人趋化因子受体5N端膜外第一襻的克隆与表达及其特异抗体的制备

目的:获得人β趋化因子受体5(huCCR5)N端膜外第一襻基因片段的序列,并构建表达huCCR5 N端膜外第一襻的重组体,实现其有效表达及其特异抗体的鉴定。方法:计算机分析比较趋化因子超家族部分成员,定位超家族中同源性最低的N端膜外第一襻结构域。PCR扩增出该结构域114个核苷酸序列基因片段,构建融合表达载体pGEX-IN/NR5,经测序确定基因片段正确后,在大肠杆菌中表达。表达产物经纯化后免疫新西兰兔。ELISA鉴定CCR5 N端肽段特异性抗体。结果:序列测定结果与文献报道一致,经计算机作图分析ELISA实验数据证明得到抗huCCR5 N端肽段的特异性抗体。结论:本方法采用pGEX-lN在大肠杆菌DE3中有效表达CCR5 N端膜外第一襻基因片段,并实现了对其特异性抗体的鉴定,为进一步的研究奠定基础。

趋化因子受体CCR5亲合短肽的筛选

趋化因子受体5(CCR5)是HIV-1与宿主细胞结合的辅助因子之一,其功能缺失或被CCR5拮抗剂封闭则会阻止HIV-1感染细胞.为得到与CCR5特异结合的肽类拮抗剂,采用噬菌体展示技术,以稳定表达CCR5的CHO细胞(CHO/CCR5)作为靶标,通过噬菌体随机12肽库筛选与CCR5特异结合的多肽;经过四轮筛选后,挑选20个阳性噬菌体克隆进行测序,从中得到11个含有AFDWTFVPSLIL序列的小分子肽.含该序列的噬菌体能与抗人CCR5单抗(2D7)竞争性结合CCR5,且合成肽AFDWTFVPSLIL对趋化因子RANTES与CHO/CCR5的结合具有明显的抑制作用,初步证明该小肽与CCR5具有特异性结合作用.

人趋化因子受体CCR5胞外片段的融合表达与纯化

目的对人趋化因子受体CCR5的N端胞外部分与第二个胞外环(extracellular loop-2,ECL-2)进行融合表达与纯化。方法分别扩增人趋化因子受体CCR5的胞外N-端部分与ECL-2部分相应的编码序列,通过重叠延伸拼接(Splicing byoverlapping extension,SOE)PCR实现两片段DNA的拼接后(命名为CCR5-N-E2)克隆入质粒pBlueScript M13中,同时构建原核表达载体pET-21b(+)-CCR5-N-E2,转入表达菌株BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白CCR5-N-E2,表达产物通过蛋白免疫印迹进行鉴定,并采用金属螯合层析法对重组表达产物进行纯化。结果经测序,构建的重组原核表达载体与预期完全一致,相对分子质量为8 500的目的蛋白在BL21(DE3)菌株中得到高效表达,表达量约占总蛋白的50%,表达产物以包涵体形式存在。蛋白免疫印迹实验表明该重组蛋白与抗CCR5 N-端序列的单克隆抗体发生特异性结合。通过Ni2+亲和层析,目的蛋白的纯度可达95%以上。结论实现CCR5-N-E2编码序列的拼接、融合蛋白的表达以及纯化,为广泛筛选以CCR5为靶点的临床治疗药物奠定了基础。

缺氧调控人趋化因子受体CCR5启动子区的表达分析

目的:分析人趋化因子受体5(CCR5)基因启动子区序列在缺氧条件下的表达。方法:构建CCR5基因启动子区萤光素酶报告基因载体,转染入MDA-MB-435细胞中,检测分析其双萤光素酶活性。结果:CCR5基因启动子区的pGL3重组质粒在缺氧条件下的MDA-MB-435细胞中能表现出明显的萤光素酶活性。结论:CCR5基因启动区序列中存在缺氧诱导CCR5基因转录的主要上调元件。

变色曲霉素和变色曲霉醇对人趋化因子受体CCR5的抑制作用以及从曲霉科真菌中分离的4个新的变色曲霉素类似物

HIV-1将趋化因子受体（主要为CCR5和CXCR4）作为与CD4共用的受体进攻靶细胞。因而能与CCR5受体结合的分子可防止HIV-1进入细胞，抑制病毒生长。作者发现曲霉科棕黄色泡波曲霉（拟）Emericella aurantiobrunnea提取物能与巨噬细胞炎性蛋白（MIP）-1α竞争性地结合人CCR5受体，因而以生物活性为导向，分离出变色曲霉素（1）、变色曲霉醇（2）和4个新的变色曲霉素衍生物（3～6）。