重组全长人釉原蛋白对人成纤维细胞黏附、增殖、迁移的影响

目的：比较重组25kDa全长人釉原蛋白（recombinanthumanamelogenin，rhAm）和提取的猪釉基质蛋白（enamelmatrixproteins，EMPs）对人牙周膜成纤维细胞（humanperiodontalligamentfibroblasts．HPDLF）和人包皮成纤维细胞（foreskinfibroblasts，HFF）生物学特性的影响，初步探讨rhAm促进牙周组织再生的可能机制。方法：选择BL21／pET28a—His—SUMO—rhAm表达系统，在适宜的条件下，经诱导表达和酶切纯化．得到25kDa全长rhAm．采用SDS—PAGE和Western印迹鉴定，乙酸法提纯EMPs。体外培养HPDLF和HFF．采用不同浓度的rhAm和EMPs分别刺激HPDLF、HFF，观察并比较2种蛋白对细胞黏附、增殖和迁移能力的影响。采用SAS5．0软件包对数据进行统计学分析。结果：10—20μg／mLrhAm能显著促进人牙周膜成纤维细胞和人包皮成纤维细胞的黏附、增殖和迁移（P〈0．05），其作用效果与200μg／mLEMPs相似（P〉0．05）。结论：25kDarhAm和EMPs对成纤维细胞具有相似的生物学作用。rhAm和EMPs可通过增强牙周膜成纤维细胞的生物学活性．从而促进牙周组织再生。

人釉原蛋白基因的扩增及其真核表达克隆的构建

目的 构建人釉原蛋白基因真核表达克隆。方法 从胚龄 2 0周的引产胎儿牙胚中提取总 RNA,RT- PCR法扩增人釉原蛋白编码区基因 ,重组到真核表达载体 Pc DNA3.1中 ,经酶切和 DNA序列分析验证。结果经 RT- PCR扩增后 ,得到大小约 5 70 bp的特异性产物 ,与预期的人釉原蛋白 m RNA编码区碱基长度一致 ,重组克隆 Pc DNA3.1- AMG的测序结果显示 ,与 Gen Bank中的人釉原蛋白基因 (AMEL X)序列仅在第 4 85位碱基发生错配 (G→ C) ,但不影响氨基酸组成。结论 本研究成功的构建了人釉原蛋白基因真核表达克隆 ,为进一步研究牙周组织再生的基因治疗奠定了基础。

人釉原蛋白编码区基因真核表达载体PsecTaq2A-AMG的构建

目的 构建人釉原蛋白 (AMG)编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。方法 采用PCR技术体外扩增AMG完整分泌肽编码区。将扩增产物与PsecTaq2A分别用BamHI和XholI行双酶切 ,将获取的AMG目的基因片段连接到双酶切后的PsecTaq2A ,构建重组质粒PsecTaq2A_AMG ,并对重组质粒进行鉴定。结果 ①PCR扩增产物经 1 5 %琼脂糖凝胶电泳 ,可见大小约 5 19bp的特异性条带 ,与预期结果一致。②重组克隆PsecTaq2A_AMG酶谱分析与预期结果一致 ,序列测定结果与GenBank中的人釉原蛋白序列完全一致。结论 用此方法可成功构建AMG编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm。经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别。结论成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm。大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础。

人釉原蛋白编码区基因原核表达载体的构建

目的:构建人釉原蛋白(amelogenin,AMG)成熟肽编码区基因的原核表达载体。方法:运用TA克隆技术,将AMG基因片断插入质粒pMD 18-T,通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,T4 DNA连接酶连接目的基因AMG与原核表达质粒pGEX-4T-1,最终获得重组原核表达载体pGEX-4T-1/AMG。结果:对重组质粒pMD 18-T/AMG和pGEX-4T-1/AMG进行酶切和测序鉴定,酶切电泳图和测序结果与预期结果一致。结论:成功构建了人釉原蛋白(AMG)成熟肽编码区基因的原核表达载体。

重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。

人釉原蛋白基因在大肠杆菌中的融合表达

目的建立人釉原蛋白(AMG)成熟肽基因在大肠杆菌中融合表达和纯化的技术路线。方法利用已构建并经鉴定的重组质粒pGEX-4T-1/AMG转化大肠杆菌BL21,分别对诱导时间、异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)浓度和诱导温度进行优化,在最佳诱导表达条件下,分别对菌液上清、周质、胞质和包涵体中的目的蛋白表达进行分析,在可溶性蛋白中发现大量目的蛋白,随后利用GSTrapFF亲和层析柱进行人AMG融合蛋白的过柱纯化。结果pGEX-4T-1/AMG重组质粒的双酶切凝胶电泳鉴定结果和测序鉴定结果和预期一致。最佳诱导时间为14.5h、最佳诱导剂浓度为1.0mmol/L、最佳诱导温度为20℃,在此条件下目的蛋白的表达量达到峰值。在最佳诱导条件下,胞质蛋白和包涵体中都有大量的目的蛋白。提取大量胞质蛋白,经GSTrapFF亲和层析柱纯化,收集纯化液,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,显示成功纯化了AMG融合蛋白,在提取液洗涤2次后,可获得高纯度的融合蛋白。结论利用pGEX-4T-1/AMG原核表达体系成功获得纯化的人AMG融合蛋白。

人釉原蛋白重组质粒Psec Taq2A-AMG在人牙龈成纤维细胞表达的研究

目的 研究釉原蛋白重组质粒PsecTaq2A -AMG在人牙龈成纤维细胞 (GFB)中的表达 ,为牙周再生的基因治疗奠定基础。方法 采用酶解 -组织块法体外培养得到人牙龈成纤维细胞 ,用釉原蛋白重组质粒PsecTaq2A-AMG瞬时转染牙龈成纤维细胞 ,分别在第 4 8小时、第 5天、第 7天、第 14天收集细胞及细胞液 ,经ELISA连续测定釉原蛋白的表达。结果 转染后 4 8小时即检测到表达产物 ,表达量在第 5天和第 7天达到高峰 ,持续到第 14天仍可检测到釉原蛋白的表达。结论 实验结果为利用牙龈成纤维细胞为靶细胞 。

炎症微环境下重组人釉原蛋白对人牙周膜成纤维细胞炎症因子表达的影响

目的观察在炎症微环境下,重组人釉原蛋白(rhAm)对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(hPDLCs)炎症因子表达的影响。方法体外培养hPDLCs,采用免疫组织化学染色法鉴定hPDLCs。用10μg/m L牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)脂多糖(LPS)模拟炎症微环境,选取20μg/m L rhAm作用于hPDLCs,运用实时荧光定量PCR和ELISA技术检测炎症因子白介素(IL)-1β、IL-6和IL-8的表达。结果免疫组织化学染色结果证实,培养细胞为hPDLCs。在所检测的4个时间点(6、12、24、72 h),10μg/m L P.gingivalis LPS均可诱导IL-1β、IL-6和IL-8的表达;加入20μg/mL rhAm后,各因子表达均有所降低。结论 rhAm可以抑制炎症微环境下h PDLCs炎症因子的表达。

重组人釉原蛋白促进人脐静脉内皮细胞成血管分化作用的研究

目的 观察重组人釉原蛋白(recombinant human amelogenin, rhAm)对体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)成血管作用的影响。方法 体外培养HUVEC,分别将浓度为0.1、10.0、50.0、100.0μg/mL的rhAm作用于细胞,与对照组比较,采用MTT法观察HUVEC增殖,通过划痕实验观察HUVEC迁移,运用实时定量PCR和免疫印迹检测rhAm对HUVEC表达成血管相关基因及膜蛋白的影响,经由体外小管生成实验观察HUVEC小管样结构。结果 MTT结果显示,0.1μg/mL和10.0μg/mL rhAm可促进HUVEC的增殖(P<0.05),100.0μg/mL rhAm出现抑制HUVEC增殖的现象(P<0.01);划痕实验结果显示,10.0μg/mL rhAm可促进HUVEC迁移(P<0.05);实时定量PCR结果显示,10.0μg/mL rhAm可上调细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)(P<0.01)和E选择素(E-selectin)(P<0.05)的mRNA表达,血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)-1、VEGFR-2 mRNA表达有上调趋势但不存在统计学差异;免疫印迹实验结果显示,10μg/mL rhAm可上调ICAM-1(P<0.01)的蛋白表达,E-selectin、VEGFR-1和VEGFR-2的蛋白表达有上调趋势但不存在统计学差异;体外小管生成实验显示,10μg/mL rhAm可诱导HUVEC排列成小管样结构。结论 低浓度的rhAm能促进HUVEC的增殖及迁移和成血管相关基因及蛋白的表达,诱导小管样结构生成,提示rhAm在牙周组织再生过程中可能存在成血管作用。

人釉原蛋白全长及其功能片段的体外自组装和矿化行为的研究

目的探讨人釉原蛋白(AM)全长及其N端酪氨酸富集段(TRAP)、C端亮氨酸富集段(LRAP)体外自组装的动态过程及其在羟磷灰石(HA)晶体形成中的作用。方法体外重组、纯化人AM全长及其功能片段TRAP、LRAP,在三氨基甲烷(Tris-HCl)中配制成100μg·mL^(-1)、pH=8的蛋白溶液,室温孵育1~15 min,透射电镜(TEM)下观察比较AM全长、TARP和LRAP的自组装行为;在人工唾液中加入AM全长孵育3 d,扫描电镜(SEM)观察诱导形成的新生晶体形貌,继续加入TARP和LRAP孵育3 d后再次观察。结果pH为8时,人AM全长及TRAP自发启动组装,15 min后均可形成“纳米球”结构,其中TRAP形成的“纳米球”孤立存在,大小均匀,没有明显内部结构;而AM全长分级组装,形成“纳米球”后进一步各向延伸趋势,形成链状结构,随后聚集成网;LRAP的自组装行为不明显,蛋白多以单体形式存在,无“纳米球”生成,仅可见少量低聚物。AM全长诱导3 d后形成棒状HA晶体,加入TRAP和LRAP蛋白继续诱导3 d后晶体在c轴明显伸长,而a、b平面生长欠佳。结论人AM全长、TRAP和LRAP的自组装和矿化行为与体内HA晶体定向生长的机制契合,为它们在HA晶体生长、成熟过程中的作用提供了理论依据。

新型温敏性重组人釉原蛋白载体与传统丙二醇藻酸酯载体的体外测试效外测试效果比较

目的评价新型温敏性重组人釉原蛋白(rhAm)载体和传统丙二醇藻酸酯(PGA)载体的体外表征和对人牙周膜成纤维细胞活性的影响。方法分别利用3.3%PGA与rhAm混合制备PGA-rhAm,2%的壳聚糖(CS)和rhAm混合并使用质量分数60%的β-甘油磷酸钠溶液(βGP)作为交联剂制备CS-βGP-rhAm凝胶;表征通过检测黏度、凝固时间、pH值、溶胀率、体外生物降解率和缓释性能来评估;通过观察金黄色葡萄球菌生长状况比较材料的抗菌效果;生物相容性评估是在人牙周膜成纤维细胞(hPDLFs)上利用CCK8检测各组细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,RT-qPCR检测成骨基因mRNA表达,Westernblot检测蛋白的表达水平,碱性磷酸酶(ALP)染色检测各组细胞成骨分化情况。结果PGA-rhAm具有黏度值3.262±0.055 Pa.s,CS-βGP-rhAm在37℃下具有6 min凝固成型能力、接近口腔环境的pH值、约90%的溶胀率,同时缓释rhAm可维持2周以上,自身降解时间维持3周以上。CS-βGP负载rhAm相比PGA负载rhAm更有效抑制金黄色葡萄球菌生长(P<0.001)。细胞水平上,CS-βGP是否负载rhAm都可促进细胞增殖(P<0.001),PGA促进细胞增殖效果不显著。划痕实验显示,CS-βGP和PGA负载rhAm后均可促进细胞迁移(P<0.01)。RT-qPCR和Westernblot结果显示,CS-βGP负载rhAm能促进RUNX2、OCN mRNA水平(P<0.001),上调Ki67(P<0.001)、RUNX2(P<0.001)、CollagenⅠ(P<0.01)、β-catenin(P<0.05)蛋白表达。PGA负载rhAm促进RUNX2(P<0.05)、OCN(P<0.01)mRNA水平表达,蛋白水平变化无统计学意义。CS-βGP组ALP染色蓝紫色颗粒数增加,PGA组无明显变化。结论CS-βGP具有能缓释rhAm的性能,同时相比传统的PGA载体,CS-βGP具有温度成型的特点、抑制金黄色葡萄球菌生长的性能、显著提高hPDLFs的生物活性并且负载rhAm后不影响其生物活性。

人釉原蛋白成熟肽基因的原核表达和纯化

目的 建立人釉原蛋白（amelogenin，AMG）成熟肽基因原核表达和纯化的技术路线，获得纯化的人AMG成熟肽蛋白，以期为牙周炎的基础治疗提供依据。方法通过已构建并经鉴定的重组质粒pGEX-4T-1-AMG，转化B[21大肠杆菌，原核表达后利用谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白纯化系统（glutathioneS-transfe Fasefusion protein purificationsystem，GSTrapFF）亲和层析柱进行重组人AMG的纯化。结果十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳图和蛋白质印迹法分析结果显示，获得纯化的相对分子质量为45000大小GST—AMG融合蛋白和19000大小的目的蛋白AMG。结论利用pGEX-4T-1-AMG-BL21体系成功获得了人AMG成熟肽基因在大肠杆菌中的原核表达和纯化。

通过真核细胞表达系统获得重组人釉原蛋白

目的构建重组人釉原蛋白基因的真核表达系统,并建立稳定表达该蛋白的细胞系。方法取26周龄引产胎儿的牙胚组织,提取总RNA,用RT-PCR技术扩增釉原蛋白基因片段,插入中间表达载体pGEM!-T。经双酶切后,再与真核表达载体pcDNA3.1TM/myc-His(-)B相连接,构成最终的表达质粒,将该重组表达质粒转染至HEK293A细胞,用G418筛选出阳性细胞克隆,并建立稳定表达釉原蛋白的细胞系。结果通过测序表明,人釉原蛋白基因被成功地连接到了真核表达载体上。将该表达系统转染HEK293A细胞后,进行Western Blot检测,证明有相对分子质量约32000的釉原蛋白表达。结论本实验成功构建了重组人釉原蛋白真核表达系统,建立了稳定细胞系,为获得高纯度的釉蛋白,进一步研究蛋白质功能奠定了基础。

口腔组织病理学

矿化胶原复合物引导组织再生膜体外性能测试;雌激素对大鼠骨髓基质细胞增殖和分化的影响;人釉原蛋白重组质粒PseeTaq2AAMG在COS-1细胞系中表达;人牙源性间充质细胞构建牙本质-牙髓复合体样结构的实验研究;