人野生型parkin基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的 克隆人野生型parkin基因并构建真核表达载体pCDNA3.1 parkin ,将重组质粒转染PC12细胞获得高表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆。 方法 从胎脑组织中提取总RNA ,用RT PCR方法获得人野生型 parkin基因的全长cDNA ,插入 pCR2 .1 TA克隆载体中进行序列测定 ,测序正确后将其亚克隆至表达载体pCDNA3.1,利用脂质体将重组质粒转染PC12细胞 ,经G4 18筛选获得抗性细胞克隆 ,采用RT PCR和WesternBlot方法鉴定人野生型 parkin基因在PC12细胞中的过表达。 结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒 ,RT PCR和WesternBlot证明经G4 18筛选得到的转基因PC12细胞克隆中存在人野生型 parkin基因的表达。结论 成功构建了人野生型 parkin基因的真核表达载体 ,获得了稳定表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆 ,为进一步研究parkin的生物学功能以及parkin在帕金森病发病机制中的作用奠定了良好的基础。

人野生型p53基因增强5-FU对大肠癌化疗敏感性的分子生物学机制

为了探讨人野生型p53(wt-p53)基因增强大肠癌细胞化疗敏感性的分子生物学机制,将携带wt-p53基因的质粒分别转染两种p53基因突变的人大肠癌细胞系HT-29及SW620,分析细胞中p53及细胞周期蛋白D1(cyclinD1)蛋白的表达水平;将化疗药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)以不同浓度、不同时间分别作用于HT-29及SW620细胞,另外将已转染wt-p53基因的大肠癌细胞用5-FU进行诱导,Western印迹分析上述干预条件下细胞中p53蛋白及细胞周期蛋白D1表达水平的变化;流式细胞术检测wt-p53基因联合5-FU组及对照组中细胞凋亡的改变情况.结果表明,wt-p53基因能增加癌细胞中细胞周期蛋白D1的表达,与wt-p53基因呈剂量依赖性关系;5-FU则降低其蛋白表达,与5-FU呈时间和剂量依赖性关系,而5-FU所致的细胞周期蛋白D1表达水平的降低在细胞预先转染了wt-p53基因时会被抑制;wt-p53基因与5-FU联合使用能提高大肠癌细胞凋亡率.结果提示,wt-p53基因可提高大肠癌细胞中细胞周期蛋白D1的表达水平,并抑制5-FU所致的细胞周期蛋白D1降解,从而提高大肠癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性.

人野生型p53肿瘤抑制基因在烟草中的遗传转化

目的:构建人野生型p53肿瘤抑制基因的植物表达载体,并建立p53转基因烟草植株.方法:将人野生型p53肿瘤抑制基因编码区克隆于pUC19,pBI426和pCAMBIA2301载体,构建含人野生型p53基因的植物表达载体pCAM-BIA2301/p53,p53基因由2×CaMV35S启动子控制表达.利用叶盘共培养法经根瘤农杆菌EHA105介导转化烟草,获得转基因烟草植株;用组织化学法,PCR、Southern杂交检测转基因烟草植株.结果:经组织化学法,PCR,Southern杂交检测表明人野生型p53基因已整合到转基因烟草植株的基因组中,并获得了的转p53基因烟草植株.结论:成功建立了含人野生型p53基因的转基因烟草植株,为进一步检测p53基因的生物活性和开辟生产药用蛋白的新途径奠定了基础.

人野生型S100A10原核表达载体的构建、蛋白表达纯化及鉴定

S100A10又被称为p11,属于S100家族成员,是一种钙离子结合蛋白,在细胞内外发挥多种功能与膜联蛋白A2(ANXA2)形成异源四聚体AIIt中被发现。在生理状态下AIIt定位在细胞的内膜及外膜上,其中外膜上的AIIt为纤溶酶原(plasminogen)和组织纤溶酶原激活剂(tPA)提供锚定位点,是调控肿瘤细胞迁移与转移的关键蛋白复合体,被认为是肿瘤治疗的一个潜在靶点。

重组人野生型P53融合蛋白的克隆表达和对肿瘤细胞的作用

目的通过基因重组改善P53蛋白的功能，并研究它对肿瘤细胞的作用。方法构建人野生型P53(wtP53)融合蛋白的原核细胞表达载体PGEX-3X—PTD—P53，诱导表达和亲和层析纯化后，采用MTT法和流式细胞仪检测它对肿瘤细胞的增殖抑制作用和促细胞凋亡。结果成功构建P53融合蛋白的原核细胞表达载体PGEX-3X—PTD—P53，通过诱导表达和纯化获得重组人wtP53融合蛋白。MTT法和细胞流式分析证明该蛋白对几种癌细胞有明显的增殖抑制作用和促细胞凋亡。结论这种原核细胞表达的重组人wtP53融合蛋白保留了wtP53蛋白的生物学性状。

外源性人野生型p53基因转染导致兔动脉硬化斑块的不稳定性

目的 建立动脉粥样硬化不稳定性斑块的动物模型。方法 6 4只雄性纯种新西兰大白兔随机分成A组 (5 4只 )与B组 (1 0只 ) ,A组用球囊损伤腹主动脉 +高脂喂养 1 0周 ,B组仅给予高脂喂养 1 0周。于 8周末将A组随机分为A1和A2两个亚组 ,在腹主动脉斑块形成处分别转染携带人野生型 p5 3基因或LacZ基因的重组腺病毒载体 ,2周后A1 (p5 3基因 )和A2 (LacZ基因 )组各处死1 0只 ,观察斑块自发破裂情况。分别给予余下的兔中国斑点蝰蛇毒 (CRVV)和组胺药物触发斑块破裂 ,然后将兔处死取出腹主动脉进行病理学及免疫组化检查。实验开始及处死前进行血脂检查。结果 A1组转染 p5 3阳性细胞数比其他两组明显增加 (分别为 32 4 %± 1 0 2 %,1 5 8%± 3 6 %,1 6 2 %± 6 7%,P均 <0 0 0 1 ) ,细胞凋亡率明显高于其他两组 (分别为 2 5 %± 0 8%,1 0 %±0 3%,0 9%± 0 4 %,P均 <0 0 1 ) ,斑块纤维帽显著变薄 (P <0 0 5 ) ,血管平滑肌细胞减少 ,巨噬细胞聚集 ,药物触发后有 1 2只共 2 0处发生斑块破裂及血栓形成 ,A2组中 ,药物触发后仅 5只 7处发生斑块破裂。B组未见斑块破裂及血栓形成。结论 应用外源性人野生型p5 3基因转染动脉硬化兔可导致斑块的不稳定性 。

野生型p53基因抑制人结肠癌细胞的体内抑瘤效应观察

目的研究人野生型p53基因对人结肠癌SW1116细胞生长的影响。方法采用电穿孔法将正向携带有野生型p53基因cDNA的重组反转录病毒质粒导入有p53基因突变的人结肠腺癌SW1116细胞,筛选带外源p53基因的G418抗药性SW1116细胞克隆,对其进行生长速度、软琼脂集落形成及裸鼠成瘤等方面的检测,分析其生物学特性变化。结果导入人野生型p53基因使人结肠腺癌SW1116细胞的生长速度明显减慢(P<0.05或0.01)、软琼脂集落数量明显较对照组减少(P<0.05或0.01),移植瘤体积较对照组明显小(P<0.05)。结论人野生型p53基因对人结肠腺癌SW1116细胞有明确的抑瘤效应。

野生型和C279G突变型UCHL1基因真核表达质粒构建

目的构建人野生型和C279G突变型pEGFP-N1-UCHL1质粒。方法采用RT-PCR方法从人胚脑组织中扩增出人泛素羧基末端水解酶1(UCHL1)基因,插入至pMD18Tvector中;再采用SOE法定点突变,通过酶切和连接,构建野生型和C279G突变型pEGFP-N1UCHL1。结果酶切和DNA测序证实,野生型和突变型UCHL1基因分别插入到pEGFP-N1中,野生型UCHL1基因序列与GenBank完全一致,C279G突变型UCHL1基因除第279位碱基C被G替代以外,其余序列与野生型完全一致。结论成功构建野生型和C279G突变型UCHL1基因真核表达质粒。

野生型p53基因重组质粒的构建及其体外抑瘤作用

重组体，用电穿孔方法将其导入有ｐ５３基因突变的人肠癌ＳＷ１１１６细胞，通过标记基因ＮｅｏＲ筛选带外源ｐ５３基因的Ｇ４１８抗药性克隆，以观察抗药性克隆数量，同时对Ｇ４１８抗药性细胞的生长速度及细胞增殖周期进行观察，结果表明：导入ＷＴ—ｐ５３基因能使肠癌ＳＷ１１１６细胞的Ｇ４１８抗药性克隆形成减少，细胞生长速度较对照细胞明显减慢，细胞增殖周期Ｇ１期增加、Ｓ期下降。这些结果证明人野生型ｐ５３基因能抑制肠癌细胞的生长。本研究为大肠癌ＷＴ—ｐ５３实验性基因治疗提供了理论依据，说明基于恢复ｐ５３肿瘤抑制基因功能的基因治疗在治疗结直肠癌方面有着广阔的应用前景。

野生型P53基因对人肠癌细胞株的抑瘤效应

为了探讨野生型P53基因对人肠癌细胞株的抑瘤效应。用电穿孔方法将正向携带有野生型P53基因cDNA全长的反转录病毒重组质粒(Dol p53)导入有P53基因突变的人肠癌SW1116细胞,通过标记基因NeoR筛选带外源P53基因的G418抗药性克隆,以观察抗药性克隆数量,同时对G418抗性细胞的生长速度及细胞增殖周期等方面进行观察,结果表明:导入WT-P53基因能使肠癌SW1116细胞的G418抗药性克隆形成减少,细胞生长速度较对照细胞明显减慢,细胞增殖周期G1期增加、S期下降。结果证明人野生型P53基因对肠癌细胞有明确的抑瘤效应,说明基于恢复P53肿瘤抑制基因功能的基因治疗在治疗结直肠癌方面有广阔应用前景。

欧盟批准帕尼单抗治疗结肠直肠癌新适应证

近日，欧盟委员会批准帕尼单抗（Panitumumab，Vectibix）的新适应证，即许可其作为一线药物与基于伊立替康的FOLFIRI方案联合用于成人野生型（wT）RAS转移性结肠直肠癌（mCRC）治疗。约半数mCRC患者属于WTRAS。