Anoctamin家族中钙激活氯离子通道调节剂筛选及应用研究进展

钙激活氯离子通道(CaCC)是一类能通过胞内钙离子激活转运氯离子的通道蛋白,其主要在神经元和肌细胞中参与调节膜电位、细胞内钙平衡和细胞兴奋性等重要的生理作用。Anoctamin(Ano)家族中Ano1是最经典的CaCC,Ano1的靶向调节剂对癌症、囊性纤维化、高血压、腹泻和哮喘等疾病具有潜在治疗作用。自2008年Ano1首次被发现后,先后出现了多种CaCC特异性调节剂的筛选方法,主要包括基于荧光蛋白的高通量初级筛选、电生理膜片钳技术和虚拟筛选,进而发现了多种药理学作用不同的小分子调节剂。本文综述了目前较为主流的筛选方法的原理和优缺点,并对迄今发现的Ano1特异性调节剂的化学结构和潜在的应用进展进行综述。

人钙离子激活的氯离子通道的结构与功能

钙离子激活的氯离子通道(CLCA)是一种新型的氯离子通道,广泛分布于分泌型上皮组织中,介导一系列重要的病理生理功能。先后在牛、鼠、人和猪4个种属中发现,每一个CLCA家族成员在不同种属中有不同的表达部位和特定的功能。该文就4种人钙离子激活的氯离子通道—hCLCA1、hCLCA2、hCLCA3和hCLCA4进行综述,介绍结构和组织分布特点,简述在气道黏液高分泌、支气管哮喘、肺囊性纤维化、细胞周期控制、肿瘤发生发展、平滑肌收缩和视网膜病中的作用。

ERK1/2通路在低氧上调大鼠PASMCs钙激活性氯离子通道表达的作用

目的:探讨钙激活性氯离子通道(CLCA2)在大鼠低氧性肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)中m RNA和蛋白表达的变化及其与ERK1/2信号通路的关系。方法:PASMCs随机分为:常氧组(N组),低氧组(H组),DMSO对照组(D组),U0126干预组(U组),Staurosporine aglycone干预组(SA组),采用免疫印迹法检测CLCA2蛋白的表达;选用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定CLCA2 m RNA水平的表达。结果:PASMCs中CLCA2m RNA和蛋白的表达量,H组较N组明显上调(P<0.01);U组较D组明显上调(P<0.01);SA组较D组m RNA的表达显著下调(P<0.01),蛋白的表达轻微下调。结论:低氧可上调CLCA2中m RNA和蛋白在PASMCs的表达;ERK1/2通路激活剂-Staurosporine aglycone能下调CLCA2在PASMCs中m RNA和蛋白的表达量;ERK1/2通路抑制剂-U0126可上调CLCA2在PASMCs中m RNA和蛋白的表达量。

钙离子激活的氯离子通道蛋白TMEM16A在女性生殖系统中的研究进展

作为钙离子激活的氯离子通道(Ca CCs)分子基础的跨膜蛋白16A(TMEM16A)分布于人体多种组织器官中,对许多生理和病理过程具有重要意义。近年来,对TMEM16A在女性生殖系统中分布和作用的研究逐渐增多,比如参与子宫平滑肌的收缩、影响卵巢颗粒细胞雌激素的合成以及调节卵母细胞的形态等,这些都提示了TMEM16A在女性生殖系统中的生理重要性。现本文将就TMEM16A在女性生殖系统各方面的最新研究进展进行综述。

人钙离子激活的氯离子通道在慢性鼻窦炎鼻窦黏膜中表达的研究

目的观察人钙离子激活的氯离子通道1(hCLCA1)在慢性鼻窦炎筛窦黏膜中的表达,探讨其在慢性鼻窦炎发病机制中的作用。方法取慢性鼻窦炎患者筛窦黏膜10例,另取10例正常筛窦黏膜作为对照。应用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组鼻窦黏膜中hCLCA1mRNA的表达,应用免疫荧光方法观察hCLCA1蛋白在各组鼻窦黏膜中的表达,比较hCLCA1mRNA及蛋白在各组中的表达情况。结果 hCLCA1表达于鼻窦黏膜上皮的杯状细胞。慢性鼻窦炎组hCLCA1mRNA表达水平及阳性细胞面积比(51.6%±4.5%)高于对照组(7.2%±5.1%),差异有统计学意义(P<0.01)。结论在基因和蛋白水平上,hCLCA1在慢性鼻窦炎鼻窦黏膜中均有明显表达,其在慢性鼻窦炎的发病机制中可能具有重要作用,可能与上皮杯状细胞的增生及黏液高分泌有关。

基于钙激活氯离子通道的Piezo1通道调节剂高通量筛选模型的构建

目的构建基于钙激活氯离子通道蛋白1(ANO1)的Piezo1调节剂高通量筛选模型。方法RT-PCR和Western印迹法分别检测Fischer大鼠甲状腺上皮(FRT)细胞Piezo1 mRNA和蛋白表达。构建共表达增强型绿色荧光蛋白标记的ANO1(ANO1-EGFP)和黄色荧光蛋白双突变体(YFP-H148Q/I152L)的FRT细胞株(简称FRT模型细胞),倒置荧光显微镜检测ANO1-EGFP和YFP-H148Q/I152L在FRT模型细胞中的表达,加入ANO1激活剂离子霉素10μmol·L^-1,应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值。加入Piezo1调节剂Jedi1(200μmol·L^-1),Jedi2(150μmol·L^-1),Yoda1(20μmol·L^-1)和Gd3+(20μmol·L^-1),应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值。加入Piezo1激活剂Jedi1,Jedi2和Yoda1,按0.2,1,5,10,25,50,75,100,200,300,400,500,600,700,800,900和1000μmol·L^-1设置浓度梯度,应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值并绘制浓度依赖曲线。向FRT细胞中加入Yoda1,按同样的方法设置浓度梯度,通过Fura-2/AM荧光探针检测细胞内的钙信号随Yoda1浓度的变化,分析细胞内Ca^2+浓度与FRT模型细胞相对荧光强度变化值之间的关系。计算模型Z′因子及信噪比。结果RT-PCR、DNA测序比对和Western印迹结果表明,FRT细胞内源性表达Piezo1。ANO1-EGFP和YFP-H148Q/I152L表达清晰,位置正确,并且ANO1-EGFP被离子霉素激活后模型荧光淬灭,证实转染基因表达的蛋白具有生物学活性,FRT模型细胞构建成功。FRT模型细胞加入Jedi1,Jedi2和Yoda1荧光均淬灭,加入Gd3+后再加入Yoda1荧光不淬灭,证实模型可以用于筛选Piezo1通道调节剂;在FRT模型细胞中离子霉素的EC50为(7.76±0.53)μmol·L^-1,Yoda1的EC50为(17.27±1.21)μmol·L^-1,Jedi1的EC50为(200.60±4.46)μmol·L^-1,Jedi2的EC50为(158.10±4.65)μmol·L^-1。FRT模型细胞相对荧光强度变化值与细胞内Ca^2+浓度呈正相关,模型能敏感地反应细胞内钙信号变化。模型Z′因子为0.82,信噪比为13.29∶1,可用于Piezo1通道调节剂高通量筛选。结论成功构建了可快速、准确、便捷筛选Piezo1通道激活剂和抑制剂的高通量筛选模型。

钙激活性氯离子通道抑制剂对肺动脉平滑肌作用的研究进展

1肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的钙激活性氯离子通道（CaCCs）与跨膜蛋白16A（TMEM16A）肺血管张力维持需要CaCCs参与。人们对不同组织（包括肺动脉）中平滑肌细胞上CaCCs进行了广泛研究,发现其通道活性在维持肺血管张力中起着重要作用[1-2]。CaCCs如何参与平滑肌细胞收缩,现有2种假设机制[3-4]：（1）＂ryanodine受体（RyR）通道＂机制。

钙激活的氯离子通道蛋白A在肿瘤形成中作用的研究进展

钙激活的氯离子通道蛋白A(TMEM16A)是钙激活氯离子通道的基本分子构成,其在肿瘤形成中的作用越来越受到关注。TMEM16A的过表达与许多肿瘤的不良预后密切相关。在肿瘤诊断方面,TMEM16A被认为是高效的生物标记物。最近研究表明,TMEM16A是通过在离子通道中的作用促进肿瘤形成。随着研究不断进展,TMEM16A将来有可能成为癌症诊疗的有效靶点。

钙激活氯通道ANO1在小鼠心肌细胞的表达及其功能鉴定

目的:探讨钙激活氯通道蛋白anoctamin 1(ANO1)在小鼠原代培养心肌细胞中的表达及其功能特性。方法:采用胰酶与胶原酶共同消化,联合2次差速贴壁法获得C57BL/6小鼠原代心肌细胞;并用免疫荧光染色法检测α-横纹肌肌动蛋白,以鉴定心肌细胞纯度;应用RT-PCR检测小鼠心肌细胞ANO1 mRNA的表达;免疫印迹检测ANO1蛋白在小鼠心肌细胞的表达情况;应用荧光淬灭动力学实验检测ANO1钙激活氯通道的功能特性。结果:RT-PCR结果表明原代培养的小鼠心肌细胞表达ANO1 mRNA。免疫印迹实验结果显示原代培养的小鼠心肌细胞表达ANO1蛋白。荧光淬灭动力学实验证实表达于小鼠心肌细胞的ANO1具有钙激活氯通道典型的阴离子转运功能特性。结论:ANO1在小鼠心肌细胞中有明确表达,并具有钙激活氯离子通道特性,提示ANO1是钙激活氯通道的分子基础。

钙激活氯通道蛋白ANO1在小鼠主动脉平滑肌细胞的表达及其功能鉴定

探讨钙激活氯通道蛋白ANO1在C57BL/6小鼠主动脉平滑肌细胞中的表达及其功能特性。运用胶原酶消化法获得原代培养的小鼠主动脉平滑肌细胞,流式细胞术检测平滑肌细胞纯度;应用RT-PCR检测主动脉平滑肌细胞ANO1 mRNA的表达;免疫印迹检测ANO1蛋白在主动脉平滑肌细胞的表达情况;应用荧光淬灭动力学实验检测ANO1钙激活氯通道的功能特性。原代培养成功获得主动脉平滑肌细胞;RT-PCR结果分析表明,主动脉平滑肌细胞在mRNA水平有ANO1表达;免疫印迹显示主动脉平滑肌细胞蛋白水平有ANO1表达;荧光淬灭动力学实验证实表达在主动脉平滑肌细胞的ANO1具有阴离子转运功能,即钙激活氯通道典型特性。小鼠主动脉平滑肌细胞表达的ANO1是钙激活氯通道的分子基础。

氯离子通道蛋白1在心肌纤维化进程中的表达特征

目的探讨氯离子通道蛋白1(ANO1)在心肌纤维化进程中的表达特征,为抑制心肌纤维化寻找新的靶点。方法采用冠状动脉结扎法制作大鼠心肌梗死模型,1周后取心肌梗死组和假手术组大鼠左心室组织,采用免疫组织化学染色、免疫荧光双标记检测梗死区和正常组织ANO1表达的变化;体外分离培养心肌成纤维细胞,采用免疫荧光标记、Real-time PCR和Western blotting检测心肌成纤维细胞中ANO1表达情况。结果制造模型1周后心肌梗死区ANO1表达明显增强,并与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)共表达; ANO1蛋白明显表达于心肌成纤维细胞的核膜和胞质中,且表达强度和α-SMA具有相同的趋势;与刚分离贴壁心肌纤维细胞相比,ANO1在培养和48h后的心肌成纤维细胞中表达量明显增强。结论 ANO1在心肌成纤维细胞转化为成肌纤维细胞过程中表达量增加,提示ANO1可能在心肌纤维化进程中发挥重要调控作用。

钙激活性氯离子通道在低氧性肺血管双相收缩反应中的作用

本文旨在探讨钙激活性氯离子通道(ClCa)在二级肺动脉血管低氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction,HPV)中的作用。分离Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠二级肺动脉血管,采用离体血管灌流法记录血管环张力变化。结果显示,常氧条件下,ClCa抑制剂尼氟灭酸(10和50μmol/L)和IAA-94(10μmol/L)使去甲肾上腺素收缩的二级肺动脉环血管产生明显的舒张反应(P<0.01),但对KCl收缩的二级肺动脉环血管并无影响。低氧条件下1 h内,去甲肾上腺素预收缩的二级肺动脉血管环出现双相性HPV反应,KCl预收缩的血管环无双相性收缩反应。尼氟灭酸和IAA-9明显减弱II期收缩反应(均P<0.01),对I期舒张反应也有显著减弱作用(均P<0.01),但对I期收缩几乎无影响。以上结果提示,ClCa是二级肺动脉血管双相性收缩反应II期收缩形成的一个重要因素,而在I期收缩中无明显作用。

钙激活性氯离子通道在大鼠低氧高二氧化碳性PASMCs中的表达及与MAPK通路的关系

采用酶消化法取雄性SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)进行原代培养,采用小鼠抗大鼠SMα-actin免疫荧光细胞化学法进行细胞鉴定;复制低氧高二氧化碳模型,采用免疫印迹法检测钙激活性氯离子通道(calcium activated chloride channel,CLCA2)蛋白的表达;采用半定量逆转录–聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定CLCA2 mRNA水平的表达。结果显示:与正常组比较,低氧高二氧化碳组PASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白表达水平均明显上调(P<0.01);与低氧高二氧化碳组比较,U0126组和SB203580组PASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白表达水平均明显上调(P<0.01);茴香霉素(Anisomycin)组PASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白表达水平均显著下调(P<0.05和P<0.01)。研究表明,低氧高二氧化碳可上调大鼠PASMC中CLCA2 mRNA和蛋白的表达;ERK1/2通路抑制剂(U0126)、P38MAPK通路抑制剂(SB203580)均可上调PASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白的表达;MAPK通路激活剂(Anisomycin)能下调PASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白的表达。

钙激活性氯离子通道的电生理研究

目的:研究大鼠肺动脉平滑肌细胞上钙激活性氯离子通道的电流、电压电流关系等电生理特性。方法:采用急性酶分离法(胶原酶Ⅰ型和木瓜蛋白酶)分离出单个肺动脉平滑肌细胞,应用膜片钳技术,测定各组大鼠肺动脉平滑肌细胞上钙激活性氯离子通道电流和电压电流。结果:急性酶分离法能成功分离出适用于膜片钳记录的单个大鼠肺动脉平滑肌细胞,并测到稳定的钙激活性氯离子通道电流,该电流表现出时间、电压及钙离子依赖性,并呈外向整流特征。结论:大鼠肺动脉平滑肌细胞的钙激活氯离子通道具有时间依赖性、钙离子依赖性和电压依赖性,并具有外向整流特征。

血小板与钙离子信号的研究进展

激动剂诱导细胞内钙离子浓度升高是血小板活化止血和血栓形成的必要条件,它是通过细胞内钙离子释放和质膜内钙离子进入而发生的。Ca2+库释放是一种行之有效的过程,首先磷脂酶(PL)C产生肌醇-1,4,5-三磷酸肌醇(IP3),进而通过IP3通道受体释放细胞内储存的Ca2+,从而完成Ca2+释放。在血小板活化过程中钙离子浓度明显升高有助于活化的各个步骤。钙离子作为细胞的第二信使,参与大多数的生物活动过程,尤其在细胞内钙池引发的钙离子的进入(store-operated Ca2+entry,SOCE)在血小板激活过程中发挥着重要的作用。血小板在血管内激活极易引起血栓,因此研究血小板活化机理可能会对某些疾病的治疗起到关键作用。

尼氟灭酸抑制跨膜蛋白16A参与高肺血流量诱导的肺动脉高压的机制研究

目的:探讨钙激活的氯离子通道(CaCCs)抑制剂尼氟灭酸(NFA)和跨膜蛋白16A(TMEM16A)在高肺血流量诱导的肺动脉高压(PAH)中的作用及机制。方法:将40只SD大鼠随机分为normal组、sham组、model组及model+NFA组,sham组使用血管夹夹闭腹主动脉15 min,model组采用腹主动脉—下腔静脉造瘘术建立左向右分流型PAH模型,model+NFA组在造瘘术后予NFA进行每日灌胃;饲养12周后,检测大鼠平均肺动脉压、肺动脉血管张力,并采用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法(western blotting)检测各组肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)TMEM16A的表达。结果:model组和model+NFA组大鼠肺动脉环收缩率及TMEM16A m RNA和蛋白表达水平显著高于normal组(P<0.05)。与model组比较,model+NFA组大鼠TMEM16A mRNA和蛋白表达水平降低,肺动脉环收缩率下降(P<0.05)。结论:高肺血流量诱导的PAH与TMEM16A高表达有关,NFA可以降低肺动脉血管张力,抑制TMEM16A的过表达。

钙激活氯离子通道在嗅觉细胞中发挥作用

钙激活氯离子通道无处不在地耦合胞内 Ca 2+ 信号,以改变细胞的极化。现有的生理学证据表明,Ca 2+ 激活的 Cl? 通道 (cacs) 在味觉细胞中发挥作用。因为 Ano1 和 Ano2 编码在多种细胞中形成 cacc 的通道蛋白,通过分析它们在小鼠味觉细胞中的表达。检测了 Ano1 和 Ano2 在环壁乳突 (CV) 中的转录本,并用免疫组化方法证实了它们在味觉细胞中的表达。当用 CsCl 透析时,III 型味觉细胞没有显示依赖于胞质 Ca 2+ 的离子电流。在 II 型细胞中,TRPM5 介导的大的 Ca 2+ 门控电流是由 Ca 2+ 解除衰老引起的。当 TRPM5 被三苯基膦氧化物 (TPPO) 抑制时,离子霉素刺激了一个小但可分辨的内向电流,并被阴离子通道阻断剂 ( 包括 T16Ainh-A01?(T16),一种特定的 Ano1 拮抗剂 ) 所消除。这表明,包括 ano1 样通道在内的 cacc 在 II 型细胞中发挥作用。虽然TRPM5 在味觉转导中的作用已经确定,但 II 型细胞中 cacc 表达的生理意义仍有待阐明。

电针“内关”穴对急性心肌缺血小鼠心肌组织氯离子通道蛋白表达的影响

目的:观察电针"内关"穴对急性心肌缺血小鼠心肌CLC-2氯离子通道[chloride channel-2,CLC-2]、钙激活的氯离子通道(calcium-activated chloride channel accessory,CLCA)蛋白表达的影响,探讨针刺抗心肌缺血的可能作用机制。方法:30只基因敲除ASIC 3-/-小鼠随机分为空白组、模型组、内关组、列缺组、非经非穴组。采用多点皮下注射异丙肾上腺素制备急性心肌缺血模型。内关组电针双侧"内关"穴,列缺组电针双侧"列缺"穴,非经非穴组电针"天枢"穴与"神阙"穴连线中点,每天治疗1次,共治疗7d。造模前后记录Ⅱ导联心电图ST段电压幅值,HE染色观察小鼠心肌组织病理变化,比色法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性,Western blot法检测心肌组织CLC-2、CLCA蛋白表达。结果:造模后各组小鼠Ⅱ导联心电图ST段明显抬高,与造模前比较差异具有统计学意义(P<0.05)。HE染色结果显示,模型组、列缺组、非经非穴组与空白组比较有不同程度的心肌细胞缺血区;与模型组比较,内关组有明显改善。与空白组比较,模型组小鼠血清SOD活性明显下降(P<0.01);与模型组比较,内关组可明显抑制SOD的下降(P<0.01)。与空白组比较,模型组CLC-2、CLCA蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,内关组CLC-2、CLCA蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论:针刺"内关"穴可显著降低急性心肌缺血小鼠心肌组织CLC-2、CLCA蛋白表达水平,可能是针刺治疗小鼠急性心肌缺血的作用机制之一。

TMEM 16A在胃腺癌中的表达及意义

目的探讨Ca2+激活的氯离子通道(CaCC)蛋白TMEM16A在胃癌中的表达和意义。方法收集72例胃癌标本,采用免疫组织化学SP法检测TMEM16A的表达,以癌旁胃粘膜组织和非肿瘤胃粘膜组织作为对照,胃间质瘤组织作为阳性对照。结果TMEM16A表达于胃癌细胞胞膜和胞质内,在72例胃癌中TMEM16A呈不同程度阳性表达,在胃癌组织中TMEM16A表达的总阳性率("阳性"和"强阳性")为80.56%(58/72);而在相应的癌旁组织中TMEM16A表达的总阳性率("阳性"和"强阳性")仅为4.17%(3/72),两者之间差异显著(P<0.005)。结论 TMEM16A高表达于胃癌组织,可作为胃癌的分子诊断和靶向治疗的一个新的候选靶点。

TMEM16A在结肠癌组织中的表达及其意义

目的:探讨Ca2+激活的氯离子通道(Ca2+-activated Cl-channels,CaCC)蛋白TMEM16A在结肠癌中的表达和意义.方法:收集67例结肠癌标本,采用免疫组织化学SP法检测TMEM16A的表达,以癌旁结肠黏膜组织和6例结肠腺瘤组织作为对照,1例胃间质瘤组织作为阳性对照.结果:TMEM16A表达于结肠癌细胞胞膜和胞质内,在67例结肠癌中TMEM16A呈不同程度阳性表达,其中阴性占5.97%(4/67)、弱阳性占16.42%(11/67)、阳性占29.85%(20/67)、强阳性占47.76%(32/67);在癌旁结肠黏膜腺体内大多呈阴性和弱阳性表达,其中阴性占40.30%(27/67)、弱阳性占52.24%(35/67)、阳性占4.48%(3/67)、强阳性占2.99%(2/67);在6例结肠腺瘤中均呈阳性表达.将阴性和弱阳性表达分为阴性组,将阳性和强阳性表达分为阳性组进行分析,在67例结肠癌中TMEM16A表达的总阳性率("阳性"和"强阳性")占77.61%(52/67),而在相应的癌旁组织中TMEM16A表达的总阳性率("阳性"和"强阳性")仅占7.46%(5/67),两者之间差异显著(P<0.005).结论:TMEM16A可高表达于结肠癌组织,可作为结肠癌的分子诊断和靶向治疗的一个新的候选靶点.