黄芪甲苷通过抑制PKC/MAPK通路修复损伤人足细胞裂孔膜

目的探讨核苷酸嘌呤霉素对人足细胞的损伤作用及黄芪甲苷的修复作用,并探索PKC/MAPK通路是否参与其中,寻找可能存在的作用机制。方法用CCK-8法筛选合适的核苷酸嘌呤霉素造模浓度及黄芪甲苷的最大无毒浓度,予核苷酸嘌呤霉素刺激人足细胞造成损伤,予不同浓度的黄芪甲苷处理后,应用Western blot法检测nephrin、podocin、PKC、JNK及p38蛋白水平的表达情况。结果核苷酸嘌呤霉素刺激后,nephrin、podocin的蛋白的表达明显降低,而PKC、JNK、p38的表达明显上升,用药后渐趋正常,且呈浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.05),溶剂对照组无明显改变,无统计学差异(P>0.05)。结论核苷酸嘌呤霉素能造成人足细胞裂孔膜损伤,黄芪甲苷对这种损伤有修复作用,而PKC/MAPK通路参与修复过程,同时这种修复作用与黄芪甲苷浓度呈正相关。

骨形成蛋白7能减轻TGF-β1诱导的人足细胞损伤

目的:观察骨形成蛋白(bone morphogenie protein 7,BMP-7)抑制转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的人足细胞转分化作用及其机制研究。方法:构建及鉴定pc DNA 3.1rh BMP-7质粒,体外培养人足细胞,先后予10、20、50、100、200μg/m L重组的BMP-7诱导足细胞,分别在培养24、48、72 h收集细胞,流式细胞试验检测细胞凋亡率,以此选择重组BMP-7最适的刺激浓度和最适的作用时间点。实验分为正常对照组、TGF-β诱导组(TGF-β)及质粒转染组(PEGF-BMP-7),质粒转染组加入重组BMP-7 100μg/m L预处理48 h后,而TGF-β诱导组和PEGF-BMP-7组分别予5 ng/m L TGF-β1处理足细胞后,通过免疫荧光观察足细胞Podocin、α-SMA、VIM的表达变化;收集细胞抽取总RNA和总蛋白,应用RT-PCR和Western blot观察重组BMP-7对人足细胞Podocin、α-SMA、VIM的m RNA和蛋白表达的影响。结果:(1)本实验成功构建pc DNA 3.1rh BMP-7质粒,转染的人足细胞能稳定表达BMP-7,质粒转染组BMP-7蛋白表达水平(0.487±0.012)较正常对照组(0.251±0.012)和TGF-β诱导组(0.151±0.015)明显增高(P<0.001);(2)Real-time PCR检测结果显示TGF-β诱导组足细胞Podocin的m RNA表达水平(0.285±0.013)较正常对照组(1.057±0.090)明显降低(P<0.001),而质粒转染组足细胞Podocin的m RNA表达水平(0.693±0.077)较TGF-β诱导组有升高趋势(P=0.003);TGF-β诱导组和质粒转染组足细胞的α-SMA(1.257±0.039和1.028±0.093)、VIM(1.114±0.097和0.821±0.059)的m RNA表达较正常对照组(0.357±0.089和0.403±0.020)明显升高(P<0.001),质粒转染组足细胞α-SMA和VIM的m RNA较TGF-β诱导组有下降趋势(P=0.011,P=0.002)。Western blot检测结果显示TGF-β诱导组足细胞Podocin的蛋白表达水平(32.923±5.301)较正常对照组(101.807±9.208)明显降低(P<0.001),而质粒转染组足细胞Podocin的蛋白表达水平(90.507±7.810)较TGF-β诱导组有升高趋势(P<0.001);TGF-β诱导组和质粒转染组足细胞的α-SMA(116.120±8.300和93.832±10.602)、VIM(124.016±9.702和100.801±6.801)的蛋白表达较正常对照组(35.730±4.892和43.801±2.600)明显升高(P<0.001),质粒转染组足细胞α-SMA和VIM的蛋白较TGF-β诱导组有下降趋势(P=0.017,P=0.007)。结论:TGF-β1可诱导人足细胞发生转分化,导致其α-SMA、VIM表达增高,Podocin表达减少,BMP-7能显著抑制此现象,提示BMP-7可逆转足细胞EMT,对足细胞损伤具有保护作用。

黄芪对AngⅡ诱导人足细胞分泌Ⅳ胶原的影响

目的:观察AngⅡ对足细胞分泌Ⅳ胶原的影响及中药黄芪的保护作用。方法:用不同浓度的AngⅡ刺激足细胞,观察其对足细胞Ⅳ胶原的影响;并用不同剂量的黄芪注射液干预,运用RT-PCR方法检测足细胞Ⅳ胶原mRNA表达的变化。结果:AngⅡ可以剂量依赖性地刺激足细胞Ⅳ胶原mRNA表达增高,黄芪注射液可以剂量依赖性地降低AngⅡ诱导的足细胞Ⅳ胶原mRNA表达的增高(P<0.05)。结论:黄芪注射液可以通过抑制AngⅡ诱导的足细胞分泌Ⅳ胶原增高而减轻肾小球的损伤。

lncRNA NKILA靶向miR-22-3p调控高糖诱导的人足细胞增殖和凋亡

目的研究核因子(NF)-κB相关长链非编码RNA(lncRNA NKILA)对高糖诱导的人足细胞(HPC)增殖和凋亡的影响及潜在机制。方法将HPC细胞分为正常对照组(NC)、高糖刺激组(HG)、高糖刺激+转染组,NC组用11.1 mmol/L D-葡萄糖处理,HG组用25 mmol/L D-葡萄糖处理,高糖刺激+转染组将细胞转染后进行25 mmol/L D-葡萄糖处理。qRT-PCR检测HPC细胞中lncRNA NKILA和miR-22-3p的含量,Western印迹检测细胞周期蛋白(cyclin)D1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved-caspase)-3、磷酸化(p)-磷脂酰肌酶-3激酶(PI3K)和p-蛋白激酶B(AKT)蛋白表达,流式细胞术测定细胞凋亡率,双荧光素酶报告系统验证lncRNA NKILA与miR-22-3p的关系。结果与NC组相比,HG组的HPC细胞lncRNA NKILA含量及细胞凋亡率显著升高(均P<0.05),miR-22-3p含量及存活率显著降低(均P<0.05);低表达lncRNA NKILA抑制cleaved-caspase-3表达,促进cyclinD1、p-PI3K和p-AKT表达,抑制细胞凋亡,提高细胞存活率;高表达miR-22-3p可提高高糖处理后HPC细胞存活率和cyclinD1含量,降低细胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白含量;lncRNA NKILA靶向结合miR-22-3p,并负调控miR-22-3p的表达;低表达miR-22-3p可部分逆转抑制lncRNA NKILA对HPC增殖和凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响。结论lncRNA NKILA可能靶向miR-22-3p通过PI3K/AKT信号通路调控高糖诱导的HPC细胞凋亡和存活率。

红景天苷通过调控miR-92b-5p对高糖诱导的足细胞损伤的影响

目的探讨红景天苷对高糖(HG)诱导的足细胞损伤的影响及可能机制。方法体外培养小鼠足细胞MPC5,用不同剂量的红景天苷干预HG诱导的MPC5细胞后,CCK-8法检测细胞增殖活性,细胞凋亡经流式细胞术评估,cleaved-caspase-3和Bax蛋白水平经蛋白质印迹法分析,比色法检测细胞中乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性,qRT-PCR法检测细胞中miR-92b-5p表达。转染miR-92b-5p模拟物或抑制剂至MPC5细胞,然后再用红景天苷和(或)HG进行干预,上述相同方法检测细胞增殖活性、凋亡率、cleaved-caspase-3和Bax蛋白表达、LDH漏出量、MDA含量及SOD活性。结果经红景天苷处理,HG诱导的MPC5细胞增殖活性及细胞中SOD活性提高(P<0.05或<0.01),而凋亡率、cleaved-caspase-3和Bax表达、细胞中LDH漏出量及MDA含量降低(P<0.05或<0.01)。同时,红景天苷促进了HG诱导的MPC5细胞中miR-92b-5p表达(P<0.05或<0.01)。经miR-92b-5p mimics转染后,HG处理的MPC5细胞增殖活性及细胞中SOD活性增加(P<0.01),而凋亡率、cleaved-caspase-3和Bax表达、细胞中LDH漏出量及MDA含量减少(P<0.01)。下调miR-92b-5p逆转了红景天苷对HG诱导的MPC5细胞增殖活性、凋亡及氧化应激的影响,P<0.01。结论红景天苷上调miR-92b-5p提高HG诱导的MPC5细胞增殖活性,而抑制细胞凋亡和氧化应激。

人尿源性干细胞条件培养基对高糖诱导足细胞凋亡的影响

目的:通过正常人尿液提取干细胞,探讨尿源干细胞(human urine-derived stem cells,hUSCs)的条件培养基(conditioned medium,CM)对高糖所致人肾脏足细胞损伤的影响。方法:从健康男性尿液提取hUSCs,鉴定后进行体外培养,制备hUSCs-CM;体外培养人肾脏足细胞株,按培养条件不同,分为正常葡萄糖对照组(NG组)、高糖组(HG组)、甘露醇高渗对照组(MA组)及HG+hUSCs-CM不同剂量(1×,5×,10×)干预组,干预24 h后收集细胞,以RT-PCR检测足细胞骨架蛋白synaptopodin的表达;以Annexin V-FITC和PI双染方法,应用流式细胞仪观察各组足细胞的早期凋亡率。结果:HG组足细胞synaptopodin mRNA的表达较NG组降低(P<0.05),HG+hUSCs-CM(1×,5×,10×)组的足细胞synaptopodin mRNA的表达较HG组均增加(P<0.05);HG组足细胞凋亡率较NG组增高(P<0.05),hUSCs-CM干预组较HG组足细胞凋亡率均下降,并和hUSCs-CM具有剂量相关性(P<0.05)。结论:hUSCs-CM对高糖诱导的人足细胞凋亡及损伤具有保护作用。

抗人足细胞蛋白抗体制备新型被动型大鼠膜性肾病模型

目的探讨兔抗人足细胞蛋白抗体诱导新型被动型大鼠肾炎模型的方法及病理特点。方法制备兔抗人足细胞蛋白抗血清，一次性静脉注入大鼠体内建立新型被动型肾炎模型。雄性SD大鼠36只随机被分为6组，每组6只，分别为正常对照组、注射抗血清第7天组、第14天组、第21天组、第28天组和正常兔血清注射组。观察各组大鼠24h尿蛋白量、内生肌酐清除率、血清白蛋白、血肌酐、三酰甘油、胆固醇、尿素氮的变化，并通过光镜、免疫荧光、透射电镜观察大鼠肾脏病理变化。结果注射兔抗人足细胞蛋白抗血清后，24h尿蛋白量逐渐升高，第28天组大鼠尿蛋白量（mg）显著高于正常对照组及正常兔血清注射组（48．56±13．80比5．34±2．77、11．32±4．90，均P〈0．01）；内生肌酐清除率（ml／min）和血肌酐（1μmol／L）在注射抗血清第28天组（0．90±0．47，33．48±9．94）与正常对照组（1．68±0．54，26．03±2．67）差异均有统计学意义（均P〈0．01），但与正常兔血清注射组（1．34±0．87，27．40±4．73）差异无统计学意义；血清白蛋白（g／L）在兔抗血清注射组（28．20±0．87，27．80±1．97，27．42±1．66，27．77±1．95）均低于正常对照组（29．98±0．76）（均P〈0．05），但与正常血清注射组（28．68±1．18）差异无统计学意义；三酰甘油、胆固醇、尿素氮在各组之间差异均无统计学意义（P〉0．05）。大鼠肾脏病理显示，正常对照组及正常兔血清注射组未见明显变化；光镜示注射抗血清第28天组可见少量钉突形成；免疫荧光示注射抗血清后肾小球基底膜上兔IgG沉积强度逐渐减弱，而鼠IgG沉积强度逐渐增强，大鼠C3沉积的强度在第21天时最强；电镜显示注射抗血清后第14天大鼠肾脏逐渐出现免疫复合物的形成，足突融合。结论兔抗人足细胞蛋白抗体诱导的新型膜性肾病大鼠模型制备成功。

虾青素对高糖诱导足细胞损伤的影响

目的利用条件永生型人源足细胞系,探讨虾青素对高糖诱导的足细胞损伤的影响。方法体外培养人肾脏足细胞,按培养条件的不同分为正常葡萄糖浓度组(NG)、高糖组(HG)、高渗组(MA)、高糖+虾青素不同剂量干预组(10-6M,10-5M,10-4M)。干预24h后收集足细胞。用Annexin V/PI双染色法,应用流式细胞仪检测虾青素对足细胞凋亡的影响。并采用物理离心的方法检测虾青素对足细胞粘附力的作用。结果 HG组足细胞早期凋亡率较NG组增高[(7.7±0.9)%vs.(2.7±0.74)%,P=0.000],不同剂量虾青素干预组较HG组足细胞早期凋亡率均下降[(5.7±1.0)%,P=0.017;(5.2±0.7)%,P=0.006;(4.3±0.9)%,P=0.001],并呈剂量依赖性。高剂量的虾青素可以缓解高糖诱导的足细胞粘附力的降低[(67.2±4.3)%vs.(37.9±9)%,P=0.017]。结论虾青素对高糖诱导的人足细胞早期凋亡和粘附功能有保护作用。

高糖刺激对人足细胞miR-34a和相关蛋白表达的影响

目的探讨高糖刺激对人足细胞miR-34a以及Notch信号通路相关基因表达的影响。方法以分化成熟的人足细胞作为研究对象,采用25mM D-葡萄糖分别作用24h、48h、72h,另外将miR-34a mimics转染至HPC细胞,采用流式细胞术检测高糖刺激对HPC细胞凋亡的影响;采用qRT-PCR和western blot法检测高糖刺激以及miR-34a对HPC细胞Notch1、Jagged1和NICD1基因和蛋白表达的影响。结果高糖刺激HPC细胞的凋亡率明显高于空白对照组(P<0.05);且随着作用时间的延长,HPC细胞凋亡率逐渐增加;而miR-34a mimics转染组细胞凋亡率与对照组细胞比较无明显差异, P>0.05。经高糖(25mM)作用于HPC细胞48h后,miR-34a表达量明显降低,而Notch1、Jagged1、NICD1基因和蛋白的表达量明显上调,与空白对照组细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05);而转染miR-34a mimics后,HPC细胞Notch1、Jagged1、NICD1基因和蛋白表达量明显低于空白对照组和高糖作用细胞(P<0.05)。结论高糖刺激促使足细胞miR-34a表达下调,从而促使Notch信号通路的激活,诱导足细胞损伤作用.

磷脂酶A2受体抗体与特发性膜性肾病的研究进展

近年来大量研究发现人足细胞膜上表达的磷脂酶A2受体（receptor for phospholipaseA2,PLA2R）是特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy,IMN）的靶抗原[1-3]。据报道,70%的IMN患者血清中可以检测出抗PLA2R的自身抗体,且PLA2R增长幅度与患者尿蛋白水平呈正相关。

益气活血利水法联合雷公藤多苷治疗膜性肾病疗效及对PCX表达的影响

目的观察益气活血利水法联合雷公藤多苷治疗膜性肾病疗效及对人足细胞标志蛋白(PCX)表达的影响。方法将100例膜性肾病患者随机分为对照组50例与观察组50例,对照组给予醋酸泼尼松单用治疗,观察组在对照组治疗基础上加用益气活血利水中药+雷公藤多苷治疗,观察2组疗效、治疗前后尿液PCX、24 h尿蛋白定量、三酰甘油、中医症状积分及不良反应发生情况。结果观察组治疗总有效率显著高于对照组(P<0.05);观察组治疗后尿液PCX水平、24 h尿蛋白定量、三酰甘油及中医症状积分均显著低于对照组(P均<0.05);2组不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论益气活血利水法联合雷公藤多苷治疗膜性肾病可有效缓解相关症状体征,减少尿蛋白量,调节PCX和三酰甘油水平,且安全性值得肯定。