳处理浓度,24 h为最佳处理时间,证明了该处理条件既不影响hiPSC-CMs细胞活力又可致其缺氧凋亡,建立了氯化钴诱导的hiPSC-CMs体外缺氧模型。论文结果为体外探索缺氧引起的心血管疾病的发病机理和寻找新的治疗靶点与药物提供了可靠的工具。