重组人超氧化物歧化酶包涵体的复性和纯化

当工程菌接种量为3%～5%,菌体密度(D600)达0.4～0.6,并于42℃诱导3～5h时,目的蛋白表达量约为总蛋白的30%。采用透析法使包涵体复性,经金属螯合亲和色谱和凝胶色谱两步纯化后,获得了纯度约为90%、比活力达7300u/(mg蛋白)的重组人超氧化物歧化酶。

人超氧化物歧化酶分子生物学研究进展

人超氧化物歧化酶是一类极有开发前景的药用蛋白。hCu/Zn-SOD为二聚体,主要存在于细胞质,hMn-SOD为四聚体,主要存在于线粒体基质,hEC-SOD也为四聚体,主要存在于分泌液。各种同工酶的分子量、氨基酸序列、基因结构已经研究清楚,并进行了基因克隆和表达。细菌表达产物以包含体形式存在。复性工作复杂而困难。利用真核细胞进行克隆和表达是该酶今后的发展方向。

多发性骨髓瘤病人超氧化物歧化酶和脂质过氧化物的改变及意义

血液系统恶性肿瘤中的自由基O2+损伤作用不容忽视。多发性骨髓瘤（MM）是血液系统恶性肿瘤之一,其红细胞超氧化物歧化酶（SOD）及血浆脂质过氧化物（LPO）的变化尚不清楚。本文用邻苯三酚自氧化法和改良硫代巴比妥酸（TBA）荧光微量法测定了MM初发期、缓解期及复发期病人红细胞SOD活力和血浆LPO含量的变化,其结果对判断疗效、分析疾病转归有实际意义。

重组人超氧化物歧化酶的复性

目的将E .coli以包含体形式表达的重组人超氧化物歧化酶 (rhSOD)恢复天然活性。方法分离包含体 ,用 6mol/L尿素处理 ,透析 ,添加Cu2 + 、Zn2 + ,温浴。结果Cu2 + 、Zn2 + 的加入对于恢复SOD的活性和稳定性是必需的 ,适当提高温度将大大缩短复性时间 ,获得的rhSOD比活可达到 6 0 0 0u/mg以上。结论恢复重组蛋白的天然构型是rhSOD有效结合Cu2 + 、Zn2 +

人超氧化物歧化酶-胸腺素α1融合蛋白在毕赤酵母中的表达与活性检测

为了增强胸腺素α1(Thyα1)的稳定性和免疫功能,采用胸腺素α1与人超氧化物歧化酶(hSOD)融合的策略,构建了6His-hSOD-(G4S)1-Thyα1和6His-hSOD-(G4S)2-Thyα1 2个融合基因,并分别在毕赤酵母中实现了高水平表达.重组表达的融合蛋白经过Ni-NTA亲和层析纯化后,纯度达到80%以上.用邻苯三酚自氧化法和E-玫瑰花法分别测定了人超氧化物歧化酶酶活性和胸腺素活性.结果表明,融合蛋白6His-hSOD-(G4S)1-Thyα1和6His-hSOD-(G4S)2-Thyα1的超氧化物歧化酶比活性分别为120 998±5 206 U/mg和31 279±1 121 U/mg;融合蛋白在1×10-7mol/L浓度下的E玫瑰花结率分别为(38.4±1.6)%和(36.6±0.2)%.结果说明:融合蛋白中由5个氨基酸G4S构成的连接肽能有效地保障2个蛋白质各自的结构特征,使融合蛋白既有超氧化物歧化酶的活性,又具有胸腺素的活性.

人铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的构建人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)原核表达载体并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白,为其临床应用奠定基础。方法根据已报道的hCu,Zn-SOD基因序列,采用RT-PCR技术从外周血单个核细胞(PBMC)中获得SODcDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-Teasy中,重组质粒经酶切,PCR及测序鉴定正确后,将目的片段插入原核表达载体PET20b(+)中并转化大肠杆菌DE3,通过IPTG诱导表达出目的蛋白,经镍固定金属亲和层析纯化。采用邻苯三酚自身氧化法测定SOD生物学活性。结果序列分析表明SOD基因成熟肽编码区含有465bp与GenBank(X02317)中已报道序列一致的SOD核苷酸。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示表达的目的蛋白分子质量约为19kD并与商品化的人SOD单抗呈特异性反应。经Ni2+-NTA琼脂糖纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。可溶蛋白酶活力达1300U/ml。结论在大肠杆菌中获得了人SOD的高效表达,为研究其生物学功能和广泛应用奠定了基础。

重组人超氧化物歧化酶加强一氧化氮吸入治疗幼鼠急性胎粪肺损伤的实验研究

目的 探讨联合应用重组人超氧化物歧化酶 (recombinanthumansuperoxidedismatase ,rhSOD)和一氧化氮吸入 (inhalednitricoxide,iNO)对胎粪诱导幼鼠急性肺损伤的保护作用及可能机制。方法 32只雄性SD幼年大鼠 ,通过气管置管注入 2 0 %胎粪 1ml/kg建立幼鼠胎粪性肺损伤模型 ,随机分为 :( 1)对照组 (Control,C) :暴露于空气中 ;( 2 )NO吸入组 (iNO) :暴露于 2 0× 10 - 6 NO中 ;( 3)rhSOD组 (SOD) ) :rhSOD 2 0mg/kg·ml气管内注入并暴露于空气中 ;( 4 )联合应用 2 0× 10 - 6 NO和 2 0mg/kgrhSOD组 (iNO/SOD) ,暴露 2 4h后观察支气管肺泡灌洗液 (bronchoalveolarlavagefluid ,BALF)细胞数、肺组织匀浆髓过氧化物酶 (myeloperoxidase ,MPO)活性、丙二醛 (malonyldialdehyde,MDA)、一氧化氮 (nitricoxide,NO)含量和肺损伤病理改变。结果 与对照组比较 ,iNO组、SOD组BALF细胞数、MPO活性、肺损伤病理评分下降(P <0 0 5或 0 0 1)、iNO/SOD组较iNO组BALF细胞数、MPO活性进一步降低 (均P <0 0 5 ) ;但肺损伤病理评分差异无显著牲 ;与对照组比较 ,iNO组肺组织MDA、NO含量略有下降 ,但差异无意义 (均P >0 0 5 ) ,SOD组、iNO/SOD组肺组织MDA、NO含量显著下降 (P <0 0 5或 0 0 1) 。

化学渗透法破碎基因重组E.coli提取重组人SOD包含体和复性

以化学渗透法破碎重组大肠杆菌细胞释放重组人超氧化物歧化酶(rhSOD)包含体并对其复性。选择四种化学试剂(Triton X-100、EDTA、NaOH和SDS)对rhSOD重组大肠杆菌细胞进行破碎实验,以SDS-PAGE检测破菌效果,结果0.5%Triton X-100和10 mmol·L-1 EDTA可以较好地破碎重组大肠杆菌细胞,所提取的包含体溶解液纯度与超声法相近,可达65%左右。采用透析法复性包含体,尿素终浓度0.1 mol·L-1时rhSOD包含体复性效果优于1.0 mol·L-1,比活分别为:Triton法2800 U·mg-1,EDTA法3200 U·mg-1,超声法2800 U·mg-1,复性rhSOD纯度达85%左右。本研究建立的用于破碎重组大肠杆菌释放rhSOD包含体的Triton法和EDTA法,包含体复性后比活等于或高于超声法,与机械破菌法相比,简便有效,成本低廉,无需特殊破菌设备,为放大规模破菌提取重组大肠杆菌包含体和复性奠定了实验基础。

人SOD基因的克隆与原核表达

超氧化物歧化酶(SOD)是机体内超氧自由基的天然清除剂,在抗衰老、抗辐射、抗逆境,消炎、抑制肿瘤和癌症,以及自身免疫疾病的治疗方面有很重要的作用。我国目前主要从血液中提取SOD,有关重组人SOD的研究较少。文章通过RT-PCR方法克隆得到人SOD基因,并成功构建其原核表达载体pET-16b-SOD,为通过基因重组技术生产人SOD创造了条件。

重组人SOD1/3转基因山羊的制备及表达产物的检测

设计了以hSOD1、hSOD3为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动增强子构建乳腺特异性表达载体rhSOD1、rhSOD3,共转染母山羊胎儿成纤维细胞,采用PCR和扩增产物序列分析筛选获得SOD1/3克隆细胞株,应用体细胞核移植(SCNT)制备双转基因山羊。出生小羊经PCR和扩增产物序列分析验证是否成功整合外源基因,经Western blotting、ELISA及体外活性检来验证分析表达产物。结果表明:获得SOD1/3转基因山羊胎儿成纤维细胞系6株;原代双转基因体克隆山羊1只(♀);从该转基因羊乳汁中检测到rhSOD1、rhSOD3,浓度分别为:88.81±8.36 mg/L和267.82±12.67 mg/L;转基因羊乳汁中重组人SOD酶活性为1 432±157 U/mL。研究表明,以双载体和单标记基因转染山羊胎儿成纤维细胞可获得双基因整合转基因细胞系,并且以SOD1与SOD3功能基因均可在山羊乳腺中共同表达,表达产物具有较好的生物学活性。

从EDTA处理的重组E.coli中分离纯化重组人SOD包涵体

以金属离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)代替超声法使重组大肠杆菌菌体释放,并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体,纯度为65%。采用透析法复性包涵体,经凝胶色谱纯化后,目的蛋白纯度约为90%,酶比活力为5400u/(mg蛋白)。

含人SOD_2基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定

目的:从人基因组中克隆SOD2基因的启动子并插入到荧光素酶报告基因载体中并进行基因测序鉴定。方法:以人基因组DNA为模板,用PCR的方法扩增出人SOD2基因启动子片段后,将其插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游,将构建的重组质粒通过双酶切片段的凝胶电泳分析和DNA测序以确定插入位置和序列的正确性。结果:双酶切反应和测序结果显示SOD2基因启动子插入的位置和序列是正确的。结论:成功克隆了SOD2基因启动子,为后续SOD2转录调控机制的研究提供重要的实验基础。

丙型肝炎实验诊断进展

丙型肝炎实验诊断进展中日友好医院杨立军综述娄永新审校丙型肝炎过去常称为非甲非乙型肝炎［１，２］主要经血和血制品传播。近年来，由于丙型肝炎引起的输血后肝炎越来越受到重视。丙型肝炎的潜伏期为２～２６周，平均八周。多数患者临床症状较轻，常有单项ＧＰＴ升高，...

重组人SOD工程菌发酵表达条件的优化

采用正交试验优化重组人超氧化物歧化酶工程菌的LB培养基,得到培养基最佳配比(g/L):蛋白胨12,酵母膏5,葡萄糖1和氯化钠10。以此为基础优化基因工程菌发酵条件,确定培养基初始pH 6.5～7.5,装液量20%,菌体密度(D_(600))0.55～1.4,42℃诱导表达2～3 h,目的蛋白相对表达量由优化前的25%提高至41%,绝对表达量是优化前的2.4倍。