抗人载脂蛋白6单链抗体的筛选、制备及活性鉴定

目的:筛选特异性抗人载脂蛋白6单链抗体(anti-hLCN6 scFv),并进行表达纯化和活性鉴定。方法:采用RT-PCR技术,用抗体可变区简并引物,从hLCN6免疫小鼠的淋巴细胞中扩增全套V_H和V_L基因,装配成scFv基因后将其克隆到噬菌体载体pFAB5C中,构建scFv噬菌体抗体库。对抗体库进行4轮富集,筛选抗hLCN6阳性scFv。经原核表达纯化后,用Western blot和间接ELISA对其活性进行鉴定。结果:筛选到2株亲和力较高的阳性克隆,测序表明其序列一致。获得了高纯度的scFv抗体,其对抗原具有良好的亲和力和特异性。结论:成功筛选到特异性抗hLCN6 scFv,为利用该抗体进行混合斑中的精子分离奠定了基础。

人载脂蛋白6特异性核酸适配体的筛选与鉴定

建立一种简单、高效的从混合斑中鉴定和分离精子的方法是法医学急需解决的难题之一。针对精细胞膜表面特定蛋白质开发的核酸适配体系统,可用于混合斑中精子的分离纯化。人载脂蛋白6(hLCN6)是一种附睾分泌蛋白质,它能结合到精子的头部和尾部,与精子成熟有关。利用指数富集配基的系统进化技术,以hLCN6蛋白为靶标,从96 nt单链DNA随机文库中筛选出与hLCN6高亲和力和特异性结合的适配体。经15轮正向筛选和3轮反向筛选。通过测序分析,采用酶联寡核苷酸吸附实验、斑点印迹和细胞免疫荧光染色等方法检测,获得的核酸适配体H2可特异性识别并结合hLCN6蛋白。hLCN6解离常数(Kd)为(3.21±0.75)nmol/L,且适配体H2在体外表现出与人精子较高的亲和力与特异性。这为依据核酸-蛋白质相互作用分离混合斑中的精细胞奠定了理论基础,提供了新思路。